CC BY
8Ученые записки Таврического национального университета им. В. И. Вернадского Серия «Биология, химия». Том 25 (64). 2012. № 1. С. 67-74.
УДК 612.014.46:612.821:615.214:547.78
ВЛИЯНИЕ 1,5-БЕНЗОДИАЗЕПИНОНА-2 И ЕГО ПРОИ3ВОДНОГО 3-ФОРМИЛ-1,5-БЕНЗОДИАЗЕПИНОНА-2 НА ЭЛЕКТРИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ НЕЙРОНОВ МОЛЮСКА HELIX ALBESCENS ROSSM
Епишкин И.В., Коренюк И.И., Гамма Т.В.
Таврический национальный университет им. В.И. Вернадского, Симферополь, Украина
E-mail: epishkn@rambler.ru
Исследовано влияние 1,5-бензодиазепинона-2 и одного его производного (3-формил-1,5-бензодиазепинона-2) на внутриклеточно отводимые потенциалы нейронов Helix albescens Rossm. Установлено, что эти соединения у всех исследованных нейронов однонаправленно и неселективно гиперполяризуют мембрану, снижают частоту генерации импульсов и своеобразно изменяют скорости трансмембранных ионных токов. Выраженность эффектов обоих соединений зависит от их концентрации, и у производного 3-формил-1,5-бензодиазепинона-2 она превосходит таковую 1,5-бензодиазепинона-2. В диапазоне концентраций 10"5-10"3 М эффекты данных соединений носят обратимый характер, а в концентрации 10"2 М у всех исследованных нейронов необратимо блокируются механизмы генерации потенциалов действия, однако сохраняется способность поддержания мембранного потенциала.
Ключевые слова: бензодиазепины, нейрон, электрическая активность.
ВВЕДЕНИЕ
Бензодиазепины относятся к так называемым малым транквилизаторам, которые отличаются высокой эффективностью, безопасностью, низкой токсичностью и широким спектром психофармакологического действия: анксиолитическим, противосудорожным, гипнотическим, миорелаксирующим, амнестическим и это соответствует разнообразным областям их клинического применения [1-4]. В настоящее время продолжается синтез новых производных из класса бензодиазепинов. Так синтезирован ряд производных 1,5-бензодиазепина, и среди них выявлены транквилизаторы [5, 6], анальгетики [7], седативные препараты [8], противомикробные [9], противоопухолевые [10], антидиабетические средства [11]. Следует отметить, что на кафедре органической химии ТНУ им. В.И. Вернадского в последнее время также получены несколько новых производных 1,5-бензодиазепинона-2, требующие исследования их биологической активности. В связи с этим, целью данной работы явилось выяснение наличия, направленности и характера нейротропного действия разных концентраций 1,5-бензодиазепинона-2 (1,5-БД) и его производного 3-формил-1,5-бензодиазепинона-2 (3-формил-1,5-БД).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследование нейротропной активности 1,5-БД и 3-формил-1,5-БД в концентрациях 10-5, 10-4, 10-3 и 10-2 М проведено с помощью методики внутриклеточного отведения биопотенциалов и последующего электрического дифференцирования потенциалов действия (ПД) у идентифицированных и неидентифицированных нейронов правого париетального (ППаГ, n = 36) и висцерального ганглиев (ВГ, n = 41) Helix albescens Rossm. Более подробно методика описана ранее [12]. Нейроны идентифицировали по морфологическим и электрофизиологическим критериям [13, 14]. Регистрацию и обработку потенциалов выполняли с помощью компьютерной программы [15]. Схема эксперимента была следующей: вначале регистрировали (1 мин) фоновую активность нейрона (контроль), затем - в течение 5 мин экспозиции тестируемых веществ и, в случае наличия активности, производили запись (1-2 мин) после 20-30 мин отмывания. Анализу подвергали усредненные значения: мембранного потенциала (МП), амплитуды и времени развития ПД, частоты их генерации (ЧГИ), а также амплитудно-временные показатели гиперполяризации. Полученные данные обработаны статистически с использованием непараметрического критерия Вилкоксона.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Обнаружено, что оба тестированных вещества обладают угнетающими нейротропными эффектами, которые начинают проявляться при концентрации 10-5 М (порог).
Эффекты 1,5-БД. При экспозиции 1,5-БД в концентрации 10-4 М у всех исследованых нейронов ППаГ и ВГ, то есть неселективно, наблюдалось увеличение на 3-5 мВ МП и снижение частоты следования ПД и их амплитуды. Типичный пример такой реакции представлен на рис. 1, А. Так, если в фоне амплитуда ПД составляла в среднем 65,8 ± 2,0 мВ, то при экспозиции соединения она снижалась до 55,5 ± 0,7 мВ (Р = 0,01). При этом снижалось и время развития ПД (см. табл. 1). После отмывания вещества исследуемые показатели электрической активности нейронов возвращались к фоновым. При концентрации 1,5-БД 10-3 М на фоне незначительных флуктуаций МП частота следования ПД и их амплитуда достоверно снижались (рис.1, Б; табл. 1). После отмывания вещества МП и импульсная активность нейронов также восстанавливались до уровня фона. Реакция нейронов на приложение 1,5-БД в концентрации 10-2 М выражалась в том, что в течение первых 40 с на фоне начальной гиперполяризации (4,3 ± 1,1мВ) внезапно увеличивалась возбудимость нейронов, о чем свидетельствует повышение в 2-3 раза ЧГИ (см. рис. 1, В, В'). Затем возникал повторной скачок МП в сторону гиперполяризации (на 11,8 ± 2,2 мВ, Р < 0,05) и происходила в начале частичная и далее полная редукция ПД. В последующие 150-250 с экспозиции наблюдалась медленное уменьшение гиперполяризации, однако уровень МП не возвращался к исходному. После отмывания МП постепенно возвращался к исходному уровню (—50...-60 мВ), однако импульсная активность нейронов не возобновлялась.
Анализ скоростей суммарных входящих и выходящих ионных токов показал, что при экспозиции 1,5-БД в концентрациях 10-4 и 10-3 М происходит, в первую очередь, снижение скорости нарастания выходящих ионных токов, а при концентрации 10-2 М в равной степени угнетаются как входящие, так и выходящие ионные токи (табл. 1).
А
~~1-1—
50 100
Б
—I-
150
-1—
250
В
-1—
150
—I— 200
—I-
250
-20
-1—
20
В'
_
— 20
Рис. 1. Влияние 1,5-бензодиазепинона-2 на в концентрациях 10-4 (А), 10-3 (Б) и 10-2 М (В) на электрическую активность нейрона ППа1. На В' - подчеркнутый на В фрагмент. Стрелкой обозначен момент аппликации.
Таким образом, нами установлено, что 1,5-БД обладает нейротропным эффектом, причем его выраженность у каждого нейрона четко зависит от применяемой концентрации. Следует еще раз отметить, что при концентрации 10-2 М 1,5-БД наблюдалась глубокая гиперполяризация мембраны и полная редукция ПД (см. рис. 1). Следовательно, 1,5-БД в этой концентрации оказывал токсическое действие на электрогенез нейронов, но не летальное, поскольку при этом сохраняется МП. Мы полагаем, что 1,5-БД при такой концентрации прочно связывается с рецепторами мембраны нейронов и не подвергается метаболическим превращениям.
Таблица 1.
Влияние 1,5-БД на параметры потенциалов и скорость трансмембранных
ионных токов нейронов ППаГ
Концентрация вещества Амплитуда ПД, мВ Время развития ПД, мс Скорость ионных токов, В/с
входящих выходящих
Фон 65,8 ± 2,0 12,1 ± 1,0 13,4 ± 1,2 13,6 ± 1,2
10"4 М 55,5±0,7* 10,3 ± 0,4 14,2 ± 0,4 11,7 ± 0,3
10"3 М 43,4 ± 3,6** 8,8 ± 1,0 13,1 ± 0,8 10,6 ± 1,3*
10"2 М в течение первых 40 с 2,1± 0,6** 15,7 ± 1,8 Б 0,9± 0,2** 0,6±0,1**
Примечание: * - достоверность различий фоновых показателей от таковых при аппликации вещества, * - Р < 0,01; ** - при Р < 0,005.
Влияние 3-формил-1,5-БД. На рис. 2 показан типичный пример влияния 3-формил-1,5-БД в концентрациях 10-4, 10-3 и 10-2 М на электрическую активность неидентифицированного нейрона ВГ. В общем, характер реакции на приложение разных концентраций этого производного 1,5-БД был аналогичен базовому веществу.
Отличительной особенностью проявления нейротропного эффекта этого производного можно считать некоторую селективность и выраженность его действия на электрическую активность разных нейронов (см. рис. 2). Так у большинства (72 %) исследованных нейронов наблюдалось прекращение генерации ПД продолжительностью 20-25 с, а затем при неизменном уровне МП возобновлялась генерация полноценных ПД (см. рис. 2, А). В концентрации
10-3 М
эффекты 3-формил-1,5-БД сразу после аппликации выражались в несущественном увеличении уровня МП (на 5-7 мВ) и в 2-3-х кратном увеличении ЧГИ. После кратковременной вспышки импульсов наступала 20-25 секундная пауза с последующим внезапным возобновлением генерации полноценных ПД (см. рис. 2, Б). При экспозиции 3-формил-1,5-БД в концентрации 10-2 М время наступления тормозной паузы и ее продолжительность существенно уменьшились; появлялись редуцированные и «полноценные» ПД, которые в последующие 10-15 с экспозиции
полностью исчезали (см. рис. 2, В). После отмывания 1,5-БД в этой концентрации импульсная активность нейронов не восстанавливалась.
У другой части нейронов (28 %) реакция на приложение 3-формил-1,5-БД была схожей с описанной выше, однако у них не наблюдалось четкой тормозной паузы после момента аппликации.
При анализе трансмембранных ионных токов обнаружено, что при концентрации 10-4 М наблюдается только достоверное увеличение скорости нарастания входящих ионных токов (см. табл. 2). Не исключено, что именно этим может объясняться увеличение амплитуды ПД, которое обусловлено преимущественно вхождением и, возможно, Са2+ в клетку.
А
—г~ 100
—I—
—I—
100
—I— 330
Б
1
—г~
100
-Г"
130
—Г"
зоо
-Г"
го
шУ «с
шУ
-30
о
л
- ю
В
шУ -«
■и ■ о
м
ЩИ
Щц
Д. Шит
............
-Г" «
—Г-
—Г-
п
"Т"
м
—I—
Рис. 2 Эффекты 3-формил-1,5-БД в концентрациях 10-4, 10-3 и 10-2 М (А-В соответственно) на электрическую активность нейрона висцерального ганглия.
Стрелкой обозначен момент аппликации. Обращаем внимание, что на В скорость развертки на оригинальной нейрограмме увеличена.
Интересным феноменом явилось то, что 3-формил-1,5-БД в концентрации 10-3 М вызывает только несущественные изменения скорости входящих ионных токов, однако, снижение скорости выходящих ионных токов было довольно существенным (табл. 2). Не исключено, что именно этим можно объяснить снижения амплитуды и длительности ПД.
Количественная характеристика входящих и выходящих ионных токов, после приложением 3-формил-1,5-БД в концентрации 10-2 М, также указывает на его токсичность (см. табл. 2). Таким образом, из выше изложенных данных следует, что новое производное 1,5-БД обладает более выраженным угнетающим действием, чем само базовое вещество.
Таблица 2.
Влияние 3-формил- 1,5-БД на параметры электрической активности и скорость трансмембранных ионных токов нейронов висцерального ганглия
моллюска
Концентрация Амплитуда Время Скорость ионных токов, В/с
развития ПД, мс
вещества ПД, мВ входящих выходящих
Фон 46,5 ± 2,5 11,4 ± 1,1 12,3 ± 1,1 7,1 ± 0,5
10"4 М 54,1 ± 1,7* 11,6 ± 0,7 16,1±0,4* 7,3 ± 0,5
10"3 М 45,6 ± 2,7 10,3±1,0 12,6 ± 1,1 5,8 ± 0,4
10-2 М в течение первых 40 с 4,2 ± 0,5** 1,1± 0,2** 0,46 ± 0,1** 0,2±0,04**
Примечание: * - достоверность различий показателей при аппликации вещества от таковых в фоне Р<0,05; ** - при Р<0,005.
Сравнительный анализ реакций тестированных нейронов на приложение разных концентраций 1,5-БД и 3-формил-БД показал, что их эффекты имели схожую направленность, однако более выраженное угнетающее действие проявляет 3-формил-1,5-БД. Учитывая угнетающий характер действия этих веществ после приложения их на мембрану нейронов улитки, можно ожидать, что эти соединения при системном их введении смогут проявлять противосудорожные и/или психотропные свойства. В концентрациях 10-4 М оба вещества оказывают кратковременное активирующее действие на электрогенез нейронов за счет увеличения проводимости мембраны для ионов натрия. В концентрации 10-2 М наблюдается торможение входящих и выходящих ионных токов практически в равной степени. Исходя из этого, можно думать, что выявленное нейротропное действие у 1,5-БД и 3-формил 1,5-БД в концентрации 10-2 М при системном введении помимо судорожного может проявляться и как антидепрессантное, что может быть обусловлено взаимодействием этих бензодиазепинов с ГАМКа-рецепторным комплексом [16], и следовательно, активацией С1-каналов, что приводит к гиперполяризации нейронов. Очевидно, что тестированные вещества тормозят активность ГАМК-ергических нейронов, снижая, таким образом,
выделение в синаптическую щель количество медиатора и уменьшают уровень
депрессии у животных [17].
ВЫВОДЫ
1. Установлено, что 1,5-БД и 3-формил-1,5-БД в диапазоне концентраций 10-10"2 М обладают однонаправленным, неселектиным, тормозным нейротропным эффектом с большей выраженностью у нового производного - 3-формил-1,5-БД.
2. Данные соединения перспективны в дальнейшем изучении наличия, направленности и характерных особенностей психотропных и аналгетических эффектов.
Список литературы
1. Александровский Ю.А. Клиническая фармакология транквилизаторов / Александровский Ю.А. -МД. - 1973. - 334с.
2. Беляков В.А. Особенности анестезии у больных с сопутствующими нервно-психическими заболеваниями / В.А. Беляков // Анест. и реаниматол. - 1983. - № 3 - С.72-77.
3. Харкевич Д.А. Фармакология. / Харкевич Д.А. - М.: Медицина. - 1993. - 544с.
4. Мосолов С.Н. Основы психофармакотерапии. / Мосолов С.Н. - М., 1996. - 287с.
5. Влияние 3-метил-2,3,4,5-тетрагидро-1Н-1,5-бензодиазепин-2-она на поведенческиереакциикрыс / И.И. Коренюк, Т.В. Гамма, Т.М. Ладыгина [и др.] // Ученые записки ТНУ, сер. «биология, химия». - 2006. - Т. 19(58), №4 - С.121-126.
6. Clobazam in refractory childhood epilepsy / Kalra Veena, Seth Rachna, Mishra Devendra [et al.] // Indian Journal of Pediatrics. - 2010. - Vol. 77, № 3. - P. 263-266.
7. 1,5-benzodiazepines. Part XIII. Substituted 4H-[1,2,4]triazolo[4,3-a][1,5]benzodiazepin-5-amines and 4H-imidazo[1,2-a][1,5]benzodiazepin-5-amines as analgesic, anti-inflammatory and/or antipyretic agents with low acute toxicity / G. Grossi, M. Di Braccio, G. Roma [et al]. // Eur J Med Chem. - 2002. -№ 37(12). - P.933-944.
8. Synthesis and pharmacologic study of 1,5-benzodiazepine-2,4-dithiones and their alkyl derivatives / A. Zellou, Y. Cherrah, E.M. Essassi, [et al]. // Ann Pharm Fr. - 1998. - 56(4). - P.175-180.
9. Bhatia M.S. Multiple Linear Regression Study of 2,4-Disubstituted 1,5-Benzodiazepine as Potential Antiinfectives / M.S. Bhatia, P.B. Choudhari, K.B. Ingale // Iranian J. of Pharmaceutical Sciences. -2010. - 6(3). - P.199-208.
10. Yoshinaga K, Kawasaki D, Emori Y ANTITUMOR AGENT US Patent Application 20100086553, Appl. №:12/632182, Pub. Date: 04/08/2010, Fil. Date: 12/07/2009.
11. Yasuhiro Ohtake 2,3,4,5-tetrahydro-1H-1,5-benzodiazepine derivative and medicinal composition US Patent Appl. 20080076760, Appl. №: 11/718982, Pub. Date: 03/27/2008.
12. Эффекты воздействия бензимидазола и некоторых его производных на параметры электрических потенциалов нейронов моллюска Гамма Т.В., Коренюк И.И. Баевский М.Ю. [и др.] // Ученые записки ТНУ, серия «Биология, химия». - 2003. - Т. 16,(55) - С. 20-27.
13. Сахаров Д.А. Генеалогия нейронов. / Сахаров Д.А. - М.: Наука, 1974. - 184с.
14. Коренюк И.И. Нейротропные эффекты химических соединений различных классов и возможные механизмы их действия / Коренюк И.И. - Симферополь: ДИАИПИ, 2012 - 182 с.
15. А.с. № 11642 Украины, «Компьютерная программа для регистрации, обработки и автоматизированного анализа биоэлектрических сигналов "ActionPotential"» // А.А. Замотайлов, И.И. Коренюк. - 2004.
16. Nutt D.J. GABAA-receptors. Receptor Data for Biological Experiments: a Guide to Drugs Selectivity / D.J. Nutt // Ellis Horwood, London. - 1991. - P.225-229.
17. The GABAergic hypothesis of depression / Lloyd K.G., Zivkovic B., Scatton B. [et al.] // Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. - 1989. - Vol. 13.3.4. - P. 341-351.
€тшкш 1В. Вплив 2Д4,5-тетраriдро-Ш-1,5-бешодiазепшону-2 та 3-формш-2,3,4,5-тетрапдро-1Н-1,5-бензодiазепiнону-2 на електричну активнiсть нейронiв молюску Helix albescens rossm / 1.В. €тшюн, Ы Коренюк, Т.В. Гамма // B4eHi записки Таврiйського нацiонального унiверситету iM. В.1. Вернадського. Серiя „Бюлопя, хiмiя". - 2012. - Т. 25 (64), № 1. - С. 67-74. Доалджено вплив 1,5-бензодiазепiнона-2 та одного його похiдного (3-формiл-1,5-бензодiазепiнона-2) на потенщали нейронiв Helix albescens Rossm., яю вводили внутрiшньоклiтино. Встановлено, що цi речовини однонаправлено i неселективно гшерполяризують мембрану, зменшують частоту генерацн iмпульсiв i змiнюють швидюсть трансмембранних юнних струмiв. Виразнiсть ефекпв обох сполук залежить вiд 1х концентрацй i у похiдного 3-формил-1,5-бензодiазепинону-2 вона перевершуе таку 1,5-бензодiазепинону-2. В дiапазонi концентраций 10"5-10"3 М ефекти цих сполук мають зворотнiй характер, а в концентрацй 10-2 М у вих дослiджениx нейронiв незворотньо блокуються мехашзми генераци потенцiалiв дл, однак зберггаеться здiбнiсть тдтримки мембранного потенщалу. Kmwei слова: бензодiазепiн, нейрон, електрична активнiсть.
Epishkin I.V. Effect of 1,5-benzodiazepinon-2 and 3-formyl-1,5-benzodiazepinon-2 on electrical activity of neurons in mollusks Helix albescens rossm / I.V. Epishkin, I.I. Korenyuk, T.V. Gamma // Scientific Notes of Taurida V.I. Vernadsky National University. - Series: Biology, chemistry. - 2012. - Vol. 25 (64), No 1. - P. 67-74.
It is investigated an intracellular effect of 1,5-benzodiazepinone-2 and 3-formyl-1,5-benzodiazepinone-2 on the electric activity Helix albescens Rossm. neurons. It is established that the action these substances depend on their concentration and appears in hyperpolarization of the membrane, reducing a pulse frequency generation and ion currents changes. At a concentration of effects of these compounds are reversible, and the concentration of- irreversible. In the concentration range 10-5-10-3 M effects of these compounds are reversible, and concentration of 10-2 M in all investigated neurons irreversibly blocked the mechanisms generating action potentials, but retained ability to support membrane potential. Keywords: benzodiazepinone, neuron, electrical activity.
Поступила в редакцию 13.02.2012 г.
