CC BY
22
© Л. В. Галебская, И. Г. Щербак, 2012 г. УДК 612.398:92 Салазкин
Л. В. Галебская, И. Г. Щербак
ВКЛАД ПРОФЕССОРА С. С. САЛАЗКИНА В СТАНОВЛЕНИЕ И РАЗВИТИЕ БИОХИМИИ БЕЛКА
Кафедра биохимии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени академика И. П. Павлова
ВВЕДЕНИЕ
Белки, или «белковые тела» (исторический термин), составляют основу функционирования всех живых организмов. Эти молекулы отличаются значительным разнообразием своей структуры и способов взаимодействия друг с другом и прочими молекулами. При этом каждое взаимодействие сопровождается конформационными переходами, т. е. изменением пространственной организации белковой молекулы. Динамичность как свойство белковых тел, проявляется не только в конформационных переходах, но также в постоянном обновлении этих молекул. Разные белки значительно различаются по длительности своего существования в биологическом объекте. Время «жизни» некоторых белков измеряется секундами или минутами, других же - достигает нескольких дней, месяцев или даже лет. Интересно то, что процесс распада (катаболизма) белков вовлечен в выполнение организмом практически всех физиологических функций: от оплодотворения яйцеклетки до осуществления мыслительных процессов.
Еще одной особенностью белковых молекул является наличие в их составе значительного количества азота. Белки синтезируются из протеиногенных аминокислот, содержащих азот аминогрупп, а при катаболизме аминный азот включается в синтезируемую организмом мочевину и/или мочевую кислоту. При этом включение азота в конечные продукты катаболизма может происходить как после предварительного освобождения аммиака, так и путем переноса аминогруппы с аминокислот.
СЕРГЕЙ СЕРГЕЕВИЧ САЛАЗКИН: ИССЛЕДОВАНИЕ АЗОТИСТОГО ОБМЕНА
Изложенная выше современная концепция функционирования и метаболизма белка сформировалась при непосредственном участии Сергея Сергеевича Салазкина, основателя кафедры биохимии Женского медицинского института, выдающегося биохимика нашей страны.
Приступая к изучению азотистого обмена, С. С. Салазкин имел за плечами два высших образования. Естественно-научное образование он получил в Императорском Санкт-Петербургском университете, а медицинское -в Киевском университете св. Владимира. После получе-
Профессор С. С. Салазкин
ния звания лекаря С. С. Салазкин был оставлен ассистентом при кафедре физиологической химии (историческое название биохимии) Киевского университета. В 1986 г. он переехал в Санкт-Петербург и приступил к работе в первом в России научно-исследовательском медико-биологическом центре, а именно - Императорском Институте экспериментальной медицины (ИЭМ).
Руководитель химического отдела ИЭМ профессор Марцелий Вильгельмович Ненцкий [2] привлек молодого ученого С. С. Салазкина к исследованию проблемы обезвреживания аммиака. Одним из главных научных устремлений М. В. Ненцкого было изучение азотистого обмена. В частности, его интересовал вопрос о происхождении мочевины как главного из азотсодержащих продуктов обмена веществ. В те времена существовало мнение, что мочевина уже в готовом виде содержится в «белковых телах» пищи и освобождается при их распаде в организме. Эксперименты, которые М. В. Ненцкий и О. Шульцен поставили еще в 1869 г., показали, что скормленные собакам аминокислоты лейцин и гликоголл (историческое название глицина) превращаются в организме в мочевину, выводимую затем с мочой. Эти и другие результаты привели авторов к мысли о том, что предшественником мочевины является аммиак, образующийся при разрушении белков и аминокислот. Так возникла ангидридная теория образования мочевины в живом организме. Суть ее сводится к тому, что при метаболической деградации белков содержащийся в них аминоа-зот освобождается в виде аммиака, который нейтрализуется в реакции с углекислотой (тоже известным в то время конечным продуктом метаболизма). Возникающий углекислый аммоний содержит на два атома кислорода и четыре атома водорода больше, чем молекула мочевины. Поэтому вполне логичным представлялся вывод авторов о том, что углекислый аммоний может превращаться в мочевину, теряя сначала одну молекулу воды (с образованием карбаминовокислого аммония),
ОБЗОРЫ И ЛЕКЦИИ
а затем и другую (превращаясь тем самым в готовую мочевину).
Для подтверждения или опровержения ангидридной теории синтеза мочевины профессор М. В. Ненцкий предложил Сергею Сергеевичу Салазкину исследовать проблему превращения аммиака в мочевину и посоветовал провести для этого опыты на изолированной печени собак. Для этой цели Сергей Сергеевич Салазкин использовал аппарат (рис. 1), позволявший производить перфузию изолированной печени экспериментальных собак их же кровью с добавлением определенного количества аминокислот. Немногим более года понадобилось С. С. Салазкину, чтобы выполнить кропотливую и трудоемкую работу и представить ее результаты в виде диссертации на степень доктора медицины. Сергей Сергеевич защитил докторскую диссертацию [1] в Военно-медицинской академии в конце 1897 г. (рис. 2). Уже в ближайшие месяцы по материалам диссертации появились две обширные статьи в одном из ведущих биохимических журналов того времени - «Hoppe-Sayler's Zeitschrift fur physiologische Chemie» [8, 9].
Самым выдающимся достижением, отраженным в докторской диссертации, стало установление С. С. Са-лазкиным того факта, что печень млекопитающих способна синтезировать мочевину прямо из аминокислот, без промежуточного освобождения аммиака. Тем самым впервые была поколеблена «ангидридная» теория, кото-
рую разделяли, пожалуй, все авторитетные ученые той поры. Постепенно новый взгляд не только получал разнообразные подтверждения, но и стимулировал многих исследователей на разработку вопроса о том, каким именно образом участвует в биогенезе мочевины каждая из известных (и вновь открываемых) аминокислот.
Но лишь через 35 лет после пионерских исследований С. С. Салазкина удалось установить, что биосинтез мочевины осуществляется путем циклического процесса, в который вовлекаются три аминокислоты (аспартат, аргинин, орнитин). Решающий вклад внесли немецкие исследователи Ганс Кребс и Курт Гензеляйт, опубликовав в 1932 г. представления, получившие название «орнити-новый цикл мочевинообразования». Впрочем, и это было не последней точкой в решении вопроса механизмов биосинтеза мочевины. Понадобились еще более трех десятилетий, чтобы открыть в митохондриях печени карбамо-илфосфат-синтетазу - фермент, который внедряет в орнитиновый цикл по молекуле аммиака и углекислоты, предварительно объединив их. Кроме того, было установлено, что второй атом азота в молекуле синтезируемой мочевины включается в орнитиновый цикл без промежуточного освобождения аммиака (и без затраты энергии). Происходит это путем прямого переноса аминогруппы с почти любой аминокислоты на «заготовку» будущей мочевины в одном из звеньев орнитинового цикла (реакция трансдезаминирования).
Рис. 1. Устройство для проведения экспериментов с перфузией кровью изолированной печени экспериментальных животных
Интересно отметить тот факт, что в более поздний период своей научной деятельности (1930-1931 гг.), будучи профессором, заведующим кафедрой биохимии 1 Ленинградского медицинского института, С. С. Салаз-кин заинтересовался исследованием недавно открытой аргиназы - фермента, который непосредственно освобождает мочевину из аргинина в ходе орнитинового цикла [7, 10, 11]. Прозорливость ученого становится очевидной, если учесть, что открытие этого цикла Г. Кребсом и К. Гензеляйтом еще не было опубликовано. Таким образом, оригинальные данные С. С. Салазкина и его учеников оказались в определенном смысле опережающими, ибо раскрывали некоторые свойства аргиназы, в том числе ее чувствительность к ряду факторов среды (включая воздействие кислорода, углекислоты, цистеина, солей тяжелых металлов).
Внимание Сергея Сергеевича было обращено на еще один продукт азотистого обмена, а именно - мочевую кислоту. В 1901 г. им совместно с сотрудницей Екатериной Федоровной Ковалевской было показано, что мочевая кислота может синтезироваться в изолированной печени гусей из аргинина или молочнокислого аммония, добавляемых к перфузируемой крови [12]. Для этих целей также использовался аппарат, показанный на рис. 1. По свидетельству ученика и сотрудника С. С. Салазкина Леонида Тихоновича Соловьева, известнейший английский биохимик Ф. Г. Гопкинс 30 лет спустя сообщал
Рис. 2. Титульный лист диссертации на степень доктора медицины Сергея Сергеевича Салазкина
в письме к С. С. Салазкину, что этот классический опыт ежегодно демонстрируется в его лаборатории на лекциях для студентов.
УЧЕНИЕ О ФЕРМЕНТАХ И ПРОТЕОЛИЗЕ В ТРУДАХ С. С. САЛАЗКИНА
Будучи одним из созидателей биологической химии, С. С. Салазкин стремился не только добывать новые факты, но и глубоко их осмысливать. Именно этим, надо полагать, объясняется обращение ученого к ферментам. Ведь если простую дегидратацию углекислого аммония до мочевины еще можно было рассматривать как спонтанный химический процесс, то образование мочевины прямо из аминокислот требовало аргументации. Это соображение, по-видимому, и стимулировало интерес Сергея Сергеевича к ферментам. Во всяком случае, уже в 1902 г. он опубликовал первую из своих работ в этой области [3]. С позиций сегодняшнего дня, бросается в глаза крайняя ограниченность и экспериментальных возможностей и общего уровня научных познаний того времени. Об активности протеолитических ферментов судили по нарастанию концентрации свободных амино- и карбоксильных групп. Первая из работ С. С. Салазкина, посвященных ферментам, была реакцией на только что опубликованную статью О. Конгейма, который обнаружил в экстрактах слизистой оболочки кишки протеолитиче-скую активность, названную им новым ферментом -эрепсином. Используя возможность получения в лаборатории И. П. Павлова естественных пищеварительных соков, Сергей Сергеевич показал, что активность эрепси-на выявляется и в чистом кишечном соке. Примечательно, что автор не утверждает, что протеолитическая активность присуща только кишечному соку. Более того, он подчеркивает, что протеолитическое действие кишечного сока была значительно слабее, чем испытанных О. Кон-геймом экстрактов из слизистой оболочки. Такую скрупулезность в оценке полученных результатов стало воз-можым оценить в полной мере лишь спустя многие десятилетия, когда окончательно было установлено, что переваривание белков пищи осуществляется все-таки не внутриклеточно (как можно было подумать на основе опытов О. Конгейма), а ферментами пищеварительных соков. А более слабая активность ферментов кишечного сока (по сравнению с экстрактами из слизистой кишки) получила не только свое подтверждение, но и полное объяснение только в результате открытия А. М. Уголе-вым эффекта пристеночного пищеварения.
Помимо экспериментальной работы, Сергей Сергеевич большое внимание уделял анализу биохимической литературы и в своих обзорах [5, 6] не только давал критическую оценку результатам исследований разных авторов, но и наметил пути дальнейшего развития биохимии белка. В обзоре [5] он дал четкое понятие об абсолютной, относительной и стереоспецифичности ферментов. Из всего разнообразия мнений о природе ферментов он остановился на совершенно правильной гипотезе, подтвержденной в последующие годы. У него не возникало сомне-
ОРИГИНАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
ний в том, что ферменты, и в частности протеиназы, являются белками. Объяснение стереоспецифичности ферментов он нашел в асимметрии структуры катализатора, что полностью соответствует действительности. По вопросу о классификации протеиназ Сергей Сергеевич писал: «Рациональное деление протеиназ должно было бы основываться на знании и сравнении тех особых структурных группировок, на которые распространяется их действие». Вместе с тем, как он справедливо заметил, что «в отношении их действия нужно указать, что связи, ими разрушаемые, неизвестны, а продукты, являющиеся результатом их ферментативной реакции, мало изучены». За время, прошедшее со времени написания статьи, субстратная специфичность большого количества протеиназ была установлена. Однако проблему субстратной специфичности проте-олитических ферментов можно считать далекой от полного разрешения даже в начале XXI в. В трактовке данных литературы о регистрации протеолиза по регистрации нарастания свободных амино- и карбоксильных групп угадывается мнение автора о механизме ферментативного катализа, заключающемся в промежуточном ацилировании активного центра протеиназы.
Гениальным предвидением Сергея Сергеевича Салаз-кина было предположение о возможности применения протеиназ и неферментативных катализаторов протеолиза для установления первичной структуры белков. В обзоре «Значение белковых ферментов для изучения структуры белков» [6] он писал: «Самым трудным для решения вопроса в отношении строения белка является вопрос о порядке чередования отдельных строительных камней и взаимного их расположения». Далее он писал о том, что для решения этой задачи «нужно искать новые пути». Предлагаемый Сергеем Сергеевичем путь заключается в анализе фрагментов белка, полученных путем его обработки последовательно несколькими протеиназами. В период написания обзора уже была информация о продуктах расщепления казеина и клупеина под действием трипсина, эрепсина (смесь панкреатических и кишечных пептидаз) и папаина. Из анализа этих данных были сделаны выводы о преобладании определенных аминокислот в некоторых участках исследованных белковых молекул. В последующие годы предложенный метод нашел широкое применение и дал значительную информацию о химическом строении многочисленных белков. В настоящее время способ определения первичной структуры белка автоматизирован, но до сих пор подготовительный этап секвенирования белков включает его обработку трипсином и/или папаином! Эти ферменты нашли широкое применение в изучении доменной структуры белков.
В годы активной научной деятельности профессора С. С. Салазкина протеолитические ферменты связывали только с явлениями переваривания пищевого белка и ауто-лиза тканей. Такое представление сохранялось до середины XX в. Впоследствии оказалось, что протеиназы участвуют также в таких биологически важных процессах, как посттрансляционная модификация белка, оплодотворение, образование биологически активных веществ, функционирование иммунной системы, свертывание крови, фибринолиз. А в основе функционирования протеиназ лежат как раз особенности их субстратной специфичности, вопросы, так волновавшие профессора С. С. Салазкина.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Научная деятельность профессора Сергея Сергеевича Салазкина проходила в сложные исторические периоды: революции (1905, 1917 гг.), войны (Первая мировая, Гражданская), послевоенной разрухи. Даже в относительно спокойное время его исследовательская работа прерывалась в связи с бурной общественной деятельностью. Сергей Сергеевич участвовал в работе народовольческих кружков, был членом Временного Правительства, дважды находился в заточении в Петропавловской крепости, не раз подвергался ссылкам. Несмотря на сравнительно недолгий период активной научной деятельности, С. С. Салазкин оставил заметный след в истории становления и развития биологической химии. Его имя и весомые научные заслуги даже многие десятилетия спустя упоминаются в энциклопедиях, монографиях, учебниках. Научные идеи профессора С. С. Салазкина находят подтверждение и развитие в современной биохимии.
ЛИТЕРАТУРА
1. Вопросы медицинской химии. 1949. Т. 1. № 1-2. С. 347-351.
2. Врач. 1901. № 44. С. 1349-1352.
3. Русский архив патологии, клинической медицины и бактериологии. 1902. Т. XIV. С. 791-795.
4. Салазкин С. С. К вопросу о роли печени в образовании мочевины у млекопитающих животных: дис. ... д-ра мед. наук. 1897. 130 с.
5. Успехи биологической химии. 1927. № 5. С. 114—139.
6. Успехи биологической химии. 1927. № 5. С. 140-155.
7. Salazkin S. S. Biochemische Zeitschrift. 1932. Vol. 205.
8. Salazkin S. S. Hoppe-Sayler's Zeitschrift fur physiologische // Chemie. 1897. Vol. 25. P. 128-151.
9. Salazkin S. S. Hoppe-Sayler's Zeitschrift fur physiologische // Chemie. 1897. Vol. 25. P. 449-491.
10. Salazkin S. S. Hoppe-Sayler's Zeitschrift fur physiologische / / Chemie. 1930. Vol. 192.
11. Salazkin S. S. Hoppe-Sayler's Zeitschrift fur physiologische / / Chemie. 1931. Vol. 200.
12. Salazkin S. S., Kovalevskaya E. F. Hoppe-Sayler's Zeitschrift fur physiologische // Chemie. 1901. Vol. 33.
