CC BY
85Фізика живого, Т. 1S, No 3, 2010. C.36-3S.
© Скалка В.В., Савчук О.М., Остапченко Л.!.
РІі.уяіоч oHlic Alhc
П » n.|M.M>U‘ll(4>44‘lltrr.net
УДК 277.3
ВИЗНАЧЕННЯ РІЗНИХ ФОРМ КАЗЕЇНУ У МОЛОЦІ МЕТОДОМ ДИСК-ЕЛЕКТРОФОРЕЗУ
Скалка В.В., Савчук О.М., Остапченко Л.І.
ННЦ «Інститут біології» Київського національного університету імені Тараса Шевченка, Київ, Україна
е-таії:оїехіу. savchuk@yahoo. сот
Надійшла до редакції 10.03.2010
Стаття присвячена дослідженню к-казеїну, який разом з іншими типами казеїнів відіграє значну роль в формуванні фізико-хімічних характеристик молока, виконуючи стабілізуючу функцію при утворенні та існуванні казеїнових міцел молока. Також к-казеїн представляє собою досить цінний біотехнологічний продукт, його кількість в вихідному молоці слугує характеристикою якості даного виду сировини. Нами було показано, що к-казеїн в молоці знаходиться в складі тетрамерного комплексу з молекулярною масою 68 кДа. Розроблено методичні підходи, які дозволяють кількісно і якісно визначати к-казеїн в молоці.
Ключові слова: к-казеїн, електрофоретичні дослідження, тестування молочної продукції.
ВСТУП
Білок-білкові взаємодії - це процеси які визначаються особливостями структури і конфор-маційного стану протеїну в певний момент за даних умов. Саме ці взаємодії можуть змінювати функцію вихідних компонентів, надаючи новоутвореним комплексам інші характеристики. Яскравим прикладом такого процесу є взаємодія між молекулами казеїну в розчині молока.
За біохімічними властивостями саме к-казеїн є одним з найцінніших і найцікавіших білків. Особливу увагу к-казеїн привертає як об’єкт біотехнологічного використання. Коров’ячий к-казеїн - білок, який складається з 169 амінокислотних залишків, три з яких є фосфорильованими, 6 глікозильовані, що з’єднані з галактозою, К-ацетил-галактозоаміном та К-нейраміновою кислотою. Молекулярна маса поліпептидного ланцюга к-казеїну складає 19 кДа але в залежності від кількості глікозидних залишків може варіювати в досить широкому діапазоні. Завдяки наявності в структурі к-казеїну гідрофобної частини (пара-к-казеїн) та гідрофільної (глікомакропептид казеїну) він відіграє функцію стабілізатора казеїнових міцел і дає можливість казеїновим міцелам знаходитись в фазі розчину і не випадати в осад, крім того завдяки наявності фосфатних залишків к-казеїн також може зв’ язувати молекулярний кальцій. Наявність двох (С11, С88) залишків цистеїну, які входять до складу поліпептидного ланцюга, обумовлюють здатність молекули к-казеїну ковалентно взаємодіяти з цистеїн-вмісними білками такими як Р-лактоглобулін або полімеризуватись з іншими молекулами к-казеїну утворюючи при цьому ланцюги з молекулярною масою до 300 кДа [1, 3].
Біологічна цінність к-казеїну полягає в тому, що після ферментативної обробки з нього утворюється велика кількість біологічно активних пептидів, серед яких є фактори росту позитивної мікрофлори, антибактеріальні пептиди, пептиди, які інактивують бактеріальні токсини, опіойдні антагоністи та багато інших [1, 4]. Для харчової промисловості к-казеїн є безцінним, адже саме його кількість в сировині визначає подальшу якість сирної продукції. Для сироваріння використовується пара-к-казеїн, який утворюється після ферментативної обробки хімозином і слугує стабілізатором консистенції сиру. В процесі виробництва сиру утворюється побічний продукт - це інша частина к-казеїну, а саме глікомакропептид, кількість якого в сироватці може сягати до 25% від загальної маси білків. Завдяки дуже низькому вмісту фенілаланіну і високому вмісту інших незамінних амінокислот, саме цей похідний к-казеїну успішно може використовуватись для виготовлення продуктів харчування, які призначені для хворих на фенілкетонурію [4].
Попередні дослідження показали, що ділянки електрофореграмі молока, які відповідають казеїнам, мають відмінні характеристики залежно від умов проведення диск-електрофорезу. Дане явище нами було більш детально досліджено на прикладі комерційних препаратів казеїнів та отриманих нами безпосередньо з коров’ячого молока.
Метою даної роботи було визначення різних форм казеїну за допомогою метода диск-електрофорезу.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
Для наших досліджень було використано два зразки сумішей казеїну: препарат казеїну (Sigma, США) та отриманий методом кислотного осадження
ВИЗНАЧЕННЯ РІЗНИХ ФОРМ КАЗЕЇНУ У МОЛОЦІ МЕТОДОМ ДИСК-ЕЛЕКТРОФОРЕЗУ
казеїн з коров’ячого молока. Для отримання казеїну з молока використовувався 30% розчин оцтової кислоти. Після осадження казеїнову фракцію розчиняли у відповідному буфері в залежності від задачі дослідження.
Для отримання зразків, які містять білкову фракцію, з метою їх подальшого дослідження за допомогою диск-електрофорезу ми використовували комбінацію методів осадження білків за допомогою оцтової та трихлороцтової кислот [б].
З різних систем електрофоретичного поділу білків за молекулярною масою нами було обрано диск-електрофорез в модифікації методики Laemmli [2]. Електрофорез проводили на апараті Hoefer Mighty Small (Amersham Biosciences, США) за сили струму 19 мА для концентруючого та 35 мА для розділяючого гелів. Як маркери використовували: PageRules
Prestained Protein Ladder (Fermentas), до якого входять такі білки: 170 кДа, 130 кДа, 100 кДа, 72 кда, 55 кДа, 40 кДа, 33 кДа, 24 кДа, 17 кДа, 11 кДа. . Гелі фарбували 0,125% розчином кумасі G-250 у 25% ізопропанолі та 10% оцтовій кислоті.
Для відновлення дисульфідних зв’язків застосовували 2 % розчин дітіотритолу [5].
Обробка отриманних методом диск-електрофорезу електрофореграм проводили використовуючи программу ImageMaster TotalLab v.2.01 (Amersham Biosciences).
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Нами було проаналізовано препарати казеїну, які були отримані осадженням безпосередньо з молока та комерційний препарат виробництва Sigma (США). Для досліджень ми використовували метод диск-електрофорезу в поліакриламідному гелі в системі Laemmli в двох варіантах: в стандартних умовах і при наявності дітіотритолу. Обробка фракції казеїнів розчином дітіотритола проводилась для того, щоб зруйнувати утворенні дисульфідні зв’язки між молекулами казеїнів. Обробка дітіотритолом дозволила отримати окремі молекули казеїнів, а не їх комплексів один з одним та з іншими білками.
Основними компонентами серед білків молока є казеїни які представлені 4 різновидами: а^-казеїн, якого більше всього в молоці (12-15 г/л), а^-казеїн (3-4 г/л), Р-казеїн (9-11 г/л) і к-казеїн, який в найменшій мірі представлений в молоці (2-4 г/л). Експериментально було підібрано оптимальні умови для проведення диск-електрофорезу з різними концентраціями білку в пробі. Для проведення електрофорезу використали зразки об’ємом 10, 15, 20 мкл. Після проведеного нами електрофорезу зразків казеїну на електрофореграмі ми виділили чітко 3 білкові зони, в пробах без додавання до зразка дітіотритолу і 4 - в зразках у присутності дітіотритолу (рис. 1).
Не залежно від попередньої обробки по відновленню зразків препаратів казеїну у всіх досліджуваних пробах на електрофореграмах спостерігались смуги які відповідали молекулярним
масам 27 і 25 кДа. Відповідні молекулярні маси є характерними для а-казеїну та Р-казеїну, концентрація яких у вище вказаних смугах не змінювалась залежно від умов підготовки зразків, що підтверджує відсутність взаємодій між цими білками та іншими компонентами зразків за рахунок утворення дисульфідних зв’язків [1].
Рис. 1. Електрофореграма казеїну за різних умов:
1.3.5 - зразки казеїну попередньо оброблені дітіотритолом;
2.4.6 - зразки казеїну, які не проходили додаткової обробки, 7 - білкові маркери молекулярних мас: 170, 130, 95, 72, 55, 43, 34, 26, 17, 10 кДа;
А - зона яка відповідає тетрамерному комплексу з молекулярною масою 68 кДа,
В - зона яка відповідає а-казеїну 27 кДа,
С- зона яка відповідає р-казеїну 25 кДа,
Б - зона яка відповідає к-казеїну 19 кДа,
Е - зона яка відповідає у-казеїну 11 кДа.
Аналіз зразків, які не проходили попередню обробку дітіотритолом показав, на електрофореграмі присутність смуги з молекулярною масою 68 кДа. Електрофорез таких самих зразків, але оброблених дітіотритолом, показав наявність нових двох смуг 19 кДа і 11 кДа. Враховуючи вищевказані результати, було зроблено висновок, що смуга молекулярною масою 68 кДа - це комплекс утворений за допомогою дисульфідних зв’язків. До такого роду взаємодій а-казеїну та Р-казеїн не здатні оскільки до складу їхнього поліпептидного ланцюгу залишки цистеїну не входять [3]. Отримані результати дають підставу передбачити, що смуга на електрофореграмі з молекулярною масою 68 кДа, є тетрамерним комплексом, який утворюється в результаті взаємодії двох білків - к-казеїну (19 кДа) та можливо у-казеїну (11 кДа). З літератури відомо, що ці два білка мають у своєму складі залишки цистеїну, тому вони можуть утворювати комплекси завдяки появі дисульфідних зв’язків [3].
Сьогодні є відомим, що к-казеїн утворює комплекси оскільки він єдиний серед казеїнів який містить залишки цистеїну. За однією з моделей структури казеїнових міцел к-казеїн формує тримери в складі міцели, при цьому гідрофобно взаємодіючи своєю гідрофобною ділянкою (пара-к-казеїн) з гідрофобними ділянками інших казеїнів. Гідрофільна ділянка к-казеїн в такому комплексі ймовірно відіграє
3B
Скалка В.В., Савчук О.М., Остапченко Л.І.
роль стабілізатора і не дає коагулювати міцелам казеїну [1]. Але нами було показано, що крім 3 залишків к-казеїну в комплекс входить ще один інший білок, який не відповідає параметрам к-казеїну, але можливо він і відіграє роль стабілізатора структури самого тетраметра. Для пояснення цієї можливості необхідні більш детальні дослідження виявленого тетрамерного комплексу та 11 кДа білку.
Крім суто біохімічного інтересу підібрані нами умови проведення диск-електрофорезу підходять для вхідного аналізу молочної сировини на присутність різних типів казеїнів, яка використовується у виробництві сиру чи отриманні біологічних активних продуктів, прекурсором яких є к-казеїн.
ВИСНОВКИ
Наші дослідження показали, що к-казеїн в молоці знаходиться в складі тетраметру, молекулярною масою 68 кДа. Досліджений тетраметр складається з 3 молекул к-казеїн і однієї протеїну молекулярною масою 11 кДа, який можливо є у-казеїном. Дані результати дають можливість по іншому оцінити взаємодію між к-казеїном та іншими білками в складі міцел молока. Комплекс методів, який був
використаний для отримання описаних нами результатів може бути використаний в промислових цілях для вхідного контролю молочної сировини, яка призначена для подальшого виробництва сирів.
Література
1. Lawrence K. Creamer, Jeffrey E. Plowman Michael, Liddell J., Mark H. Smith, Jeremy P. Hill. Micelle Stability: к-Casein Structure and Function/Journal of Dairy Science.
- 199B. - V. 81 p. 3004-3012.
2. Laemmli K. Cleavage of structural proteins during the
assembly of the head of bacteriophage T4// Nature. - 1970.
- V.227,N1 - p. б80-б85.
3. O’Donnella R., Hollanda J. W., Deethb H. C. Alewood P. Milk proteomics// International Dairy Journal. - December
2004. - V14, Issue 12 - p. 1013-1023
4. Sofia V. Silva, Xavier Malcata F. Caseins as source of
bioactive peptides//International Dairy Journal. - January
2005. - V.15, Issue 1 - p. 1-15.
5. Галь Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Електрофорез в разделении биологических молекул. - М.: Мир, 1982. -448 с.
6. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Електрофорез и
ультрацентрифугирование - М.: Наука, 1981. - 28б с.
ТЕСТИРОВАНИЕ МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ НА ПРИСУТСТВИЕ к-КАЗЕИА Скалка В.В., Савчук А.Н., Остапченко Л.И.
Статья посвящена исследованию к-казеина, который вместе с другими типами казеина играет значительную роль в формировании физико-химических характеристик молока, выполняя стабилизирующую функцию при образовании и существовании казеиновых мицелл молока. Также к-казеин представляет собой достаточно ценный биотехнологический продукт и его количество в исходном молоке служит характеристикой качества данного вида сырья. Анализ его характеристик в молоке представляет собой весьма важный вопрос как с теоретической, так и с практической точек зрения. Нами было показано, что к-казеин в молоке находится в составе тетрамерного комплекса с молекулярной массой 68 кДа. Разработаны методические подходы, которые позволяют количественно и качественно определять к-казеин в молоке.
Ключевые слова: к-казеин, электрофоретической исследования, тестирование молочной продукции.
TESTING OF MILK PRODUCTS FOR THE PRESENCE OF k-CASEIN Skalka V.V., Savchuk O.M., Ostapchenko L.I.
Article is devoted to researching of K-casein, which, together with other types of caseins plays a significant role in forming the physicochemical characteristics of milk perform a stabilizing function in the formation and existence of casein micelles of milk. Also, K-casein is a very valuable biotechnological product and its quantity in milk serves as a quality characteristic of this type of material. Analysis of its characteristics in milk is a very important issue both from theoretical and practical perspectives. We have shown that K-casein in milk is in tetramer complex with a molecular mass of 68 kDa. Methodical approaches that qualitatively and quantitatively determine the K-casein in milk were developed.
Key words: K-casein, electrophoretic research, testing of dairy products.
