Вивчення ефективності антисептиків для деконтамінації проб крові при бактеріологічнійдіагностиці туберкульозу Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

Власенко В.В., д. б. н., професор, Власенко 1.Г., к. б. н., доцент © Втницький державный аграрный утверситет

ВИВЧЕННЯ ЕФЕКТИВНОСТ1 АНТИСЕПТИК1В ДЛЯ ДЕКОНТАМШАЦП ПРОБ КРОВ1 ПРИ БАКТЕРЮЛОГ1ЧНШ Д1АГНОСТИЦ1 ТУБЕРКУЛЬОЗУ

Показаний метод деконтамтацп проб кровг при мжробюлоггчному дослгджет на туберкульоз. Проведено вивчення тдексу чутливост1 збудника туберкульозу до антисептика супутньог мжрофлори. Метод дае можливкть виявити збудник, коли загальноприйнятою методикою це зробити не вдаеться. Новий високоспециф1чний експрес-метод використовуеться для виявлення мжобактерш туберкульозу (МБТ) у кровг з наступним бактерюлог1чним тдтвердженням шляхом видыення чистог культури МБТ за 2-5 д1б.

Ключовi слова: кров, збудник туберкульозу, антисептик, поживне середовище, стимулятор росту.

Пщготовка патолопчного матерiалу для мжробюлопчних дослщжень проводиться за загальноприйнятою схемою, яка спрямована на збагачення МБТ та знищення супутньо! мжрофлори.

З метою знищення супутньо! мжрофлори в р^ потреби (при контамшаци матерiалу мжрооргашзмами) патолопчний матерiал оброблюють 3,0 -5,0 %-ним розчином Ырчано! кислоти у стввщношенш 1:1, добре змшують i дають вщстоятися. Надосадну рiдину центрифугують впродовж 1015 хвилин, але загальна експозицiя ди кислоти не повинна перевищувати 20 хвилин. Поим надосадну рщину зливають, а осад вiдмивають 1-2 рази стерильною дистильованою водою - центрифугуванням. Отриманий осад використовують для бактерюлопчних посiвiв, зараження лабораторних тварин та мжроскопи. 1снують також iншi методи знищення супутньо! мжрофлори в патолопчному матерiалi.

Сечу в невеликiй кшькосп центрифугують, отриманий осад обробляють 4,0 % розчином №ОН за загальноприйнятою методикою або 5,0 %-ним розчином Ырчано! кислоти. Проте далеко не завжди тсля деконтамiнацi!' iз застосуванням цих антимжробних розчинiв отримують рют мiкобактерiй туберкульозу на спецiальних поживних середовищах. Але запропонованi антисептики для контамшаци кровi не придатнi. А необхщшсть вивчення проблеми деконтамiнацi! проб при дослщженш на туберкульоз вказують ряд авторiв (1-7).

Враховуючи щ обставини, iснуe необхiднiсть пошуку шших антисептичних розчинiв для деконтамiнацi! вдабраних проб кровi та подальшого мжробюлопчного дослiдження для iзоляцi! чисто! культури мжобактерш туберкульозу.

© Власенко В.В., Власенко 1.Г., 2009

31

Метою нашо1' роботи було знайти антисептик, який би не шпбував picT збудника туберкульозу i надшно знищував супутню мжрофлору.

Матер1ал та методи дослщжень. Випробовуючи piзнi препарати, якi володiють антимжробною активнicтю, ми не отримали надежного ефекту, але титрування хлоргексидину показало, що вiн володie бактерицидними i антисептичними властивостями, е ефективним щодо грампозитивних i грамнегативних бактеpiй, а також мае фунгщидну дiю. В медичнш пpактицi цей препарат застосовують для дезшфекци ран та сечового мiхуpа в концентраци 0,01-0,05%. Для виявлення ефективноcтi препарату використовували середовище ВКГ та його стимулятор i тест-штами мiкpооpганiзмiв. При вiдпpацюваннi ваpiантiв ми використали тест-штами S. aureus штам "Кован", S. aureus 209-Р, S. epidermitidis 1623(25), Е. coli "Berlin", S. "aureus штам Жаев", Sal. enteritidis 11270, В. subtilis, М. tuberculosis H37 RV, М. bovis 8, а також туберкулш ППД cеpiя 45 як мжобактери з ослабленою життездатнicтю та пониженою ферментативною активнicтю. В доcлiд включали добовi культури супутньо! мiкpофлоpи, а також змиви культур збудника туберкульозу з середовища Левенштейна - Снсена. Також в доcлiд включали пpобipки з кров'ю та антикоагулянтом (по 5 мл), надалi в кожну пpобipку додавали по 1 мл змиву кожно! культури (1 млн мжробних тiл в 1 мл). До отримано! суспензи (кров та культура) добавляли таку ж кшькють 0,01% хлоргексидину, ретельно перемшували i витримували 30 хвилин при юмнатнш темпеpатуpi, пicля чого додавали piвну кiлькicть стимулятора ВКГ i термостатували впродовж 24 год. при 37°С i виciвали на середовище ВКГ. Контролем служили поЫви вciх культур пщготовлеш за вищеописаною методикою без використання 0,01% хлоргексидину на cеpедовищi ВКГ. За щею методикою проведено 15 дослщжень. Облiк pезультатiв проводили впродовж 10 дiб. Методика дослщження визначення тдексу чутливост1 була такою. У стерильну чашку наливали бия 20 мл приготованого за рашше описаним способом дослщного та контрольного середовища ВКГ. Двотижневу культуру МБТ(М. tuberculosis H37 RV, М. bovis 8, М. bovis 8), що виросла на cеpедовищi Левенштейна - Йенсена, змивали дослщним антисептиком (в концентраци 1:1 - стимулятор росту та 0,01% хлоргексидин), готували розведення культур 1:100. Контрольним антисептиком слугував стимулятор росту та дистильована вода, (в концентраци 1:1 - стимулятор росту та дистильована вода) готували розведення культур 1:100. Дослщш та контрольш пpобipки ретельно перемшували i витримували 30 хвилин при юмнатнш температура термостатували впродовж 24 год. при 37°С i виЫвали на середовище ВКГ. Доза поЫвного матеpiалу кожен раз була 1,0 мл. ПоЫв витримували при 37°С. На 10 добу робили роздшьний тдрахунок кiлькоcтi колонiй на контрольному та на дослщному середовищах. За такою методикою ставили дослщи з уЫма трьома штамами збудника туберкульозу.

Результати дослщжень. В результат доcлiджень встановлено, що контрольний стимулятор росту ВКГ не шпбуе культури, яю взят в доcлiд, тодi, як дослщний стимулятор росту з використанням 0,01% хлоргексидину на cеpедовищi ВКГ, шпбуе рют супутньо! мiкpофлоpи та допускае росту вЫх

32

культур збудника туберкульозу (МБТ). Результати дослщжень наведеш в табл.1. Стерильшсть стимуляторiв на середовищi ВКГ пщтверджена при посiвi 1х без культур мiкроорганiзмiв. Рiст культур еталонних штамiв збудника туберкульозу на запропонованому середовищi в усiх випадках реестрували через 24-72 години. На першу добу колони з'являлись у виглядi роси, а на 2-3 добу колони збшьшувались, набуваючи вигляду краплi розтопленого воску або газонного росту.

З посiвiв робили мазки, ят фарбували за методикою Цшь-Нiльсона.

Таблиця 1

Результати дослщження елективних властивостей досшдного та контрольного _стимулятора росту мжобактерш тест-штамш мпкрооргаигяупв_

Поживш середовища

ч

о О

ч

Л

н

0

1

К-сть дослщв, на яких виросли мжрооргашзми

о > 13 & Р

^ гя

я ¡и 3

о

т

м

сл

15 ^

<и

С/3

¡8

и

•щ

ю Р<

е^ЕЗ

а

<и

° -о

Дослщне середовище з 0,01% хлоргексЬдину та стимулятором росту

15

15

15

15

Середовище ВКГ зs стандартним стимулятором (контроль)

15

15

15

15

14

12

15

15

Примггка: Поави добових культур м1крооргашзм1в проводили за допомогою стерильного одноразового шприца як на дослщжуване, так 1 на контрольне середовище

Як видно з результат дослщжень, на дослщному середовищi проявляеться рiст лише мжобактерш, але супутня мiкрофлора не росте. На контрольному середовищi ВКГ проявляють рют всi культури, взятi в дослщ.

Встановлення здатностi запропонованого антисептика допускати задовшьний розвиток мiкобактерiй в концентращях, бактерицидних для супутньо! мжрофлори, е важливим фактором в дiагностицi туберкульозу.

По-перше, мжобактери дуже добре витримують концентрацш ди 0,01% хлоргексидину i ця властивiсть МБТ використовуеться при обробщ (пiдготовцi) дослiджуваного матерiалу. По-друге, розчиннiсть у водi е вельми бажаною властивктю при створенш елективного стимулятора росту мiкобактерiй. Слщ також зазначити, що всi iнгредiенти широко використовуються в медицинi, ветеринари та харчовiй промисловостi i е не дефщитними в нашiй держава На нашу думку, вищезгаданий препарат можна

33

було б використати для деконтамшаци проб при бактерюлопчному дослщженш на туберкульоз, але при цьому доцшьно було вивчити дш вищезгаданих препарата на шпбування росту збудника туберкульозу. Тому доцiльно визначити i^^KC чутливостi антисептика до збудника туберкульозу. Результат тдрахунку колонiй використовувався для обчислення iндексу чутливостi антисептика щодо мiкобактерiй. За iндекс чутливост приймали вiдсоткове вiдношення кiлькостi колонш, що зросли на дослiдному середовищi з антисептиком, вiдносно кiлькостi колонш, що зросли на контрольному середовища

Щоб уникнути можливо! помилки при обчисленш iндексу чутливостi, дослiди з кожним штамом мiкобактерiй повторювали п'ятиразово. Отже, шдекс - це середня величина вщ п'ятикратних обчислень.

Результати обчислень середнього шдексу чутливостi запропонованого середовища зi стимулятором росту мжобактерш наведений в таблицi 2. Як видно з даних таблиц 2, шдекс чутливост середовища, що пропонуеться, вiдносно рiзних штамiв збудника туберкульозу коливався в межах вщ 91,4% (для M. bovis 8) до 95,1% (для штама M. bovis BCG). Середнш iндекс для вах трьох штамiв виявився рiвним 93,8%. Це означае, що внаслщок деякого гальмуючого впливу антисептика рiст збудника туберкульозу на середовищ^ бувае в середньому на 6,2% нижчим, шж на контрольному середовищi без шпб^ора. Здатнiсть середовища вловлювати в середньому 93,8% життездатних мiкобактерiальних клiтин можна з повною упевненiстю прийняти як цшком задовiльнi результати для прискореного видшення збудника туберкульозу на середовищi зi стимулятором росту МБТ.

Таблиця 2

Визначення шдексу чутливосп середовища та стимулятора росту

мжобактерш ВКГ, (M ± m; n=5)

1ндекс чутливосп запропонованого антисептика та стимулятора росту мжобактерш ВКГ

Назва i штам м1крооргашзм1в Середня шльшсть колонш мжобактерш 1ндекс, % Середнш вдекс, %

На контрольному середовищ1 На дослщному середовищ1 з антисептиком

M. tuberculosis H37 Rv, 80+0,3 76+0,3 95 93,8

М. bovis 8, 81+0,4 74+0,4 91,4

M. bovis BCG 81+0,4 77+1,7 95,1

Висновки. 1. Розробка нового способу деконтамшаци кровi для мжробюлопчного видiлення збудника туберкульозу забезпечуе виключно

34

високу чутливкть при вирощуванш збудника туберкульозу з використанням антисептика.

2. Запропонований споаб суттево розширюе можливост вивчення бюлогп збудника туберкульозу в системi кровi та дае можливкть визначати якiсть та безпеку харчово! сировини тваринного походження.

Л1тература

1. Власенко В.В. и др. Современная микробиология туберкулеза. - Киев,

1999.

2. Власенко В.В. та шшг Проблеми лейкозу, туберкульозу та шляхи !х виршення в тваринництвг - Вiнниця, 2002.

3. Власенко В.В. та шшг Метод бактерюлопчного контролю якостi туберкулiну ППД для ссавцiв. - Вiнниця, 1999.

4. Каач Ю.Я., Завгороднiй А., Горжеев В.В., Зелшський М.Д. та шшг Порiвняльне виявлення туберкулiнiв. - Кшв, 2001.

5. Лысенко А.П. и др. Исследование сыворотки крови здоровых коров, больных туберкулезом и инфицированных атипичными микобактериями в перекрестном имунно-електрофорезе и имунно-ферментном анализе. -Минск, 1998.

6. Лысенко А.П. и др. Результаты испытания ППД туберкулина для млекопитающих в дозе 5000 т.е.- Минск, 1998.

7. Лысенко А.П. и др. Изучение выявления инфицирования атипичными микобактериями на проявление реакций иммунодиффузии у крупного рогатого скота зараженного вирусом лейкоза. - Минск, 1993.

Стаття надшшла до редакцИ 24.03.2009

35