CC BY
14
ОГЛЯД Л1ТЕРАТУРИ
© Харченко О. В.
УДК 616 - 006. 6 : 577. 2
Харченко О. В.
ВИСОКА 1НФОРМАТИВН1СТЬ МОЛЕКУЛЯРНО-Б1ОЛОГ1ЧНИХ МАРКЕР1В
Полтавський нацiональнiй педагопчний унiверситет iM. В. Г. Короленка (м. Полтава)
Дослiдження е фрагментом науково-дослщно'|' роботи «Формування сучасних методiв хiрургiчного лiкування i профiлактики ускладнень захворювань i травм органiв трудно! клггки i черевно! порожнини» (№ держреестрацiI 0110U002649).
Вiдносна насиченiсть геномiв тими чи iншими мiкросателiтними послщовностями е результатом дi! багатьох факторiв, серед яких одним з основних е рiвень стабiльностi мiкросателiтноI ДНК, що ви-значаеться реплiкацiйними та репарацмними про-цесами, мутацiйними подiями, модифiкацiею ДНК, одиничними нуклеотидними замшами, що змшюють конфiрмацiйнi тенденцiI, як в сумi визначають ком-позицмы, структурнi та термодинамiчнi особливостi геномних мiкросателiтних послiдовностей [2].
1снуе три класичних типи мiкросателiтних повторiв:
1. Досконалий, без включень, наприклад: (СА)п.
2. Недосконалий, з одним або бтьшою кiлькiстю включень, наприклад{(СА)п-ССА-(СА)т}
3. Складовий, з прилеглими повторами шшо! по-слiдовностi, наприклад {(CA)n(GT)m} [12].
Утворення мiкросателiтiв може вiдбуватися двома шляхами. Одним з ресурЫв еволюци простих повторiв у еукарiот е poly (А)-треки [13].
Серед мiкросателiтних ДНК геномiв ссавцiв poly(A)/(T) треки пщвищують всi мiкросателiтнi повтори за розповсюдженням [4]. Характерною для них в геномi еукарiот е кластерiзацiя з ретротран-спозонами, що не мають довгих кiнцевих послщов-ностей (LTRs). Poly (А)-треки знаходяться в 3'юнцях таких мобiльних елемен^в[18].
Друга потенцiйна можливiсть утворення мiкро-сателiтних послiдовностей складаеться з реплка-цiйного подовження або скорочення протомiкроса-телiтiв, якi можуть утворюватися в геномi за рахунок мутацiйних подм. Такi мiкросателiти повиннi мати м^ нiмальну кiлькiсть повторiв (3-5), для того, щоб було можливим змшити !х довжину за рахунок утворення петель при транскрипцп. Такi поди в геномi еукарiот мають високий рiвень ймовiрностi. Процес подовження мiкросателiтiв контролюеться репарацiйною
системою. В цтому кiлькiсть довгих мiкросателiтних повторiв невелика i !х розповсюдженiсть широко ва-рiюе. Лише 12 % вЫх мiкросателiтiв в геномi людини, наприклад, мають бiльше 40 нуклеотидiв[24].
Крiм цих двох шляхiв утворення мiкросателiтних послiдовностей iснуе ще можливють трансформацii, однiеI мiкросателiтноI послiдовностi в складову, що складаеться з двох послщовностей з рiзними повто-рюваними мотивами. Це може вщбутися за рахунок мутаци в одному з повторiв i його тиражування за рахунок реплкацмних помилок [7]. Мiкросателiти можуть знаходитись в геномi скрiзь, як в некодую-чих [11], так i в кодуючих послщовностях, впливаючи на транскрипцiйну активнiсть викликаючи взаемо-дii типу бiлок-бiлок з утягуванням транскрипцiйних факторiв. Значна фрак^я мiкросателiтних послщов-ностей е частиною мобтьних елементiв [28].
Щiльнiсть розподтення мiкросателiтних по-вторiв в еукарютних геномах широко варiюе. Вщо-мо також, що на аутосомах щтьнють мiкросателi-тiв значно вище, ыж на Х- хромосомi. Але в самм Х-хромосомi вiдмiчаеться висока гетерогеннють по щiльностi мiкросателiтiв в ii рiзних регiонах. Рiвень полiморфiзму мiкросателiтних послiдовностей в Х-хромосомi в порiвняннi з аутосомами також наба-гато нижче. Менша варiабельнiсть мiкросателiтiв на Х-хромосомi пояснюеться рiзницею в час дозрiван-ня статевих та соматичних 1^тин [13].
Щодо бiологiчного значення мiкросателiтноi, ДНК то ii роль на сьогодн не зовсiм вияснена. Без сумыву участь мiкросателiтних послщовностей в рекомбшацмних подiях. «ГарячЬ> сайти рекомбЫа-цiй часто бувають локалiзованими в областях мiнi- i мiкросателiтних повторiв. Для мiкросателiтних послщовностей, в основному для дiнуклеотидних, показана здатнють утворювати зв'язки з рекомбЫа-цiйними бiлками, такими, наприклад, як RecA, який вiдiграе центральну роль в рекомбЫацмних подiях. В присутност АТР, cRecA утворюе однониткову ДНК або пробт в дуплекс^ який i е мiсцем спарюван-ня мiж гомологiчними послiдовностями. При дея-ких умовах дiнуклеотиднi повтори (АС/TG) здатнi
утворювати лiвозакручену спiраль ДНК, це сприяе утворенню пробiлiв, з послщуючою рекомбiнацieю. Серед хромосом частота як довгих, так i коротких мiкросателiтних кластерiв виявляе частоту кросове-piB. А-багатим послiдовностям, приписують вплив на високий piвень структурно! оргаызаци хроматину [3].
Полiмоpфiзм мiкpосателiтiв може бути виявле-ний !х морфолопчними характеристиками. Рiзниця в ступенi полiмоpфiзму мiж piзними мiкpосателiтами може залежати в першу чергу вiд довжини само! м^ кpосателiтно! послiдовностi, вщ кiлькостi нуклеоти-дiв в одиниц повтору i вiд гомогенностi мкросате-лiтно! послiдовностi [30].
Бiльшiсть мiкpосателiтних мутацiй пов'язанi з iнсеpцiями або деле^ями деяких повтоpiв, що вщ буваються пiд час pеплiкацi!. Таке порушення ста-бiльностi мiкpосателiтiв частше всього вiдбуваеться завдяки утворенню петель на ДНК пщ час реплкаци («slippage») [10].
Рiвень частоти транскрипцмного петлеутворен-ня ваpiюе. Залежнiсть мiж кiлькiстю таких мутацiй та pозмipами мiкpосателiтно! ДНК мае прямо пропо-pцiйний характер, а для чотирьохнуклеотидних по-втоpiв - експоненцiальний [31].
1нтенсивне подовжання мiкpосателiтних по-слщовностей за рахунок pеплiкацiйних помилок мае назву мiкpосателiтно! експансi!. Здатнiсть по-втоpiв до експансi! також залежить вщ довжини м^ кpосателiтно! послщовностк Наприклад, у людини сиквенс-аналiз дозволив вияснити, що таким му-тацмним подiям пpидатнi гомогеннi мiкpосателiтнi алелi з кiлькiстю повтоpiв piвним або бтьшим оди-надцяти. Спiввiдношення мiж мутацiйними подiями. що призводять до збтышення мiкpосателiтних по-слiдовностей за рахунок додавання повтору, ств-вщносяться з кiлькiстю мутацiй, що призводять до зменшення кiлькостi повтоpiв в мiкpосателiтах людини як 10:4 [5].
В деяких мiкpосателiтних повторах помилки реплкаци переважно пов'язан з 3'-юнцем: (GA)n i (CA) n, у шших з 5'-юнцем - (CG)n i (CT)n [21], що свщчить про вплив на процес виникнення pеплiкативних помилок мотиву повторюваних послiдовностей. В три-нуклеотидних GC- багатих повторах проксимальний по вщношенню до напрямку реплкаци 3'-юнець мае позитивний вплив на частоту репликативних помилок, тому що кожного раунду реплкаци на ньому утворюеться петля. Не дивлячись на те, що петля на 3'-юнщ виникае пщ час кожного реплкативного туру, в 99 % ця помилка корегуеться системою репа-pацi!. Змiна довжини мiкpосателiтно! послщовност вiдбуваеться одного разу на 100 реплкацм. Не дивлячись на високий piвень мутабельностi мкросате-л^но! ДНК, бiльша частина виявлених в нм мутацiй пов'язана з соматичними кгитинами [19].
Серед тринуклеотидних повтоpiв максимально цi властивостi мають прояви також GC-багатими повторами, такими як (CAG)n, (CTG)n, (GGC)n i (GCC)n. Характер i закономipностi розподтення в геномi цих трьохнуклеотидних мкросателтв мае особливий
iнтерес завдяки тм ролi, яку вони грають в розви-тку онкологiчних захворювань. На тепершнм час це найбiльш вивчен мiкросателiтнi послiдовностi. Вони вiдносяться до числа найбтыш представлених в кодуючих регiонах геному людини [6].
З розвитком деяких пухлинних захворювань пов'язана нестабшьнють також i дiнуклеотидних м^ кросателiтiв [23, 27]. Реплiкативнi помилки в дшу-клеотидних повторах частше буваюты пов'язаними з делецiями, як призводять до зсуву рамки зчиту-вання [15].
Вивчення механiзмiв, що призводять до мутацм-них подм в мiкросателiтних послiдовностях, показали, що в основi цих подм, як в нормальних, так i в ра-кових клiтинах лежать оды й т самi мехаызми [25].
Кiлыкiсты точкових мутацiй пщтверджуеться в м^ кросателiтнiй ДНК на одному рiвнi, незалежно вiд I! характеристик. Але в самих мкросателтах е зони, де такi мутаци виникають частiше. 1снуе три меха-нiзми, що продукують в цих послщовностях мутацiI: iнcерцiя, делецiя, замша i порушення повторювано-го мотиву [17].
Полiморфiзм мiкросателiтiв може визначатись !х локалiзацiею та орiентацiею в геномк Як вже було вiдмiчено ранiше, е суттева рiзниця в частой зна-йдення мiкросателiтiв з рiзними повторними мотивами в кодуючих та не кодуючих послщовностях геному. При цьому полiморфiзм тандемних повторiв в генах зустрiчаетыся набагато частше, нiж в цiлому по геному. Полiморфiзм приблизно 8 % цих локуЫв в серединi кодуючих репоыв, призводить до зсуву рамки зчитування. Значна частина транскрибованих послщовностей, що мають такi полiморфнi повтори, пов'язана з фенотитчними проявами, а також з ло-кусами, що вщповщають за проявлення генетичних захворювань. Аналiз розподiлення мiкросателiтних послiдовностей свщчить про те, що !х орiентацiя по вiдношенню до кодуючих репоыв е високо консервативною [22].
На полiморфiзм мiкросателiтiв впливають !х тер-модинамiчнi характеристики. Вторинна структура ДНК розглядаеться сыогоднi як причина експанси мiкросателiтних послiдовностей. Сама вторинна структура ДНК е похщною термодинамiчних характеристик II послiдовностi [8].
Деякими роботами, було показано, що структура i властивост любо! послщовност ДНК, залежать не тiлыки вщ комплiментарних взаемодiй послiдовностi нуклеотидних основ, але i в значнiй мiрi вiд взаемо-дiI з ближыми парами сусiднiх основ. Загалынi змши енергiI в ДНК-дуплексах залежать вщ двох типiв взаемодiй основ нуклешових кислот: копланарних взаемодiй або взаемодм в однiй площинi (воднев1 зв'язки) i купкових взаемодiй або взаемодм в пара-лельних площинах (електростатичы, вандервальсо-вi та конфiрмацiйнi взаемоди). Цей принцип названий моделлю «найближчих сусiдiв». Значна кiлыкiсты донорiв i акцепторiв водневого зв'язку атомiв основ та рибози допускае велику юльюсть конфiгурацiй пар основ, що взаемодтть декiлыкома водневи-ми зв'язками. При цьому максимальна юльюсть
конф^урацм для Bcix можливих пар основ (A,G,C,T) складае 216 [16].
Енергп утворення кожного з можливих дщуплек-ciB були виявлен емпiрично з використанням ме-тодiв абсорбцiйноI калориметрiI i спектрофотоме-тричних методiв [26].
Як вже було сказано вище, вториннi структури типу петель в мiкросателiтних послiдовностях, ви-явленi 1х термодинамiчними характеристиками, можуть iнiцiювати явище експансiI мiкросателiтних повторiв. Показано, що, чим стабiльнiшi таю петлг тим нижче ризик утворення нових мiкросателiтних повторiв. Наприклад, послщовност тридуплексiв CAG/CTG i GAC/GTC мають рiвну кiлькiсть водневих зв'язкiв, але розрiзняються силою купкових взаемо-дй Цього е достатньо, щоб зробити перший з них бтыш вразливим для експансп мiкросателiтних по-вторiв. Стабiльнiсть петлi збiльшуеться в напрямку: GTC < CAG < GAC < CTG, навпаки частота утворення нових повторiв зменшуеться в тому ж напрямку: GTC > CAG > GAC > CTG [12].
Розрахунки термодинамiчних характеристик по-вторюваних послщовностей дозволили також роз-робити ряд модельних систем, оцшюючих здатнють мiкросателiтних послiдовностей впливати на мо-дифiкацiI ДНК, формуючи рiзнi вториннi структури, пов'язанi з явищем експансiI мiкросателiтних по-вторiв, а також з асо^ащею мiкросателiтних посл^ довностей з проте1н-пов'язуючими i регуляторними сайтами [2, 20].
У зв'язку з цим, кроком вперед в етгенетичних дослiдженнях, був факт виявлення здiбностi тан-демних повторiв впливати на модифкаци ДНК i
провокувати перетворення неактивних станiв генiв [29].
6 й mini фактори, що впливають на полiморфiзм мiкросателiтних послщовностей. В чоловiчих гене-ративних ^тинах частота мутацiй в мiкросателiт-них послщовностях вдвiчi вище, нiж в жшочих ре-продуктивних клiтинах, що, ймовiрно, пояснюеться рiзницею в ктькост ^тинних подiлiв при дозрiваннi жЫочих i чоловiчих репродуктивних 1^тин. Це важ-ливий етап на якому вщбуваеться мутацiйне змЫен-ня в мiкросателiтнiй послiдовностi [9].
На рiвень мутацiй мiкросателiтних послщовнос-тей крiм статi впливае i вiк, мiж тим, з вiком кiлькiсть мутацм в мiкросателiтних повторах збiльшуеться [8].
Типи маркерiв, що отримують в результат PCR, подiленi на двi групи на базi дизайну праймерiв: перша група вiдома як STSs (sequence-tagged sites) з праймерами, сконструйованими з вщомих по-слiдовностей, i друга - що базуеться на довтьних праймерах. Праймери для STS-пiдходу отримують iз картированих малокопмних послiдовностей (iз ПДРФ-клонiв). STS - це коротю, унiкальнi послiдовностi, амплiфiкованi шляхом PCR для iдентифiкацii вщомих репоыв на хромосомi. Найiнформативнiший або полiморфний STS-маркер з'являеться тодi, коли амплiфiкуеться дiльниця ДНК, що вмщуе послiдовностi мiкросателiтних повторiв. Такий маркер, базуеться на STS, i позначений як simpl-sequence length polymorphism (SSLP) або sequence-tagged microsatellit site (STMS). Кожний STMS-маркер детектуе успадкованi по Менделю кодомЫанты алелi в одиничному локус в геномi [1].
Л^ература
1. Абрамов Д. Д. Точность метода полимеразной цепной реакции «в реальном времени» / Д. Д. Абрамов, Д. Ю. Трофимов, Д. В. Ребриков // Прикл. биохимия и микробиология. - 2006. - Т. 42. - С. 485 - 488.
2. Baldi P. Sequence analysis by additive scales: DNA structure for sequences and repeats lengths / P. Baldi, P. F. Baisnee // Bioinformatics. - 2000. - Vol. 16. - P. 865 - 889.
3. Barros R. Pathophysiology of intestinal metaplasia of the stomach: emphasis on CDX2 regulation / R. Barros, V. Camilo,
B. Pereira // Biochem. Soc. Trans. - 2010. - Vol. 38, № 2. - P. 358 - 363.
4. Brohede J. Individual variation in microsatellite mutation rate in barn swallows / J. Brohede, A. P. Moller, H. Ellegren // Mutat. Res. - 2004. - № 12. - Р. 73-80.
5. Bruford M. W. Microsatellites and the application to conservation genetics / M. W. Bruford, D. J. Cheesman, T. Coote, A. A. Green, А Haines // in Molecular Genetic Approaches in Conservation. - edited by T. Smith and RK Wayne. - Oxford University Press. - NewYork. - 1996. - Р. 278 - 297.
6. Buldyrev S. V. Expansion of tandem repeats and oligomer, clustering in coding and noncoding DNA, sequences / S. V. Buldyrev, N. V. Dokholyan, S. Havlin, H. E. Stanley, H. R. Stanley // Physica. - 1999. - № 273. - Р. 19 - 32.
7. Bull L. Compound microsatellite repeats: practical and theoretical feautures / L. Bull, C. R. Pabon-Pena, N. B. Freimer // Genome Res. - 2000. - № 9. - P. 830 - 838.
8. Cleary J. D. Replication fork dynamics and dynamic mutations: the fork-shift model of repeat instability / J. D. Cleary,
C. E. Pearson // Trends Genet. - 2005. - № 21. - Р. 272-280.
9. Cowan C. A. Nuclear reprogrammin of somatic cells after fusion with humen embryonic stem cells / C. A. Cowan // Science. - 2005. - Vol. 309. - P. 1369 - 1373.
10. Freimer N. B. Microsatellites: evolution and mutational process / N. B. Freimer, M. Slatkin // Ciba Found Symp. - 1996. -№ 197. - Р. 51 - 67.
11. Hancock J. M. A role for selection in regulating the evolutionary emergence of disecausing and other coding CAG repeats in humans and mice / J. M. Hancock, E. A. Worthey, M. F. Santibanez-Koref // Mol. Biol. Evol. - 2001. - Vol. 18, № 6. -P. 1014 - 1023.
12. Hartenstine M. J. Base stacking and even/odd behavior of hairpin loops in DNA triplet repeat slippage and expansion with DNA polymerase / M. J. Hartenstine, M. F. Goodman, J. Petruska // J. Biol. Chem. - 2000. - № 24. - Р. 18382 - 18390.
13. Jarne P. Microsatellites, transposable elements and the X chromosomes / P. Jarne, P. David, F. Viard // Mol. Biol. Evol. -1998. - № 15. - Р. 28 - 34.
14. Karthikeyan G. Fold-back structures at the distal end influence DNA slippage at the proximal end during mononucleotide repeat expansions / G. Karthikeyan, K. V. Chary, B. J. Rao // Nucleic Acids Res. - 1999. - № 19. - P. 3851 - 3858.
15. Leontis N. B. The non-Watson-Crick base pairs and their associated isostericity matrices / N. B. Leontis, N. Stombaugh, J. Westhof // Nucl. Acid. Res. - 2002. - № 3. - P. 3497 - 3591.
16. Makova K. D. Evolution of microsatellite alleles in four species of mise Genus apodemus / K. D. Makova, A. Nekrutenko, R. J. Baker // J. Mol. Evol. - 2000. - № 51. - P. 166 - 172.
17. Nadir E. Microsatellite spreading in the human genome: Evolutionary mechanisms and structural implications / E. Nadir,
H. Margalit, T. Gallily, V. Ben-Sasson // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1996. - № 93. - P. 6470 - 6475.
18. Pearson C. E. Trinucleotide repeat DNA structures: dynamic mutations from dynamic DNA / C. E. Pearson, R. R. Sinden // Curr. Opin. Struct. Biol. - 1998. - № 3. - P 321-330. Review.
19. Ponomarenko M. H. Identification of sequence -depended DNA sites interacting with proteins / M. H. Ponomarenko, J. V. Ponomarenko, A. S. Frolov [et al.] // Bioinformatics. - 1999. - № 15. - P. 687.
20. Primmer C. R. Directional evolution in germline microsatellite mutations / C. R. Primmer, H. Ellergen, N. Saino, A. P. Moler // Nature Genet. - 1996. - № 13. - P. 391 - 393.
21. Scotti I. Microsatellite repeats are not randomly distributed within Norway sprue (Picea abies K.) expressed sequences /
I. Scotti, F. Magni, R. Fink [et al.] // Genome. - 2000. - № 4. - P. 41 - 46.
22. Stallings R. L. Distribution of trinucleotide microsatellites in different categories of mammalian genomic sequence: implication for human genetic diseases / R. L. Stallings // Genomic. - 1994. - № 21. - P. 116-21.
23. Stephan W. Possible role of natural selection in the formation of tandemrepetitive noncoding DNA / W. Stephan W., S. Cho // Genetics. - 1994. - № 136. - P. 333 - 341.
24. Sturzeneker R. Polarity of mutations in tumor-associated microsatellite instability / R. Sturzeneker, L. A. Haddad, R. A. Bevi-lacqua, A. J. Simpson, S. D. Pena // Hum Genet. - 1998. - № 102. - P. 231-235.
25. Sugimoto N. Application of the thermodynamic parameters of DNA stability prediction to double-helix formation of deoxy-ribooligonucleotides / N. Sugimoto, K. Honda, M. Sasaki // Nucleosides & Nucleotides. - 1999. - № 13. - P. 1311 - 1317.
26. Thibodeau S. N. Microsatellite instability in cancer of the proximal colon / S. N. Thibodeau, G. Bren, D. Schaid // Scienc. -1999. - № 260. - P/ 816 - 819.
27. van Lith H. A. Characterisation of rabbit DNA microsatellites extracted from the EMBL nucleotide sequence database / H. A. van Lith, L. F. van Zutphen // Anim Genet. - 1996. - № 27. - P. 387 - 395.
28. Wolffe A. P. Epigenetics: Regulation Through Repression / A. P. Wolffe, M. A. Matzke // Science. - 1999. - № 286. - P. 481 -486.
29. Wren D. J. Repeat polymorphisms within gene regions: phenotypic and evolutionary implication / D. J. Wren, E. Forgacs, J. W. Fondon [et al.] // Am. J. Hum. Genet. - 2000. - № 67. - P. 345 - 356.
30. Xu X. The direction of microsatellite mutations is dependent upon allele length / X. Xu, M. Peng, Z. Fang // Nat. Genet. - 2000. - Vol. 4, № 4. - P. 396 - 399.
УДК 616 - 006. 6 : 577. 2
ВИСОКА ШФОРМАТИВНЮТЬ МОЛЕКУЛЯРНО-Б1ОЛОГ1ЧНИХ МАРКЕР1В Харченко О. В.
Резюме. Насиченють геномлв мкросателггними послщовностями е результатом дм факторiв, як ви-значають ïx композицмы, структуры та термодинамiчнi особливостг Мiкросателiти можуть знаходитись в reHOMi CKpi3^ як в некодуючих, так i в кодуючих послщовностях, впливаючи на транскрипцмну активнють. Полiморфiзм мiкросатeлiтiв може бути виявлений ïx морфолопчними характеристиками. 1нтенсивне подо-вжання мiкросатeлiтниx послщовностей за рахунок реплкацмних помилок мае назву мкросателггно'| експанси. Здатнють повторiв до експанси залежить вщ довжини мiкросатeлiтноï послщовностг Стввщношення мiж мутацмними подiями, що призводять до збтышення мiкросатeлiтниx послщовностей за рахунок дода-вання повтору, стввщносяться з кшьюстю мутацм, що призводять до зменшення юлькост повторiв в мкро-сателтах людини як 10:4. Полiморфiзм мiкросатeлiтiв може визначатись ¡х локалiзацiею та орiентацiею в геномг Вторинна структура ДНК розглядаеться сьогодн як причина експанси мiкросатeлiтниx послщовностей. Сама вторинна структура ДНК е похщною тeрмодинамiчниx характеристик ïï послщовностг
Розрахунки тeрмодинамiчниx характеристик повторюваних послщовностей дозволили розробити ряд модельних систем, оцЫюючих здатнють мiкросатeлiтниx послщовностей впливати на модифкаци ДНК, формуючи рiзнi вторинн структури, пов'язан з нестабшьнютю мкросателтв.
1снуе двi групи маркeрiв, що отримують в результат PCR: перша -вщома як STSs (sequence-tagged sites) з праймерами, сконструйованими з вщомих послщовностей, i друга - що базуеться на довтьних прайме-рах. НайЫформативыший або полiморфний STS-маркер з'являеться тод^ коли амплiфiкуеться дтьниця ДНК, що вмщуе послщовност мкросателтих повторiв. Такий маркер, базуеться на STS, i позначений як simpl-sequence length polymorphism (SSLP) або sequence-tagged microsatellit site (STMS). Кожний STMS-маркер детектуе успадкован по Менделю кодомшанты алeлi в одиничному локус в геномг
Ключовi слова: мкросател^ы послщовност^ мкросател^ы експанси, помилки реплкаци, нестабшьнють мкросателтв, маркери на основi PCR.
УДК 616 - 006. 6 : 577. 2
ВЫСОКАЯ ИНФОРМАТИВНОСТЬ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ
Харченко А. В.
Резюме. Насыщенность геномов микросателлитными последовательностями являются результатом действия факторов, которые определяют их композиционные, структурные и термодинамические особенности. Микросателлиты могут находиться в геноме везде, как в некодирующих, так и в кодирующих последовательностях, влияя на транскрипционную активность. Полиморфизм микросателлитов может выявляться их морфологическими характеристиками. Интенсивное удлиннение микросателлитных последовательностей за счёт репликационных ошибок называется микросателлитными экспансиями. Способность повторов к экспансии зависит от длины микросателлитной последовательности. Соотношение между мутационным влиянием, которое ведёт к увеличению микросателлитных последовательностей за счёт прибавления повтора, соотносится с количеством мутаций, которые приводят к уменшению количества повторов в микросателлитах человека как 10:4. Полиморфизм микросателлитов может определяться их локализацией и ориентацией в геноме. Вторичная структура ДНК рассматривается сегодня как причина экспансии микросателлитных последовательностей. Сама вторичная структура ДНК является производной термодинамических характеристик её последовательности. Расчёты термодинамических характеристик повторяющихся последовательностей позволили разработать ряд модельных систем, оценивающих способность микросателлитных последовательностей влиять на модификации ДНК, формируя разные вторичные структуры, связанные с нестабильностью микросателлитов.
Существует две группы маркеров, которые получают в результате PCR: первая - известна как STSs (sequence-tagged sites) с праймерами, сконструированными из известных последовательностей, и другая - которая базируется на свободных праймерах. Наиболее информативный или полиморфный STS-маркер появляется тогда, когда амплифицируется участок ДНК, который содержит последовательности микросателлитных повторов. Такой маркер, базируется на STS, и отмечен как simpl-sequence length polymorphism (SSLP) или sequence-tagged microsatellit site (STMS). Каждый STMS-маркер детектирует унаследованные по Менделю кодоминантные алели в единичном локусе в геноме.
Ключевые слова: микросателлитные последовательности, микросателлитные экспансии, ошибки репликации, нестабильность микросателлитов, маркеры на основе PCR.
UDC 616 - 006. 6 : 577. 2
High Informativeness of Molecular-Biological Markers
Kharchenko A. V.
Abstract. Relative saturation of genomes with any mictosatellite sequences is the result of influence of many factors, which all in all determine composite, structural and thermodynamic features of genomic mictosatellite sequences.
Mictosatellites may be formed in two ways. One of the resources of evolution of simple repeats in eukaryotes is poly (A)-tracks. The latter are located at the 3'ends of such mobile elements.
The second potential possibility of formation of mictosatellite sequences consists in replicative extension or shortening of protomicrosatellites, which can be formed in the genome due to mutative events. Such mictosatellites must have minimal number of repeats (3-5) to change its length due to formation of bulges during the transcription. Generally, the number of long mictosatellite repeats is not big. Only 12 % of all mictosatellites in human genome, for example, have more than 40 nucleotides.
But there is a possibility of transformation of single mictosatellite repeat into composite one, consisting of two sequences with different replicable motives. This may occur due to mutations in one of the repeats and its duplication due to replication errors. Mictosatellites can be presented in the genome everywhere, both in noncoding and coding sequences, affecting transcriptional activity.
Polymorphism of mictosatellites can be identified by their morphological characteristics. The difference in the degree of polymorphism between various mictosatellites may depend first on the length of mictosatellite sequence itself.
The majority of mictosatellite mutations are associated with insertions or deletions of specific repeats, emerging during replication. Such disorder of stability of mictosatellites more often occurs due to formation of bulges on DNA during replication ("slippage").
Intensive extension of mictosatellite sequences due to replication errors is called mictosatellite expansion. The ability of repeats to expansion depends on the length of mictosatellite sequence. The relations between mutative events, leading to expansion of mictosatellite sequences due to addition of a repeat, correlates with number of mutations, which lead to reduction of repeats in human mictosatellites as 10:4.
In some of mictosatellite repeats the replication errors are mostly associated with 3'-end: (GA)n and (CA)n, and in another ones with 5'-end - (CG)n and (CT)n. In trinucleotide GC-multiple repeats the proximal 3'-end, relative to the direction of replication, has positive impact on the frequency of replicative error. Despite the fact that a bulge at the 3'-end originates during each replicative tour, this error 99 % is corrected by the system of reparation. Change in length of mictosatellite sequence is occurred once per 100 replications.
Among trinucleotide repeats these properties are ultimately presented by GC-multiple repeats, too, such as (CAG)n, (CTG)n, (GGC)n and (GCC)n. The pattern and regularities of distribution of these trinucleotide microsatellites in the genome is of special interest due to the role they play in the development of oncologic diseases. Currently, they are the most examined mictosatellite sequences. They are assigned to the number of most expressed in the coding regions of human genome.
Likewise, instability of dinucleotide mictosatellites is connected with development of certain oncologic disease. Replicative errors in dinucleotide repeats are more often related to deletions, which lead to reading frame shifting.
Study of the mechanisms, which lead to mutative events in mictosatellite sequences, showed that these events, both in normal and malignant cells, are based on the same mechanisms.
Number of point mutations is confirmed in the mictosatellite DNA at one level, regardless of its characteristics. But in mictosatellites themselves, there are zones where such mutations emerge more often. There are three mechanisms, producing mutations in these sequences: insertion, deletion, replacement and disorder of replicable motive.
Polymorphism of mictosatellites can be identified by their localization and orientation in genome. The secondary structure of DNA is currently viewed as the cause of expansion of mictosatellite sequences. The secondary structure of DNA itself is the derivative of thermodynamic characteristics of its sequence.
The secondary bulge-type structures in mictosatellite sequences, identified by their thermodynamic characteristics, can initiate the phenomenon of expansion of mictosatellite repeats. The more stable these bulges, the lower is the risk of formation of new mictosatellite repeats. CAG/CTG and GAC/GTC- triduplex sequences have equal number of hydrogen couplings, but are distinguished by the strength of dense relationships. This is enough to make the first of them more vulnerable for expansion of mictosatellite repeats. Stability of bulge increases in the following direction: GTC < CAG < GAC < CTG, on the contrary, the frequency of formation of new repeats decreases in the similar direction: GTC > CAG > GAC > CTG.
Calculations of thermodynamic characteristics of replicable sequences allow developing number of model systems, evaluating the ability of mictosatellite sequences to influence the DNA modifications, forming various secondary structures, related to phenomenon of expansion of mictosatellite repeats.
Types of markers, obtained as a result of PCR, are divided into two groups on the basis of primers' design: the first group is known as STSs (sequence-tagged sites) with primers, constructed from known sequences, and the second one is based on the random primers. The most informative or polymorphic STS-marker emerges during amplification of DNA-area, containing sequences of mictosatellite repeats. This marker is based on STS, and is marked as simple-sequence length polymorphism (SSLP) or sequence-tagged microsatellite site (STMS). Each STMS-marker detects inherited Mendelian codominant alleles in single locus in genome.
Keywords: mictosatellite sequences, mictosatellite expansions, replication errors, mictosatellite instability, PCR-based markers.
Рецензент - проф. Цебржинський О. I.
Стаття надшшла 10. 05. 2014 р.
