CC BY
82
УДК: 619: 636.598: 616.34-002
ВИРУСНЫЙ ЭНТЕРИТ ГУСЕЙ.
ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА И СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОФИЛАКТИКА
П. С. ЮРКО, Р. А. КУЛИБАБА
Институт животноводства Национальной академии аграрных наук Украины с. Борки, Змиевской район, Харьковская обл., Украина, 63421
(Поступила вредакцию 18.11.2013)
Резюме. Применение стандартных методов (изучение клинических симптомов и патологоанатомических изменений) в комплексе с дуплексной полимеразной цепной реакцией позволяют провести дифференциальную диагностику вирусных энтеритов гусей и установить наличие генома вируса-возбудителя (парвовирус/полиомавирус). Показана эффективность использования ПЦР в качестве метода контроля инактивации парвовируса и контроля контаминации полиомавирусом при изготовлении вакцины против болезни Держи.
Ключевые слова: вирусный энтерит гусей, полиомавирус, парвовирус, дуплексная ПЦР, инактивированная вакцина.
Summary. The article is considering the difficulties of diagnosing goose viral enteritis of different etiologies. The combined approach using the polymerase chain reaction, which allows accurate diagnosis is proposed. Using the polymerase chain reaction for control of efficiency ofparvovirus inactivation and polyomavirus contamination in the production of a vaccine against the Derzsy's disease is shown.
Key words: goose viral enteritis, polyomavirus, parvovirus, duplex PCR, inactivation, inactivated vaccine.
Введение. Значительный экономический ущерб животноводству в целом и птицеводству в частности наносят инфекционные заболевания за счет гибели молодняка, получения слабого поголовья, проведения лечебных и карантинных (ограничительных) мероприятий. В борьбе с вирусными заболеваниями строгое соблюдение ветеринарно-санитарных норм является недостаточно эффективным мероприятием для сохранения здоровья животных. В данном случае обязательной является профилактическая вакцинация.
Анализ источников. Одним из наиболее опасных заболеваний в гусеводстве является вирусный энтерит - болезнь молодняка гусей, вызывающая гибель до 100 % [14].
Заболевание распространено во многих европейских странах, а также в США, Китае, Израиле, России и Украине [6].
Клинические признаки характеризуются анорексией, полидипсией, истечениями из носа и глаз, нервными явлениями, потерей пера в области головы и шеи, поносом и «пингвиньей походкой». Для патологоанатомической картины характерными являются гепато-нефро-асцитный синдром, ринит, кутикулит, катаральный, фибринозный или геморрагический энтерит [1, 5, 12].
Согласно научным исследованиям, кроме болезни Держи, клиническая и патологоанатомическая картина вирусного энтерита наблюдается при другом заболевании - геморрагическом нефрит-энтерите гусей [6, 10, 14]. Возбудитель болезни Держи - парвовирус (Goose Parvovirus, GPV), геморрагического нефрит-энтерита - полиомавирус (Goose Hemorrhagic Polyomavirus, GHPV) [18].
Сходство как самих вирусов (морфология, механизмы транскрипции и репликации, размер генома), так и клинической картины ими вызванных патологоанатомических изменений приводят к трудностям точной дифференциальной диагностики. Такие вирусологические методы, как заражение ин-тактных гусят, эмбрионов или культур клеток, не позволяют различить данные вирусы, так как изменения ими вызываемые также сходны. Единственно возможный выход (на данный момент) - применение современных молекулярно-генетических методов, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР). Согласно литературным данным, благодаря использованию полимеразной цепной реакции в 2000 году был идентифицирован этиологический агент (полиомавирус) геморрагического нефрит-энтерита гусей, заболевания, описанного еще в 1969 году [10].
Следует отметить, что до этого времени неправильно установленный диагноз приводил к использованию неэффективных лечебно-профилактических мероприятий (например, применение гипериммунных сывороток к парвовирусу, которые неэффективны при геморрагическом нефрит-энтерите гусей).
Профилактика вирусного энтерита гусей основана как на строгом соблюдении ветеринарно-санитарных норм, так и обязательном проведении вакцинации. Против болезни Держи живые и инак-
тивированные биопрепараты разработаны в Венгрии, Франции, Дании, Японии и России. Они применяются для вакцинации суточных гусят и перед началом продуктивного периода гусей [4]. Против геморрагического нефрит-энтерита гусей в Венгрии разработана рекомбинантная субъединичная вакцина для вакцинации гусят [16], во Франции - инактивированная карбопол-адъювантная вакцина для родительских стад [17]. Следует отметить, что использование вакцин против болезни Держи не обеспечивает защиты против геморрагического нефрит-энтерита гусей и наоборот.
У живых и инактивированных вакцин есть свои преимущества и недостатки. Преимуществами инактивированных вакцин являются стабильность, способность вызывать более длительный иммунитет, невозможность реверсии вируса и загрязнения окружающей среды патогенами [2]. Кроме того, немаловажным является, чтобы применяемый биопрепарат был безопасным, эффективным и не кон-таминированым бактериями, грибами или вирусами. Контроль качества биопрепаратов проводится в соответствии с нормативными документами GMP (Good Manufacturing Practice, надлежащая производственная практика), а также государственными стандартами [3, 7].
Развитие современных методов технологии изготовления вакцин требует усовершенствования мето -дов контроля биопрепаратов. В данном случае применение ПИР является перспективным в качестве контроля инактивации вакцин при условии применения инактиванта, действие которого направлено на нуклеиновую кислоту, а также контроля контаминации биопрепаратов сторонними вирусами [8, 15].
Так, согласно литературным данным, показана высокая эффективность применения ПЦР как метода контроля инактивации при производстве вакцины против гепатита А [13] и контроля контаминации вирусом ретикулоэндотелиоза вакцины против оспы птиц [11].
На территории Украины парвовирусный энтерит гусей (болезнь Держи) широко распространен, в связи с чем профилактическая вакцинация против него обязательна. Однако в последние годы наблюдается гибель гусят месячного возраста на фоне привитого родительского стада [6].
В Украине в Институте животноводства (отделении птицеводства) НААН для профилактики болезни Держи разработана и производится инактивированная вакцина против вирусного энтерита гусей (регистрационное удостоверение № ВВ-00337-02-11 от 01.07.2011 года), контроль которой проводится с использованием стандартных затратных методов. В 2012 году разработан метод дуплексной ПЦР, который позволяет определить наличие геномов возбудителей (парвовирус/полиомавирус) вирусного энтерита гусей в одной пробирке.
Таким образом, исходя из всего вышеизложенного, разработка и применение комплексного подхода с использованием современных молекулярно-генетических методов для диагностики вирусных заболеваний и при изготовлении средств их профилактики является насущной необходимостью.
Цель работы - апробация комплексного метода дифференциальной диагностики энтерита гусей разной вирусной этиологии, а также осуществление контроля контаминации и эффективности инактивации при изготовлении инактивированной вакцины против вирусного энтерита гусей (болезнь Держи) с использованием полимеразной цепной реакции.
Материал и методика исследований. Исследования проводили в лаборатории профилактики заболеваний птицы и молекулярной диагностики Института животноводства НААН Украины.
Для проведения исследований использовали образцы тканей кишечника, печени и желудка, сердца павших гусят; культуральную вируссодержащую жидкость.
ДНК из биологического материала выделяли с помощью набора реагентов «Ускоренная пробопод-готовка» и «ДНК Сорб-В» (Амплисенс, Россия) согласно прилагаемым инструкциям. ПЦР проводили с помощью реагентов DreamTaq Green PCR MasterMix (2x) (ThermoScientific) с использованием программируемого термоциклера «Терцик» («ДНК-технология», Россия). Объем конечной смеси составил 20 цЬ, концентрация праймеров - 0,1 ^M. Для проведения ПЦР использовали праймеры, фланкирующие консервативный участок гена VP1 (GHPV) и VP3 (GPV). Для контроля контаминации использовали отрицательный контрольный образец. Амплификацию проводили согласно схеме (табл. 1).
Таблица 1. Программа амплификациидля проведения ПЦР
Стадия ПЦР Денатурация Отжиг Элонгация
Возбудитель 35 циклов
GPV 94°C (1 мин) 94°C (15 с) 50°C (30 с) 72°C (30 с) 72°C (5 мин)
GPV+ GHPV 94°C (5 мин) 94°C (45 с) 60°C (45 с) 72°C (45 с) 72°C (5 мин)
Электрофорез продуктов амплификации проводили с использованием 1,5 % агарозного геля в течение 45 мин. при 150 V. Амплифицированные фрагменты визуализировали с помощью бромида этидия в ультрафиолетовом спектре. Размер ампликонов определяли с использованием маркера мо-лекулярных масс М-100.
Культуру фибробластов эмбрионов гусей получали из кожно-мышечной ткани 14-16-суточных гусиных эмбрионов по общепринятой методике для получения культуральной вируссодержащей жидкости, титрации вируса и проведения последовательных пассажей после инактивации [9].
Культуральную вируссодержащую жидкость инактивировали этиленимином в концентрациях 0,15 и 0,2 % при постоянном перемешивании при температуре 37 °С (±0,5 °С) в течение 24, 36 и 48 часов.
Контроль вируссодержащей жидкости до и после инактивации осуществляли согласно «Инструкции по изготовлению и контролю инактивированной вакцины против вирусного энтерита гусей», ГОСТов Украины.
Результаты исследований и их обсуждение. Предлагаемый комплексный подход к дифференциальной диагностике вирусного энтерита гусей (рис. 1) включает в себя, кроме общепринятого наблюдения за птицей с целью изучения клинических симптомов и проведения вскрытия для установления патологоанатомических изменений, также применение разработанного нами метода дуплексной ПЦР. Благодаря применению дуплексной ПЦР впервые на территории Украины был идентифицирован поли омавирус гусей в гусеводческих хозяйствах.
Данный подход к проведению дифференциальной диагностики энтеритов гусей позволяет точно установить вирус-возбудитель заболевания и в дальнейшем провести эффективные меры борьбы и профилактики.
Рис. 1. Дифференциальная диагностика энтеритов гусей разной вирусной этиологии с использованием молекулярно-генетических методов исследований (схема)
Основным «нововведением» является использование ПЦР для детекции геномов вирусов-возбудителей энтеритов гусей. Наличие на электрофореграмме фрагментов ДНК размером 539 и 144 п.н. указывает на присутствие в пробе геномов как парво-, так и полиомавируса; только 539 п.н. -парвовируса; 144 п.н. - полиомавируса.
В течение 2012-2013 годов с использованием метода дуплексной ПЦР проведены исследования проб патологического материала, отобранных при клиническом и патологоанатомическом анализе гусят из 12 хозяйств 7 областей Украины, неблагополучных по вирусному энтериту. Геном поли ома -
вируса был выявлен в материале из 5 хозяйств Ивано-Франковской, Харьковской, Полтавской и Днепропетровской областей, что составляет около 40 % от всех исследованных хозяйств. Парвовирус был определен в хозяйствах Харьковской, Донецкой, Днепропетровской, Запорожской и Львовской областей, что свидетельствует о циркуляции патогенных штаммов на территории Украины.
Разработанная в Институте животноводства (отделение птицеводства) НААН инактивированная вакцина против вирусного энтерита гусей по результатам лабораторных и производственных испытаний позволяет получить устойчивых к болезни Держи гусят в течение 5-6 месяцев продуктивного периода [4].
Этапы производства вакцины, схематически показанные на рис. 2, включают получение культу-ральной вируссодержащей жидкости, инактивацию ее этиленимином и объединение с адъювантом. Контроль биопрепарата проводится согласно «Инструкции по изготовлению и контролю инактивиро-ванной вакцины против вирусного энтерита гусей», в соответствии с ГОСТами. Однако стандартные методы контроля контаминации сторонними вирусами и эффективности инактивации вируссодер-жащего материала с использованием серологических методов и клеточных культур трудоемкие и затратные. В связи с этим были проведены исследования по использованию полимеразной цепной реакции (рис. 2) в качестве контроля контаминации и инактивации. Методом дуплексной ПЦР проведен контроль контаминации вируссодержащего материала при изготовлении инактивированной вакцины против вирусного энтерита гусей (болезни Держи). Для определения эффективности инактивации применяли ПЦР для детекции генома парвовируса в образцах инактивированной вируссодержащей жидкости.
В результате проведенных исследований по контролю контаминации методом дуплексной ПЦР вируссодержащего материала на этапах «освежения» штамма и после накопления культуральной вируссодержащей жидкости перед инактивацией установлено, что материал не заражен наиболее вероятным и опасным для гусей полиомавирусом и может быть использован для изготовления инактивированной вакцины. Согласно приведенным выше литературным данным (что подтверждается нашими исследованиями), в связи с широким распространением полиомавируса и сходством его свойств с парвовирусом гусей существует необходимость контроля контаминации им при изготовлении вакцины для профилактики болезни Держи, что позволит получить качественный и эффективный против данного заболевания биопрепарат.
Рис. 2. Схема изготовления инактивированной вакцины против вирусного энтерита гусей (болезни Держи) и ее контроля с использованием полимеразной цепной реакции
Контроль инактивации проводили ПЦР и параллельно путем последовательных пассажей в культуре фибробластов эмбрионов гусей. При внесении инактивированного 0,2 % этиленимином вируса в культуру клеток не наблюдалось цитопатического действия уже через 24 часа после начала инактивации, в то время как при использовании этиленимина в концентрации 0,15 % вирус инактивировался
полностью только через 48 часов, что соответствовало результатам полимеразной цепной реакции. При полной инактивации вируса амплификации как таковой не происходит, что приводит к отсутствию специфического фрагмента на электрофореграмме (539 п.н. для парвовируса). В то же время при частичной (неполной) инактивации амплификация проходит успешно, что приводит к детекции генома парвовируса. Контроль эффективности инактивации путем проведения последовательных пассажей в культуре клеток занимает более 30 дней, в то время как результаты ПЦР известны уже через 8-10 часов.
Таким образом, применение комплексного подхода, включающего в себя использование общепринятых и современных методов исследования, позволяет установить точный диагноз, а также провести качественный контроль при изготовлении профилактических препаратов. Как видно на примере с энтеритами гусей разной вирусной этиологии, в результате учета клинических, патологоанатомиче-ских данных и детекции генома вирусного агента (парвовирус/полиомавирус) при помощи дуплексной ПЦР можно дифференцировать два таких сходных заболевания, как болезнь Держи и геморрагический нефрит-энтерит гусей. При производстве инактивированной вакцины использование данного подхода для контроля контаминации и эффективности инактивации является наиболее эффективным и целесообразным, что позволяет получить качественный и безопасный биопрепарат с минимальными затратами.
Заключение. 1. Предлагаемый комплексный подход с использованием дуплексной ПЦР позволяет эффективно дифференцировать вирусные энтериты гусей (болезнь Дерджи и геморрагический нефрит-энтерит).
2. Применение ПЦР для определения эффективности инактивации парвовируса и контроля контаминации вируссодержащего материала полиомавирусом при изготовлении инактивированной вакцины против болезни Держи является эффективным и целесообразным по сравнению с культуральными и серологическими методами.
3. В связи с широким распространением на территории Украины геморрагического нефрит-энтерита возникает необходимость в создании отечественной вакцины.
ЛИТЕРАТУРА
1. Болезни домашних и сельскохозяйственных птиц / под ред. Б. У. Кэлнека // М.: «Аквариум бук». - 2006. - С. 896-900.
2. Використання живих та шактивованих вакцин для профшактики в1русних хвороб птищ / В. Борисов, О. Борисов,
C. Старов [таш.] // Ветеринарна медицина Украши. - 1999 р. - № 1 - С. 10-11.
3. ДСТУ 4517:2006 Препарати ветеринарш ¿мунобюлопчш. Метода виявлення контамшаци стороншми в1русами // Держспоживстандарт Украши. - Кигв. - 2007. - 10 с.
4. 1нактивована вакцина проти BipycHoro ентериту гусей. Лабораторш та виробнич1 випробування / П. С. Юрко, I. Ю. Безрукава, Г. В. Бшецька [та iH.] // Ветеринарна бютехнолопя. Наук.-техн. бюл. - Ки1в. - 2010. - № 17. - С. 29-34.
5. Качанова, С. П. Вирусный энтерит гусят / С. П. Качанова // Ветеринария. - 1983. - № 8. - С. 15-23.
6. Кулибаба, Р. А. Молекулярная диагностика энтеритов гусей разной вирусной этиологии / Р. А. Кулибаба, П. С. Юрко, А. В. Белецкая // Сучасне птах1вництво. -№ 9 (118). - 2012 р. - С. 9-14.
7. Надежна виробнича практика та надежна дистриб'юторська практика ветеринарних препарапв/ За ред. А. М. Головка, П. I. Вербицького // К.: Реферат. - 2003. - 96 с.
8. Способ технологического контроля полноты инактивации убитых вакцин при использовании в качестве инактиватора сернокислой меди. Патент Российской Федерации № 2089893 / С. Ж. Цыбанов, В. И. Жестерев, Н. И. Закутский [и др.] // М. - 1997.
9. Сюрин, В. Н. Руководство по ветеринарной вирусологии / В. Н. Сюрин // М.: Колос. - 1966. - 681 с.
10. A novel polyomavirus goose hemorrhagic polyomavirus is the agent of hemorrhagic nephritis enteritis of geese / J. Guerin, J. Gelfi, L. Dubois [et al] // J. of Virol. - 2000. - V. 74(10). - P. 4523-4529.
11. Detection of reticuloendotheliosis virus as a contaminant of fowl pox vaccines / A. M. Awad , H. S. Abd El-Hamid , A. A. Abou Rawash [et al] // Poultry Science. - 2010. - V. 89. - P. 2389-2395.
12. Diseases of poultry / editor-in-chief, Y.M. Saif. - 12th ed., Blackwell Publishing Ltd. - 2008. - 1409 p.
13. Effective inactivation test of inactivated hepatitis A vaccine using integrated cell culture/strand-specific reverse transcriptase-polymerase chain reaction / J. Zhou, G. Ji, J. Wen [et al] // Chinese Journal of Experimental and Clinical Virology. - 2008. -V. 22(6). - P. 488-491.
14. Palya, V. Major viral disease of waterfowl and their control / V. Palya // International Poultry Production. - 2011. -V. 19(4). - P. 21-26.
15. Quantitative PCR: a quality control assay for estimation of viable virus content in live attenuated goat pox vaccine /
D. Kallesh, M. Hosamani, V. Balamurugan [et al] // Indian Journal of Experimental Biology. - 2009. - V. 47. - P. 911-915.
16. Recombinant subunit vaccine elicits protection against goose haemorrhagic nephritis and enteritis / T. Mato, Z. Penzes, P. Rueda [et al] // Avian Pathol. - 2009. - V. 38(3). - P. 233-237.
17. Safety and efficacy of an inactivated Carbopol-adjuvanted goose haemorrhagic polyomavirus vaccine for domestic geese / J. Gelfi, M. Pappalardo, C. Claverys [et al] // Avian Pathol. - 2010. - V. 39(2). - P. 111-116.
18. Viral infections in goose flocks in Poland / W. Kozdrum, G. Wozniakowski, E. Samorek-Salamonowicz [et al] // Polish Journal of Veterinary Sciences. - V. 15(3). - 2012. - P. 525-530.
