CC BY
19УДК:632.38:633.1(477)
ВИРУСНЫЕ БОЛЕЗНИ ЗЕРНОВЫХ НА ЮГЕ УКРАИНЫ И.И. Гуляева*, Г.А. Снигур**, В.П. Полищук***, Б.Н. Милкус*
*Одесский государственный аграрный университет **Киевский национальный университет им. Тараса Шевченко ***Институт защиты растений УААН, Киев
На посевах пшеницы и ячменя на юге Украины обнаружены вирусы желтой карликовости ячменя, полосатой мозаики пшеницы, мозаики костра и карликовости пшеницы. Часто наблюдалась смешанная инфекция. Вирусы идентифицированы с помощью иммуноферментного анализа и ПЦР. Показана зависимость степени заражения растений вирусами от сроков сева.
Ключевые слова: вирус желтой карликовости ячменя, вирус полосатой мозаики пшеницы, вирус мозаики костра, вирус карликовости пшеницы, иммуноферментный анализ, полимеразная цепная реакция.
Вирус желтой карликовости ячменя (ВЖКЯ) - один из наиболее опасных возбудителей заболеваний зерновых культур в мире. Заболевание вызывает комплекс различных штаммов вируса желтой карликовости ячменя (BYDV-MAV и BYDV-PAV) и вируса желтой карликовости зерновых (CYDV-RPV). Вирус находится во флоэме и переносится тлями (D'Arcy et al., 1999). Штаммы BYDV- PAV распространены во многих странах. В Украине ВЖКЯ на посевах зерновых обнаружен Г.А.Снигур (1996). Визуально диагностировать ВЖКЯ невозможно, так как аналогичные симптомы могут быть вызваны другими вирусами, грибами, а также абиотическими факторами (Irybirt., Tresh, 1992). Заболевание часто бессимптомно, концентрация вируса в растении низкая (Кастальева и др., 1966).
Вирус полосатой мозаики пшеницы (ВПМП), который переносится клещом АсегИа ШИрае, был обнаружен в 1960-е годы в республиках б. СССР (Развязкина и др., 1963) и в Румынии (Pop, 1962), а в начале 1970-х гг. он был выявлен во многих странах. В Украине ВПМП обнаружен Л.Т.Мищенко (2006). В последние годы широкое распространение этого вируса отмечено в южно-европейских странах (Rabenstein еt al., 2002; Bakardjieva et al., 2004), причем у восьми генотипов установлена передача ВСМП семенами от 0.5 до 1.5% (Janes et al., 2005).
На многих зерновых культурах вирус
мозаики костра (ВМК) вызывает симптомы хлоротичности, мозаики и деформации листьев, задержку роста и кустистость. Стойкая циркуляция ВМК в природе осуществляется с помощью имаго и личинок пьявицы (Ои1ета те1апориБ), способных переносить вирус, и дикорастущих однодольных сорняков, произрастающих в посевах зерновых культур. ВМК заражает виды растений из семейства Огаттеае, из двудольных в круг его хозяев входят растения из шести семейств. В природе вирус сохраняется в многолетних сорняках - резерваторах: Вготш ШеггшБ, ЛедПорБ суИпСпса и других (Цыпленков, 1999). При достаточно широкой специализации ВМК, в т.ч. на культурных растениях, вредоносность вируса документально пока не доказана.
Представители подотдела цикадок (ССасСша) вредят зерновым больше в южных регионах Украины, причем большой вред они наносят именно в качестве переносчиков вирусов. В последние годы представители семейства цикадок (СсаСеШСае), и в первую очередь вид РБатто1еШх аНепиБ, приобрели большую значимость при выращивании зерновых в Европе, поскольку они повреждают растения при питании и переносят вирус карликовости пшеницы - ВКП (Бой-ко,1990). ВКП распространен также и в СНГ, хотя сведений относительно распространения его в Украине недостаточно.
Впервые он был обнаружен на ТгШсит
aestivum в б. Чехословакии в 1961 году. Он вызывает характерные симптомы на следующих растениях: Avena sativa - пожелтение и карликовость, Hordeum vulgare -пожелтение, карликовость и снижение урожая, Lolium multiflorum, Poa annua -угнетение роста, Secale cereale, Triticum aestivum - пожелтение и сильную карликовость.
ВКП передается персистентно с помощью уникального вектора - цикадки Psammo-tettix alienus. Вирус сохраняется во время линьки и не размножается в организме вектора, а в процессе размноже-
Методика
Для выявления вирусов, которые поражают озимую и яровую пшеницы, озимый и яровой ячмень в хозяйствах Ананьевского, Килийского, Беляевского и Овидиопольского районов Одесской области, а также в Херсонской и Николаевской областях, были обследованы посевы по следующей схеме: по диагонали поля на каждых 100 га посева выделяли 8-10 учетных участков размером 0.5 х 0.5 м, на которых отбирали растения с симптомами вирусных и вирусоподобных заболеваний, а также внешне здоровые растения. Отбор образцов для последующей идентификации вирусов проводили во второй декаде мая. Собранные образцы высушивали и хранили при комнатной температуре, а также в замороженном виде при температуре -18°С.
Для идентификации вирусов применяли «сэндвич-метод» иммуноферментного анализа с использованием диагностических наборов, полученных из Института биоорганической химии имени М.М.Шемякина ИБХ (Россия). Наборы включали мо-ноклональные антитела и конъюгаты с пероксидазой 4В5 и 4В5-ПХ для выявления штаммов PAV и SGV вируса желтой карликовости ячменя и 4В6 и 4В6-ПХ для выявления штаммов MAV, RPV и RMV этого же вируса. В качестве экстрагирующего буфера использовали 0.1М фосфатный буфер рН 7.0. Учет результатов реакции проводили на приборе DYNATEC (США) при 492 нм.
Для определения вирусов (ВЖКЯ, ВПМП, ВШМЯ, ВКП и ВМК) использовали коммерческие диагностические наборы фирм Agdia (США) и Loewe (Германия). В связи с тем, что поликлональные антитела были конъюгированы с щелочной фосфатазой, продукт ферментативной реакции измеряли при 405 нм. Реакцию считали позитивной в том случае, если показатель оптической плотности при анализе тестируемых растений превышал отрицательный контроль не меньше чем в 2 раза (Ан-
Результаты
В результате маршрутных обследований посевов зерновых культур на юге
ния цикадки не передается потомкам. ВКП не переносится механически, в результате контакта растений, семенами и пыльцой (Бойко, 1989).
Таким образом, эпидемиология ВКП очень тесно связана с географическим распространением его вектора, который, в основном, распространен в странах южной и восточной Европы в условиях сравнительно теплого и мягкого континентального климата.
Цель исследований заключалась в выявлении вирусов зерновых на посевах озимой и яровой пшеницы и озимого и ярового ячменя на юге Украины.
исследований
титела 1. 1991(а)., Антитела 2., 1991(b)., Шпаар, 2004).
Для детекции вируса карликовости пшеницы применяли ПЦР, использовали универсальные видо-специфичные праймеры: Wdv- forward 468-487 5'ATCCCGGGTCCTCCGACTAC-3' и Wdv-reverse 477-458 5'- GACCCGGGATCGTAAGGGGC- 3' (Цыпленков, 1999). Листья злаковых культур (пшеницы, ячменя и дикорастущих злаков) отбирали на растениях, которые, как было установлено в ИФА, были заражены ВКП. Выделение ДНК проводили по методике D.Shepherd et al. (2008) с помощью набора Extract-n-amptm Plant PCR kit (Sigma, США). Навески листьев (приблизительно 30-50 мг) переносили в пробирки эппендорф, добавляли экстрагирующий буфер объемом 50 мкл и нагревали в течение 10 мин при 95°С. Затем добавляли буфер для разведения объемом 50 мкл, после чего образец либо хранили при -20°С, либо сразу использовали для проведения ПЦР. ПЦР проводили по стандартной методике с использованием пары универсальных прайме-ров.
Для проведения ПЦР использовали 3 мкл ДНК, выделенной описанным выше способом. Реакционная смесь содержала 20 пкмоль праймеров, 200 пкмоль каждого дНТФ, реакционный буфер для ПЦР и 2.5 ед/мл Taq-полимеразы (Fermentas, Латвия) (Shepherd et al., 2008).
Амплификацию проводили в следующем режиме: 94°С - 4 минуты (94°С - 30 сек., 56°С - 30 сек., 72°С - 3 мин. 30 сек.) - 40 циклов, 72°С - 10 минут. Результаты амплификации проверяли с помощью горизонтального электрофореза в 1% агарозном геле Virus Taxonomy 2005 с помощью прибора «Хийу-Калур» (Латвия) и трансилюминатора (Bio-rad, США) с использованием стандартных маркеров Gene Ruller 100 bp DNA Ladder plus (Fermentas, Латвия) с последующим фотографированием гелей в ультрафиолетовом свете.
исследований
Украины обнаружены растения с симптомами вирусной инфекции. Идентифика-
ция вирусов проведена с помощью различных тест-систем. Использование тест-системы с моноклональными антителами позволило обнаружить в посевах изучаемых культур в Одесской области обе группы штаммов ВЖКЯ: PAV+SGV и MAV + RPV + RMV. Установить наличие каждого из штаммов в отдельности было невозможно, так как тест-система была получена на группы штаммов.
Тест -системы к штаммам ВЖКЯ, полученные в лаборатории вирусологии Киевского национального университета имени Т.Г.Шевченко на основе поликлональ-ных антител, подтвердили возможность их использования для диагностики ВЖКЯ, который был обнаружен на посевах озимой пшеницы сортов Одесская 267, Селянка, Знахидка Куяльник; на яровом ячмене сорта Вакула и на озимом ячмене сортов Основа и Абориген. В результате проведенных исследований было установлено, что поражение растений ВЖКЯ составило 41.4%. Чаще всего вирус обнаруживали в Беляевском районе Одесской области.
Вирусы полосатой мозаики пшеницы и вирус мозаики костра были обнаружены
Вестник защиты растений, 3, 2013 на сортах озимой пшеницы Альбатрос Одесский, Одесская 267, Знахидка, Куяльник и Селянка, а также на сортах озимого ячменя Основа и Абориген. Процент растений, зараженных этими вирусами, почти не различался и составил для ВПМП 44.8%, а для ВМК 48.2%. Однако степень распространения ВПМП и ВМК в обследованных районах Одесской области была разной. Так, в хозяйствах Ананьев-ского, Беляевского и Овидиопольского районов идентифицировано 3 вируса (ВЖКЯ, ВПМП, ВМК), а в посевах Килий-ского района обнаружен только ВМК.
Исследования показали наличие смешанной инфекции ВПМП + ВМК и ВПМП + ВМК + ВЖКЯ. 7 образцов было поражено одновременно ВПМП и ВЖКЯ и только 3 образца поражены совместно ВЖКЯ и ВМК. Результаты идентификации вирусов зерновых при разных сроках сева показали 100% поражение озимой пшеницы ВЖКЯ, высеянной в конце сентября. При более поздних сроках сева озимой пшеницы пораженность ВЖКЯ была намного ниже. Однако озимый ячмень при последнем сроке в начале ноября оказался больше всего заражен ВЖКЯ, ВПМП и ВМК (табл. 1).
Таблица 1. Выявление вирусов на пшенице и ячмене разных сроков сева
Сроки сева пшеницы
Сорта 25.09.07 5.10.07 15.10.07 25.10.07
ВПМП ВЖКЯ ВМК ВПМП В^ККЯ ВМК ВПМП В^ККЯ ВМК ВПМП ВЖКЯ ВМК
Одеская 267 - + - - - - - - + - + -
Селянка - + - - + + + - + - - +
Знахидка - + - + - - + - + - - -
Куяльник - + - + - - + - - + - +
Сроки сева ячменя
10.10.07 17.10.07 20.10.07 1.10107
Основа + + + - - - - + - + + +
Абориген - - - - - + - - + + + +
Это может быть связано с плохим физиологическим состоянием растений из-за очень позднего срока сева, вследствие чего имела место более высокая восприимчивость их к заражению вирусами. Не исключено, что озимый ячмень позднего срока сева был заражен вирусами в весенний период вегетации. Представляет интерес и тот факт, что ВПМП и ВМК сильнее заражали озимую пшеницу, посе-
янную 15 октября, но при этом на этих же растениях не был выявлен ВЖКЯ. Возможно, это оптимальный срок сева озимых зерновых культур на юге Украины для их защиты от заражения ВЖКЯ. Однако при этом складываются условия, благоприятные для заражения другими вирусами.
Таким образом, на посевах пшеницы и ячменя в ряде районов Одесской области были обнаружены как смешанное зараже-
ние ВЖКЯ + ВПМП + ВМК, ВПМП + ВМК, так и отдельно - ВЖКЯ, ВПМП и ВМК. Последующее изучение сроков сева пшеницы и ячменя позволит рекомендовать более оптимальные для снижения вредоносности распространенных вирусов, а также выявить вредоносность каждого из них и при смешанной инфекции.
Полученные результаты представляют интерес и в связи с тем, что в литературе нет статистических данных относительно распространения вируса карликовости пшеницы в агроценозах юга Украины. Нашей целью было не только выявить наличие вируса, но и установить распространение данного заболевания.
В результате проведенных исследований обнаружено, что в разных районах юга Украины очень распространены симптомы заболевания, типичные для ВКП -пожелтение листьев, задержка роста и карликовость растений. Обычно процент пораженных растений и степень их поражения были разными. Таким образом, нами впервые в 2009 г. выявлен ВКП в Одесской области на пшенице (сорта Селянка, Кнопа, Знахидка одесская, Куяль-ник, Одесская 267) и ячмене (сорта Метелица, Абориген, Росава, Основа) и на диких злаках (ПвзсЬатрз1а р,), причем ВКП был обнаружен в Херсонской и Одесской областях.
Также изучено заражение ВПК различных сортов зерновых в зависимости от способов и сроков их сева (табл. 2 и 3).
Таблица 2. Выявление ВКП на озимом ячмене методом ИФА (2009 г.)
Сорта Методы и сроки сева
Сеялочный посев Широкорядный
2.10.08 12.10.08 12.10.08
Росава - + +
Основа - + +
Тамань - - -
Метелица + - -
Абориген + - -
Анализ полученных результатов позволяет сделать вывод о том, что ВКП на озимом ячмене обнаружен на сортах Ро-сава, Основа, Метелица, Абориген.
Озимый ячмень был посеян обычным и
широкорядным способом. При обычном посеве ВКП был обнаружен на сортах Метелица и Абориген 2.10.08 срока сева, Росава и Основа 12.10.08 срока сева. При широкорядном севе 12.10.08 ВКП был обнаружен на сортах Росава и Основа. На сорте Тамань ВКП не проявился вообще, что, по-видимому, может свидетельствовать о его невосприимчивости к этому вирусу.
Полученные результаты позволяют также судить об отсутствии связи между способом, сроком сева зерновых культур и их пораженностью ВКП. Следует отметить, что и в производственных посевах, в частности в Коминтерновском и Беляев-ском районах Одесской области, ВКП был обнаружен на сортах Основа 20.09.08 срока сева и Росава 2.10.08 срока сева соответственно. Следовательно, основным способом борьбы против ВКП на озимом ячмене должен быть выбор устойчивых сортов.
Таблица 3. Выявление ВКП на озимой пшенице, 2009 г.
Сорта Сроки сева в 2008 г.
5.09 15.09 25.09 5.10 15.10 25.10
Одесская 267 - + + - - -
Селянка + - - - - -
Кнопа + + - - - -
Знахидка од. + + - - - -
Куяльник + + + - - -
Тестирование образцов озимой пшеницы показало, что в отличие от озимого ячменя, который оказался зараженным при посеве в оптимальный срок (10-15.10), на пшенице ВКП обнаружен не был. Он был обнаружен лишь с 5.09 по 25.09. Это подтверждает важность срока сева зерновых. Об этом свидетельствуют также данные таблицы 3: ВКП был выявлен при посеве 5.09 на сортах Селянка, Кнопа, Знахидка Од., Куяльник; 15.09 на сортах Одесская 267, Кнопа, Знахидка Од., Куяльник; 25.09 на сортах Одесская 267, Куяльник, а 5.10, 15.10, 25.10 сроках сева ВКП на вышеуказанных сортах обнаружен не был. В связи с этим основное внимание необходимо уделять своевременному севу зерновых колосовых культур (до или после массового лета переносчиков ВКП) и проведению агротехнических мероприятий по контролю за популяцией переносчиков этого виру-
са. Нами было также установлено, что ци-кадка Psammotettix аИепш была неспособна пережить суровую и длительную зиму 2009-
Вестник защиты растений, 3, 2013 2010 гг., поэтому уровень инфицированности посевов в 2010 г. оказался значительно ниже показателей прошлых лет.
Литература
Антитела 1. Методы / / под ред. Кетти Д.М., Мир, 1991(а), с. 68-92.
Антитела 2. Методы / / под ред. Кетти Д.М., Мир, 1991(Ь), с. 152-165.
Бойко А.Л. Влияние факторов внешней среды на вирусы, инфицирующие растения / / Сельскохозяйственная биология, 1989, 5, с. 120 - 125.
Бойко А.Л. Экология вирусов растений. Киев, Вища школа, 1990, 167 с.
Защита растений в устойчивых системах землепользования (в 4-х книгах) / / Под общей редакцией Д.Шпаара. Минск, 2004, 4, 345 с.
Кастальева Т.В., Ерохина Т.Н., Васильева Т.Я., Мо-жаева КА. Диагностика вируса желтой карликовости ячменя с помощью иммуноферментной тест-системы на основе моноклональных антител / / Докл. ВАСХНИЛ, М., 1963, 5, с. 19-21.
Мищенко Л.Т. Вирус полосатой мозаики пшеницы в Украине и его биологические свойства // Защита растений. Минск, 2006, 30, 1, с. 263-266.
Резвязкина Г.М., Карпова Е. А., Белянчикова Ю. В. Вирус полосатой мозаики пшеницы. // Защита растений от вредителей и болезней, 1963, 9, с. 54-55.
Цыпленков А.Е. Профилактика вирусных болезней зерновых культур // АГРО, 1999, 21, 4, с. 16-17.
Сшгур Г.А. Епщемюлопя вiрусiв зернових культур в агроценозах Украши. Автореф. канд. дисс. Ки!в, 2006, 20 с.
Bakardjieva Ы., Krasteva С., НаЬекшз А.,
Rabenstein F. Detection of cereal viruses and study of aphid population in Bulgaria / / Bulgarian J. Agricultural Science, 2004, 10, p. 161-164.
D'Arcy C..H., Domier L.L., Torrance L. Detection and diagnosis of luteoviruses / / Smith H.G., Barker H (eds). The Luteoviridae. CAB International Publishing, Oxford, UK., 1999, p. 147-168.
Irybirt M., Tresh J.M. Barley yellow dwarf virus epidemiology: a study in economical complexity // BYDV in West Asia and North Africa. (A.Commeau, K.M.Makkouk (eds). Syria. ICARD, 1992, p. 234-278.
Janes R.A.C., Coul Is.B.A., MacKie A.E., Dwyer G.I. Seed transmission of Wheat streak mosaic virus shown unequivocally in wheat / / Plant Dis., 2005, 89, 10, p. 1048-1050.
Pop I. Die Strichelvirose des Weizens in der Rumänischen Volksrepublik // Phytopathol., 1962, 43, s. 325-336.
Rabenstein R., Seifers D.L., Schubert J. Phylogene-se relationships, strain diversity and biogeography jri-tritimoviruses // J. Gen. Virol., 2002, 83, 6, p. 895-906.
Shepherd D., Martin D., Lefeuvre P., Monjane A., Owor B., Rybicki E., Varsani A. A protocol for the rapid isolation of full geminivirus genomes from dried plant tissue // J. of Virological Methods, 2008, 149, 1, p. 97-102.
Virus Taxonomy: The Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. (C.M.Fauquet, M.A.Mayo, J.Maniloff, U.Desselberger, L.A. Ball (eds). Academic Press, 2005, 1162 p.
VIRUS DISEASES OF GRAIN CROPS IN THE SOUTH OF UKRAINE I.I.Gulyaeva, G.A.Snigur, V.P.Polishchuk, B.N.Milkus Barley yellow dwarf virus, Wheat streak mosaic virus, Brome mosaic virus and Wheat dwarf virus were found on wheat and barley crops in the south of Ukraine. The mixed infection was often observed. Viruses were identified by means of the immunoferment analysis and PCR. Dependence of plant infection degree on sowing terms was shown.
Keywords: Barley yellow dwarf virus, Wheat streak mosaic virus, Brome mosaic virus, Wheat dwarf virus, immunoferment analysis, PCR.
И.И.Гуляева, аспирант Г.А.Снигур, к.б.н., virus@biocc.univ.kiev.ua В.П.Полищук, д.б.н., plant_prot@ukr.net Б.Н.Милкус, д.б.н., проф., bmilkus@ukr.net
