CC BY
85
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Сергей Васильевич Дидук1, Ксения Валерьевна Смирнова2, Владимир Эдуардович Гурцевич3
ВИРУС ЭПШТЕЙНА—БАРР: РЕГУЛЯЦИЯ СИГНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ОНКОГЕНА LMP-1 МУТАНТНЫМИ ВАРИАНТАМИ ЕГО ЛИТИЧЕСКОЙ ФОРМЫ (LYLMP-1)
1 К. б. н., научный сотрудник, лаборатория вирусного канцерогенеза НИИ канцерогенеза
РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)
2 К. б. н., научный сотрудник, лаборатория вирусного канцерогенеза НИИ канцерогенеза
РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)
3 Профессор, д. м. н., заведующий, лаборатория вирусного канцерогенеза НИИ канцерогенеза РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)
Адрес для переписки: 115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24, НИИ канцерогенеза РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Дидук Сергей Васильевич; e-mail: diduksv@rambler.ru
Белок LMP-1 является онкогеном вируса Эпштейна—Барр, экспрессия которого приводит к опухолевой трансформации клетки. Литическая форма LMP-1 (lyLMP-1) представляет собой укороченную форму того же белка, не обладающую трансформирующими свойствами и способностью подавлять онкогенную активность LMP-1. В данной работе показано влияние ряда часто выявляемых мутаций в lyLMP-1 на ингибирование ключевых сигнальных путей клетки. Эти наблюдения экспериментально подтверждают участие отдельных мутаций lyLMP-1 в регуляции активности вирусного онкогена LMP-1.
Ключевые слова: вирус Эпштейна—Барр, белок LMP-1 ВЭБ, lyLMP-1, сигнальные пути.
Расшифровка молекулярных механизмов опухолевой трансформации клетки под воздействием онкогенных вирусов человека представляет собой одну из наиболее актуальных проблем современных исследований в онкологии. Вирус Эпштейна—Барр (ВЭБ) в этом плане вызывает особый интерес, поскольку является убиквитарным герпесвирусом человека, который ассоциирован с широким спектром доброкачественных и злокачественных новообразований разного происхождения [1]. К их числу относятся лимфома Беркитта, лимфома Ходжкина, недифференцированный рак носоглотки и целый спектр опухолей лимфоидного происхождения, возникающих у больных на фоне иммунодефицитного состояния [2]. Из доброкачественных опухолей можно назвать инфекционный мононуклеоз и волосатоклеточную лейкоплакию полости рта [3].
Среди белков латентного цикла инфекции ВЭБ особое внимание привлекает интегральный мембранный белок — латентный мембранный белок ^МР-1), коди-
© Дидук С. В., Смирнова К. В., Гурцевич В. Э., 2011 УДК 576.385.5:578.825.13
руемый одноименным геном, который обладает важным трансформирующим потенциалом [4; 5]. Плейотропное действие этого вирусного онкогена на различные биологические процессы в клетке обусловлено его структурно-функциональными особенностями. Длинный С-концевой цитоплазматический домен LMP-1 играет ключевую роль в индукции множества клеточных сигнальных каскадов [6]. В этом домене локализуется две трансактивирующих области (С-концевая трансактиви-рующая область LMP-1 1-го типа — CTAR-1 и С-концевая трансактивирующая область LMP-1 2-го типа — CГAR-2)I принимающих непосредственное участие в активации транскрипционного фактора NF-kB, с-Лип ^концевой киназы (ЛЖ), STAT 1/3, р38 МАРК [6—8].
Ген LMP-1 характеризуется высокой степенью полиморфизма, с чем связано существование его многочисленных вариантов, выделяемых из опухолевой ткани больных с заболеваниями, ассоциированными с ВЭБ, в различных географических регионах. Экспериментально доказано влияние отдельных мутаций в LMP-1 на снижение его иммуногенного и цитотоксического воздействия на клетку [9]. Кроме того, выявлено, что некоторые
точечные замены, локализованные в разных доменах LMP-1, влияют на способность этого белка активировать ключевые сигнальные молекулы клетки [10—11]. Несмотря на активное изучение LMP-1, механизм влияния его отдельных мутаций на регуляцию онкогенной активности этого белка по-прежнему остается до конца не изученным.
Отдельные точечные мутации влияют и на экспрессию укороченной неонкогенной, так называемой лити-ческой формы белка — lyLMP-1. Белок lyLMP-1 экспрессируется с промотора ED-L1A вирусного генома, имеет молекулярную массу 45 кДа и определяется у больных с различными заболеваниями, ассоциированными с ВЭБ [12; 13]. Изучение возможного влияния мутаций на функциональные свойства этой формы вирусного онкогена представляет особый интерес. Известно, в частности, что белок lyLMP-1 при коэкспрессии с LMP-1 влияет на трансформирующие свойства последнего, подавляя активацию ряда ключевых сигнальных путей клетки, а также увеличивая время его деградации [14; 15].
В настоящей работе, используя метод котрансфекции, мы впервые показали влияние 3 точечных мутаций, выявленных в областях CTAR lyLMP-1, на его способность понижать активность транскрипционных факторов NF-kB и AP-1, индуцированных высоко- и низкотранс-формирующими вариантами онкогена LMP-1.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Плазмиды. Векторные конструкции pSG5-LMP-1-B95-8 и pSG5-LMP-1-Cao были любезно предоставлены проф. Ф. Грассером (Хомбург, Германия). Вариант гена LMP-1, имеющий тройную замену (S212G/S350A/ S366T, Triple) в составе вектора pSG5, получен от проф. С. Фукса (Пенсильвания, США). Варианты гена lyLMP-1 и lyLMP-1-Triple получены на основе полноразмерных вариантов гена LMP-1-B95-8 и LMP-1-Triple с использованием искусственного мутагенеза. Для анализа активации транскрипционного фактора NF-kB применяли репортерную плазмиду pkB-ConA-Luc, любезно предоставленную проф. Ф. Грассером (Хомбург, Германия). Для анализа активации JNK сигнального пути использовали ]'ип2-люциферазную репортерную плазмиду (рАР1-Luc), любезно предоставленную проф. М. Роу (Кардиф, Англия).
Культуры клеток и трансфекция. Линию эмбриональных клеток почки человека НЕК293 культивировали на среде DMEM с добавлением 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (GIBCO),
2 мM L-глутамина, 100 ед/мл гентамицина при температуре 37 °С и 5% CO2. Клетки HEK293 трансфециро-вали генетическими конструкциями с использованием LipofectAMINE Plus («Invitrogen», США) в соответствии с рекомендациями производителя.
Анализ с использованием иммуноблоттинга проводили в соответствии с методикой, описанной нами ранее, используя моноклональные антитела S12 к белку LMP-1, полученные от проф. Ф. Грассера (Хомбург, Германия) [10].
Люциферазный анализ. Активность транскрипционных факторов NF-kB и АP-1 количественно определяли по экспрессии люциферазы из репортерных плазмид
ркВ-ConA-Luc и рAP1-Luc. Анализ проводили с использованием набора реактивов «Luciferase Assay System» («Promega», США) в соответствии с рекомендациями производителя.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Мутации 3 аминокислот в С-концевом домене lyLMP-1 не влияют на активацию транскрипционных факторов NF-kB и AP-1
В полноразмерной форме LMP-1 часто выявляются значимые точечные мутации, влияющие на функциональную активность этого вирусного онкогена. Аналогичные мутации встречаются и в его укороченной форме — белке lyLMP-1. Однако роль таких мутаций в функциональной активности lyLMP-1 остается неизвестной. Поскольку lyLMP-1 участвует в негативной регуляции ряда сигнальных путей, активируемых полноразмерной формой LMP-1, изучение мутаций этого белка имеет принципиальное значение. В данной работе мы исследовали lyLMP-1, несущий часто встречающиеся аминокислотные замены серина на глицин в положении 212 (S212G), серина на аланин в положении 350 (S350A) и серина на треонин в положении 366 (S366T).
В целях анализа индукции NF-kB и AP-1 мы трансфе-цировали клеточную линию HEK293 мутантным вариантом lyLMP-1 и соответствующим контрольным вариантом этого гена, не содержащим изучаемых мутаций. В ходе исследования активации транскрипционного фактора NF-kB выявлено, что lyLMP-1-Triple, несущий 3 мутации в доменах CTAR, а также контрольный вариант lyLMP-1 не оказывают достоверного влияния на исходный уровень NF-kB. При этом статистически значимых различий по активации NF-kB между этими клетками и клетками, несущими пустой вектор, не обнаружено. В то же время полноразмерные варианты LMP-1 вызывали значительную активацию этого транскрипционного фактора — прототипный низкоонкогенный LMP-1-B95-8 — в 1,4 раза, а высокоонкогенный — LMP-1-Cao — более чем в 2 раза (рис. 1, А). При измерении уровня активации jun-2-люциферазного репортера также не выявлено достоверных различий между lyLMP-1-Triple, его контрольным вариантом и клетками, несущими пустой вектор (рис. 1, Б). При определении люциферазной активности наличие экспрессии исследуемых белков в анализируемых клеточных линиях подтверждали с помощью имму-ноблоттинга с использованием антител S12, специфичных к области повторов белка (данные не представлены).
Таким образом, полученные данные свидетельствуют
о том, что исследуемые нами мутации в доменах CTAR lyLMP-1 не оказывают существенного влияния на исходный уровень активации транскрипционных факторов AP1 и NF-kB.
Мутантный вариант lyLMP-1-Triple снижает уровень транскрипционного фактора NF-kB, активированного онкогеном LMP-1
Согласно молекулярно-эпидемиологическим исследованиям, lyLMP-1 обнаруживается в 60% природных штаммов ВЭБ. Экспрессия этой формы белка влияет на функциональную активность полноразмерного вирусного онкогена LMP-1, регулируя активность ряда
2,5
2,0
1,5
Б
1,0
0,5
1
по
HEK293
B95-8
Cao
lyTr
Рисунок 1. Активация сигнальных путей NF-кB и AP-1 при экспрессии различных вариантов белка LMP-1 ВЭБ в линии эмбриональных клеток почки человека HEK293.
А. NF-кB. Б. AP-1.
сигнальных путей. В то же время влияние часто встречающихся мутаций в lyLMP-1 на его свойства остается неизвестным. Для того чтобы выяснить, связаны ли мутации lyLMP-1 с функциональной активностью LMP-1, мы провели котрансфекцию клеток НЕК293 высоко- и низ-котрансформирующими (прототипным LMP-1-B95-8, мутантным LMP-1-Triple и высокоонкогенным LMP-1-Cao)| а также укороченными (контрольным lyLMP-1 и мутантным lyLMP-1-Triple) вариантами исследуемых белков. Для анализа активации транскрипционного фактора NF-кB использовали люциферазный репортер рСоп-А-Luc, который содержит ген люциферазы, под контролем кональбуминового промотора и 3 интегрированных элемента кВ области энхансера гена к-цепи иммуноглобулинов [16].
A
0
ly
Котрансфекция lyLMP-1 с различными вариантами полноразмерного онкогена LMP-1 (B95-8, Triple и Cao) во всех случаях вызывала ингибирование NF-kB в среднем на 18,4% (р < 0,05) (рис. 2, А). Активность NF-kB при экспрессии полноразмерных LMP-1-Triple и высо-коонкогенного LMP-1-Cao в равной степени ингибировалась контрольным и мутантным вариантами (lyLMP-1 и lyLMP-1-Triple соответственно). Максимальное ингибирование NF-kB выявлено в случае коэкспрессии в клетках НЕК293 lyLMP-1-Triple и LMP-1-B95-8 (23,2%; р < 0,001). Полученные результаты позволяют предположить, что наблюдаемый феномен связан с наличием незначительного уровня эндогенного синтеза lyLMP-1 при экспрессии гена LMP-1-B95-8, который, в отличие от вы-сокоонкогенного варианта LMP-1-Cao, содержит в своем составе стартовый кодон для синтеза lyLMP-1.
Мутантный вариант lyLMP-1-Triple снижает уровень транскрипционного фактора АР-1, активированного онкогеном LMP-1
Ключевым ферментом jun/AP-1 сигнального каскада является c-jun N-концевая киназа (JNK/AP-1), экспрессия которой инициируется множеством различных факторов, таких, как тепловой шок, ионизирующее излучение, факторы роста и т. д. Показано, что накопление белка LMP-1 в клетке приводит к индукции транскрипционного фактора АР-1, который напрямую влияет на ее пролиферацию и иммортализацию [17]. Используя jun2-люциферазный репортерный вектор, мы анализировали влияние мутантной формы lyLMP-1 на активацию AP-1 высоко- и низкотрансформирующими вариантами онкогена LMP-1.
Аналогично представленным выше результатам экспрессия мутантного lyLMP-1-Triple вызывала большее ингибирование AP-1 по сравнению с контрольным вариантом lyLMP-1 в среднем на 14,6% (р < 0,05) (рис. 2, Б). Необходимо отметить, что, в отличие от NF-kB, исследуемые варианты LMP-1 (B95—8, Triple и Cao) в меньшей степени активировали транскрипционный фактор АР-1. На основании полученных данных можно предположить, что ингибирующее влияние контрольного и мутантного вариантов lyLMP-1 на активность АР-1 выражено в меньшей степени.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Способность lyLMP-1 выступать в качестве естественного ингибитора вирусного онкогена LMP-1 делает изучение этой укороченной формы белка весьма перспективным. Дальнейшее выяснение роли часто встречающихся мутаций в механизме такой регуляции, вероятно, поможет лучше понять природу ассоциированного с ВЭБ канцерогенеза, предоставляя оригинальное направление для разработки способов предотвращения его развития.
ЛИТЕРАТУРА
1. Young L. S., Rickinson A. B. Epstein—Barr virus: 40 years on // Nat. Rev. Cancer. — 2004. — Vol. 4, N 10. — P. 757—768.
2. Burkit D. Determining the climatic limitations of a children's cancer common in Africa // Br. Med. J. — 1962. — N 2. — P. 1019—1023.
3. Henle G., Henle W., Diehl V. Relation of Burkitt's tumor-associated herpes-type virus to infectious mononucleosis // Proc. Nat. Acad. Sci.
2,5
2,0
1,5
g
1,0
0,5
HEK293
B95-8
B95-8+ly B95-8+lyTr
Triple
Triple+ly Triple+lyTr
Cao
Cao+ly
Cao+lyTr
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
HEK293
B95-8 B95-8+ly B95-8+lyTr Triple Triple+ly Triple+lyTr
Cao
Cao+ly Cao+lyTr
Б
Рисунок 2. Активация сигнальных путей NF-кB и AP-1 при котрансфекции клеток HEK293 различными вариантами lyLMP-1 и LMP-1.
А. NF-кB. Б. AP-1.
0
A
0
USA. — 1968. — Vol. 59, N 1. — P. 94—101.
4. Kaye K., Izumi K., Kieff E. Epstein—Barr virus latent membrane protein 1 is essential for B-lymphocyte growth transformation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1993. — Vol. 90. — P. 9150—9154.
5. Moorthy R. K., Thorley-Lawson D. A. All three domains of the Epstein—Barr virus-encoded latent membrane protein LMP-1 are required for transformation of rat-1 fibroblasts // J. Virol. — 1993. — Vol. 67. — P. 1638—1646.
6. Mainou B. A., Everly D. N., Raab-Traub N. Unique signaling properties of CTAR1 in LMP-1-mediated transformation // J. Virol. — 2007. — Vol. 81, N 18. — P. 9680—9692.
7. Activation of the p38 mitogen-activated protein kinase pathway by Epstein—Barr virus-encoded latent membrane protein 1 coregulates interleukin-6 and interleukin-8 production / Eliopoulos A. G., Gallagher N. J., Blake S. M. S., Dawson C. V., Young L. S. // J. Biol. Chem. — 1999. — Vol. 274, N 23. — P. 16 085—16 096.
8. Wu L., Nakano H., Wu Z. The C-terminal activating region 2 of the Epstein—Barr virus-encoded latent membrane protein 1 activates NF-kB through TRAF6 and TAK1 // J. Biol. Chem. — 2006. — Vol. 281, N 4. — P. 2162—2169.
9. Lack of cytotoxic property in a variant of Epstein—Barr virus latent membrane protein-1 isolated from nasopharyngeal carcinoma / Nit-ta T., Chiba A., Yamamoto N., Yamaoka S. // Cell. Signal. — 2004. — Vol. 16. — P. 1071—1081.
10. Роль функционально значимых мутаций гена LMP-1 вируса Эпштейна—Барр в активации клеточных сигнальных путей / Ди-дук С. В., Смирнова К. В., Павлиш О. А., Гурцевич В. Э. // Биохимия. — 2008. — Т. 73, Вып. 10. — С. 1414—1421.
11. Edwards R., Seillier Moisewitsch F., Raab-Traub N. Signature amino acids changes in latent membrane protein 1 distinguish Epstein— Barr virus strains // Virology. — 1999. — Vol. 261. — P. 79—95.
12. Hudson G. S., Farrell P. J., Barrell B. G. Two related but differentially expressed potential membrane proteins encoded by the EcoRI Dhet region of Epstein—Barr virus B95—8 // J. Virol. — 1985. — Vol. 53, N 2. — P. 528—535.
13. Qualitative analysis of the expression of Epstein—Barr virus lytic genes in nasopharyngeal carcinoma biopsies / Martel-Renoir D., Grunewald V., Touitou R., Schwaab G., Joab I. // J. Gener. Virol. — 1995. — Vol. 76. — P. 1401—1408.
14. Pandya J., Walling D. M. Epstein—Barr virus latent membrane-
protein 1 (LMP-1) half-life in epithelial cells is down-regulated by lytic LMP-1 // J. Virol. — 2004. — Vol. 78, N 15. — P. 8404—8410.
15. Pandya J., Walling D. M. Oncogenic activity of Epstein—Barr virus latent membrane protein 1 (LMP-1) is down-regulated by lytic LMP-1 // J. Virol. — 2006. — Vol. 80, N 16. — P. 8038—8046.
16. Phosphotidylcholine hydrolysis activates NF-kB and increase human immunodeficiency virus replication in human monocytes and T lym-
phocytes / Arensana-Seidedos F., Fernandez B., Domingez I., Jaque J., Thomas D., Dias-Meco M., Moscat J., Virelizier J. // J. Virol. — 1994. — Vol. 67. — P. 6596—6604.
17. Angel P., Karin M. The role of Jun, Fos and the AP-1 complex in cell-proliferation // Biochim. Biophys. Acta. — 1991. — Vol. 1072. — P. 129—157.
Поступила 31.01.2011
Sergey Vasilievich Diduk1, Ksenia Valerievna Smirnova2, Vladimir Eduardovich Gurtsevich3
EPSTEIN—BARR VIRUS: REGULATION OF ONCOGENE LMP-1 SIGNALLING ACTIVITY BY MUTANT TYPES OF ITS LYTIC FORM (LYLMP-1)
1 MD, PhD, DSc, Researcher, Viral Carcinogenesis Laboratory, Carcinogenesis Research Institute,
N. N. Blokhin RCRC RAMS (24, Kashirskoe sh., Moscow, 115478, RF)
2 MD, PhD, DSc, Researcher, Viral Carcinogenesis Laboratory, Carcinogenesis Research Institute,
N. N. Blokhin RCRC RAMS (24, Kashirskoe sh., Moscow, 115478, RF)
3 MD, PhD, Professor, Head, Viral Carcinogenesis Laboratory, Carcinogenesis Research Institute,
N. N. Blokhin RCRC RAMS (24, Kashirskoe sh., Moscow, 115478, RF)
Address for correspondence: Diduk Sergey Vasilievich, Viral Carcinogenesis Laboratory, Carcinogenesis Research Institute, N. N. Blokhin RCRC RAMS, 24, Kashirskoe sh., Moscow, 115478, RF;
e-mail: diduksv@rambler.ru
Protein LMP-1 is an Epstein—Barr virus-encoded oncogene with expression leading to neoplastic cell transformation. LMP-1 lytic form (lyLMP-1) is a truncated form of the protein that lacks the LMP-1 transforming activity and ability to inhibit oncogenic activity. The paper demonstrates effects of common lyLMP-1 mutations on inhibition of key signaling pathways in the cell. These observations confirm experimentally that some lyLMP-1 mutations are involved in LMP-1 activity regulation.
Key words: Epstein—Barr virus, VEB-encoded protein LMP-1, lyLMP-1, signaling pathways.
