CC BY
62
ISSN 2412-608Х. МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып. 4 (168), 2016
УДК 633.853.52:576.851.155:631.5
ВИРУЛЕНТНОСТЬ КЛУБЕНЬКОВЫХ
БАКТЕРИЙ СОИ И МАСШТАБЫ УСВОЕНИЯ СИМБИОТИЧЕСКОГО АЗОТА В ПОЧВАХ ПРИАМУРЬЯ
В.А. Тильба,
доктор биологических наук, академик РАН
ФГБНУ ВНИИМК
Россия, 350038, г. Краснодар, ул. им. Филатова, д. 17
Тел.: (861) 275-85 11
E-mail: [email protected]
Для цитирования: Тильба В.А. Вирулентность клубеньковых бактерий сои и масштабы усвоения симбиотического азота в почвах Приамурья // Масличные культуры. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. - 2016. - Вып. 4 (168). - С. 61-66.
Ключевые слова: соя, вирулентность, штаммы, ризобии, симбиотическая азотфиксация.
Анализировались показатели образования клубеньков сои в лугово-черноземовидных почвах Приамурья. Определяли вирулентность аборигенных штаммов и долю использования симбиотиче-ского азота сортами Гармония и Нега 1. Для этого использовали метод сравнения с небобовой культурой (овсом) и методом сравнения исходного сорта с его же формой-мутантом, образующим незначительное количество клубеньков низкой активности. Аборигенные ризобии сои изучаемых почв характеризуются высокой вирулентностью (от 45 до 100 %) по отношению к сортам сои различного географического происхождения. Для штаммов Bradyrhizobium japonicum (медленнорастущие формы) пределы вирулентности по отношению к изучаемым сортам составляют от 73 до 100 % и для штаммов Sinorhisobium fredii (быстрорастущие формы) - 40-100 %. Доля использования симбиотического азота сортами сои Гармония и Нега 1 в изучаемых условиях различалась незначительно и составила в различные периоды вегетации 63-82 %.Оба метода определения доли использования соей симбиотического азота показали высокую сходимость: от 63-67 до 82-82 %.
UDC 633.853.52:576.851.155:631.5
Virulence of legume bacteria on soybean and degree of symbiotic nitrogen accumulation in soils of Amur River region.
Tilba V.A., doctor of biology, academician RAS
FGBNU VNIIMK
17, Filatova str., Krasnodar, 350038, Russia
Tel.: (861) 275-85 11
E-mail: [email protected]
Key words: soybean, virulence, strains, rhizobia, symbiotic nitrogen fixation.
Indicators of soybean nodules development in meadow-flood-plain soils of Amur River region were analyzed. Virulence of local strains and a share of symbiotic nitrogen accumulation by the cultivars Harmony and Nega 1 were determined. There were used a method of comparison to non-legume crop (oat) and a method of comparison of an parental cultivar to its mutant form which develops insignificant quantity of nodules with low activity. The local soybean rizhobia in studied soils are characterized with a high virulence (from 45 to 100%) to soybean cultivars of the different geographical origin. For strains of Bradyrhizobium japonicum (slow-growing forms) the virulence limits for studied cultivars are from 73 to 100% and for strains of Sinorhisobium fredii (quick-growing forms) - 40-100%. A share of symbiotic nitrogen accumulation by the cultivars Harmony and Nega 1 in studied conditions was differed insignificantly and was in the various vegetative periods 6382%. The both methods of determination of a share of symbiotic nitrogen accumulation showed the high similarity: from 63-67 to 82-82%.
Введение. В почвах Дальнего Востока масштабы использования симбиотического азота в посевах сои достигают 50-70 % от общей потребности в элементе [4; 5].
Указанные процессы определяются взаимодействием аборигенной популяции ризобий с сортами сои преимущественно амурского происхождения. Массовое образование клубеньков на корнях сои в лу-гово-черноземовидных, луговых глеевых и других почвах Приамурья свидетельствует о высокой агрессивности изучаемых ризобий - их вирулентности, активности, конкурентоспособности и эффективности [2]. Вместе с тем во многом остаются неясными факторы, определяющие сортовую специфику и динамику симбиотиче-
ской азотфиксации. Исходя из этого, представлялось важным проанализировать свойства вирулентности аборигенных штаммов клубеньковых бактерий по отношению к местным и инорайонным сортам сои и определить у отдельных сортов показатели потребления симбио-тического азота.
Материалы и методы. С этой целью в течение длительного времени (19802010 гг.) проводились исследования на лугово-черноземовидных почвах Дальнего Востока. Указанные почвы имеют гумусовый горизонт мощностью 25-30 см, содержание гумуса 4-5 %, реакция среды от слабо кислой до нейтральной, рН солевое - 5,1, сумма поглощённых оснований 25-40 мг-экв. на 100 г почвы. Содержание валового азота от 0,3 до 0,5 %, фосфора -0,2-0,3, калия - 2-2,5 %.
Территория, на которой располагались опыты, характеризуется чертами муссон-ного климата. Сумма активных температур колеблется от 1700 до 2100 °С, годовое количество осадков до 600 мм. За тёплый период выпадает 300-450 мм. Распределение гидротермических ресурсов крайне неравномерно по месяцам. Продолжительность безморозного периода 120-125 дней.
Изучались сорта амурской селекции, включая Амурскую 310, Октябрь, Гармонию, Негу и ряд других.
Количество клубеньков учитывали при отборе среднего образца на экспериментальных участках по общепринятой методике в расчёте на 1 растение. Показатель вирулентности определяли по соотношению количества растений, образовавших клубеньки, в общей выборке. В лабораторных опытах вирулентность штаммов определяли при выращивании растений в ёмкостях со стерильной средой Гельриге-ля с уменьшенной дозой азота [8; 9; 10]. Долю использования растениями биологического азота учитывали методом Тре-пачева Е.П. [7] при сравнении с небобовой культурой (овсом). Одновременно этот же показатель рассчитывали мето-
дом Бегуна С.А. [3] путём сравнения содержания азота у изучаемого сорта и его мутанта-сортообразца с неэффективным симбиотическим аппаратом (скудно растущая соя).
Результаты и обсуждение. В изучаемых почвах в течение длительного естественно-исторического отрезка времени сформировалась популяция специфичных для сои клубеньковых бактерий, что явилось результатом длительной коэволюции макро- и микросимбионтов. Это подтверждается повсеместным распространением в рассматриваемом регионе диких форм сои. Изучаемые ризобии, по-видимому, обладают достаточным разнообразием свойств и разделяются на виды (Бгафг-М2оЫит ]аротсит и Бто^оЫит ^¡геёН), включая кластеры, клональные и штам-мовые структуры.
После масштабного расширения посевов селекционных сортов сои на Дальнем Востоке на популяцию аборигенных клубеньковых бактерий стали оказывать дополнительное давление генотипы культурных растений, включая сорта инорай-онного происхождения. Естественно, что одним из наиболее информативных показателей уровня взаимоотношений партнёров симбиоза является образование клубеньков на корнях. Он характеризует вирулентность штаммов - их способность проникать в ткань корня и вызывать образование клубеньков [6]. В какой-то мере этот же показатель может характеризовать и конкурентоспособность изучаемых объектов, хотя в большей степени данный признак обусловлен, по-видимому, достаточно сложными биохимическими процессами взаимодействия партнёров симбиоза.
В соесеющем поясе Приамурья повсеместно в массовых посевах на корнях сои наблюдается образование значительного количества клубеньков, что свидетельствует об их высокой вирулентности. Вместе с тем по отношению к сортам растения-хозяина выявлены заметные отклонения. Как видно из таблицы 1, число
клубеньков не всегда зависит от места происхождения сорта. У китайского сорта Хэйхэ 1 и амурского сорта Дочь Крапинки количество клубеньков различается несущественно.
Таблица 1
Влияние амурской популяции ризобий на образование клубеньков различных сортов сои (среднее за 4 года)
Развитие кт^беньков в период начала цветения зависит в основном от темпов прироста надземной массы растений.
В период полного цветенш! указанные признаки в вариантах с контрастными показателями (сорта Хэшэ 1 и Кобра) выравниваются. Это даёт основание считать, что в почвенной среде, где пог^ляция ризобий сои представлена достаточно разнообразным штаммовым составом, партнёры симбиоза в основном комплиментарны. Кроме того, в данном случае процесс образована клубеньков в наибольшей степени определяется гидротермическими и другими экологическими факторами. Следовательно, первичными в такой ситуации являются исходные возможности развита растения-хозяина.
В отличие от этого, при взаимодействии чистых культур ризобий со стерильными растениями в стерильной агаризо-ванной среде, показатель вирулентности зависит от физиолого-биохимических взаимодействий (табл. 2).
При определении вирулентности двух аборигенных штаммов ризобий сои (медленнорастущий 648-а и быстрорастущий
БД-32) выявлены существенные различи данного признака. По отношению к 8 из 14 испытываювшихся сортов вирулентность штамма 648-а составила 93-100 %.
Таблица 2
Показатели вирулентности амурских штаммов ризобий по отношению к различным сортам сои, лабораторные опыты (среднее из 4-х опытов)
Название сорта Происхож-дениесорта Количество клубеньков на 1 растении Вирулентность, %
в среднем Ит штамм 648 а, медленно- растущий штамм БД-322 быстро-растущий
Омская 4 г. Омск 5,7 3-9 100 55
Хабаровская 1 17 г. Хабаровск 4,0 1-8 100 44
Хабаровская 4 г. Хабаровск 7,1 2-91 Ю0 66
Кобра г. Хабаровск 3,5 2-9 82 44
Восход г. Ершовск 2,2 0-84 5 Ю0 0
Крепыш респ. Крым 7;9 4,58-93 Ю0 Ю0
ВНИИС1 Амурск, обл. 2>9 11- 93 44
Рассвет Амурск, обл. 44(6 и-- Ю0 77
Октябрь 77 Амурск, обл. 4;4 226 Ю0 66
Дочь Крапинки Амурск, обл. 4;5 226 93 88
Вега Амурск, обл. 2;0 2-8 73 55
Хэйхэ 1 Китай 5,8! 5-6 99 77
Хэйхэ 3 Китай 2;7 2,5-9 77 66
Соната Амурск, обл. 6,9 3--1 99 66
Средний показатель - 4;58 - 99Д 66,2
Этот же показатель у быстрорастущей фор)мы в среднем оказался на 35 % ниже. Наиболее восприимчивым к обеим бактериальным фор)мам является сорт Крепыш. По отношению к сортам Кобра, Вега, Хэшэ 3 вирулентность первого штамма достигает 73-82 %. На этих же сортах минимальную вирулентность проявил и быстрорастущий штамм. Существенные колебанш! изучаемого показателя по отношению к некоторым сортам свидетельствуют о наличии определённых механизмов, препятствующих нодуляции. Возможно и проявление в^трисортовой разнокачественности семян. Такая разно-качественность может отражаться на биохимически свойствах корневых выделений прорастающих семян.
В свою очередь, при реализации сим-биотических взаимоотношений на корневую систему действует №^-фактор, про-
(Раза
начало цветения полное цветение
Сорта сои масса количест- масса количест-
клубеньков, мг на раст. , во клубеньков клубеньков, мг на раст. , во клубеньков
сух. в-ва на 1 раст. сух. в-ва на 1 раст.
Октябрь 70 8 1 ± 1 5 3 3± 6 - -
Хэйхэ 1 12 8 ± 3 2 5 1 ± 12 36 8 90
Кобр а 77 ± 19 29 ± 10 362 8 8
Восход 100 ± 4 3 3± 6 - -
Дочь Крапинки 9 3± 3 4 8 ± 9 - -
Усреднённый показатель 96 3 9
дуцируемый ризобиями. Специфичность действия Nod-фaктopa определяется сигнальными молекулами, которые способствуют одновременно инфицированию корней и симбиоорганогенезу [11]. При первоначальном контакте сигнальных молекул и поверхности корней искривляются корневые волоски. Наблюдается подщелачивание цитоплазмы, колебания концентрации ионов К в клетках эпидермиса и деполяризация мембран.
По данным А. Хадри и Т. Бисселинга [12], Nod-фaктop состоит из молекул хи-тиноподобного скелета, к которому присоединяется остаток жирной кислоты. Длина и степень ненасыщенности молекул жирной кислоты значительно варьирует. Это отражается на специфичности реакции симбионтов и, в конечном итоге, на уровне вирулентности.
Аналогичными причинами можно объяснить различия в показателях вирулентности медленно- и быстрорастущих штаммов. За время исследований было выделено 96 штаммов вида B. japonicum и 64 штамма вида & fredii. Их вирулентость в среднем различалась более чем на 30 % (табл. 3).
Таблица 3
Вирулентность медленнорастущих и быстрорастущих штаммов ризобий сои, выделенных из почв Приамурья
По данным Бегуна С.А. и др. [1], в лу-гово-черноземовидных почвах доля штаммов B. japonicum составила 72 % и доля штаммов & fredii - 28 % от общего количества бактериальных форм указанных видов.
Можно полагать, что в такой же пропорции изучаемые штаммы (в зависимости от свойств) воздействуют на процессы симбиотической азотфиксации.
Как видно из таблицы 4, доля использования соей азота атмосферы у изучаемых сортов различается несущественно. По усреднённым данным при применении двух методов учёта сорт Гармония за два срока наблюдений использовал 77 % сим-биотического азота, а сорт Нега - 74,5 %. Применявшиеся два метода определения доли фиксированного клубеньками атмосферного азота (метод сравнения с небобовой культурой и метод сравнения исходного сорта с его же формой-мутантом, образующим незначительное количество клубеньков низкой активности) продемонстрировали высокую сходимость результатов.
Таблица 4
Доля усвоения растениями сои атмосферного азота (%), определённого методами сравнения с небобовой культурой (овсом) и сортообразцом сои с неактивными клубеньками
Можно отметить, что по масштабам использования фиксированного азота, некоторое преимущество имеет сорт Гармония. Особенности данного процесса достаточно заметно выявляются по фазам развития. Следовательно, сортовая спе-
Группы штаммов Количество штаммов Вирулентность
% 1Ш
Медленнорастущие Bradyrhizobium japonicum 96 86,3 70-100
Быстрорастущие Sinorhisobium fredii 64 67,3 0-100
Сорт, период вегетации Фаза развития Мето ния в с д определе-;вязанного азота равнении Среднее по методам определения Масса сухого вещества в конце цветения, г/раст.
с овсом с соей с неактивными клубеньками
Гармония, 100-108 дней Цветение 78,0 77,0 77,5 ± 0,5 12,7
Созревание 76,0 73,0 74,5 ± 1,5
Среднее за две фазы 77,0 75,0 76,0 ± 1,0
Нега 1, 110-116 дней Цветение 82,0 82,0 82,0 ± 0 13,9
Созревание 67,0 63,0 65,0 ± 2,0
Среднее за две фазы 74,5 72,5 73,5 ± 1,0
НСР05 2,0
цифика усвоения симбиотического азота зависит в основном от темпов развития растений по фазам вегетации и от продолжительности вегетационного периода.
Выводы. 1. Клубеньковые бактерии сои, обитающие в лугово-черноземовид-ных почвах Приамурья, способствуют массовому образованию клубеньков и характеризуются высоким уровнем вирулентности ко всем испытывавшимся сортам. Вне зависимости от географического происхождения на корнях сои в изучаемых условиях в середине вегетационного периода образуется от 29 до 90 клубеньков в расчёте на 1 растение.
2. Вирулентность аборигенных штаммов ризобий сои в различных фактори-альных сочетаниях составляет от 45 до 100 %. По отношению к сортам сои различного географического происхождения чётких различий по вирулентности не выявлено. Минимальные значения данного показателя установлены для сортов Восход, ВНИИС 1, Кобра.
3. Штаммы быстрорастущего вида ризобий сои & fredii обладают меньшей вирулентностью по сравнению со штаммами вида B. japonicum. Данный показатель составляет соответственно 40-100 и 73100 % применительно к изучавшимся сортам.
4. Доля использования симбиотического азота амурскими сортами Гармония и Нега 1 по усреднённым данным составляет 72,5-77,0 %. Сортовые различия выявляются в зависимости от фазы вегетации и продолжительности вегетирования.
5. Определение доли использования соей симбиотического азота методом сравнения с небобовой культурой (овсом) и методом сравнения исходного сорта с его же формой-мутантом, образующим незначительное количество клубеньков низкой активности, продемонстрировали высокую сходимость результатов в обе изучаемые фазы развития растений: соот-
ветственно 78-77 %...76-73 % и 82-82 %... 67-63 %.
Список литературы
1. Бегун С.А., Тильба В.А, Якименко М.В. Распространение медленно- и быстрорастущих штаммов клубеньковых бактерий сои в почвах Приамурья // В сб.: Селекция и технология производства сои. ВНИИсои. - Благовещенск, 1977. - С. 33-38.
2. Бегун С.А. Влияние клубеньковых бактерий на продуктивность сои в районах давнего соесеяния: дис. ... канд. биол. наук. - Благовещенск, 1982. - 180 с.
3. Бегун С.А., Тильба В.А. Скудно растущая форма сои с неэффективным сим-биотическим аппаратом // Науч.-тех. бюл. ВИР. - 1992. - Вып. 220. - С. 71-74.
4. Грицун А.Т. Роль бобовых культур (сои, клевер) в накоплении биологического азота и повышении плодородия почв в условиях Дальнего Востока // Агрохимия. - 1975. - № 5. - С. 17-24.
5. Доросинский Л.М., Тильба В.А., Бегун С.А. Влияние бактеризации на урожай сои и фиксацию молекулярного азота в почвах Дальнего Востока. // Соя и нитрагин. Науч.-тех. бюл. - 1976. - № 1. -С.18-22.
6. Мишустин Е.Н., Шильникова В.К. Клубеньковые бактерии и инокуляцион-ный процесс. - М.: Наука, 1973. - 288 с.
7. Трепачёв Е.П., Атрашкова Н.А., Хабарова А.И. О методах определения и размерах фиксации атмосферного азота бобовыми растениями // В сб.: Биологический азот в земледелии нечернозёмной зоны СССР. - М.: Колос, 1970. - С. 27-74.
8. Тильба В.А. К вопросу определения численности клубеньковых бактерий сои в почве // Микробиологические и биохимические методы исследования почв. -Киев, 1971. - С. 51-55.
9. Тильба В.А., Бегун С.А. Об использовании биологического азота амурскими сортами сои // Биология, генетика и мик-
робиология сои. - Новосибирск, 1976. -С. 74-79.
10. Тильба В.А., Бегун С.А., Садовская Е.В. Определение эффективности штаммов Rhizobium japonicum на первичном этапе отбора // Резервы повышения эффективности соеводства: сб. науч. тр. Сиб. Отд. ВАСХНИЛ ВНИИ сои. - Новосибирск, 1988. - С. 79-89.
11. Хадри А.Е., Спайнк Г., Бисселинг Т., Бревин Н. Разнообразие процессов образования корневых клубеньков и их инфицирования ризобиями // В сб.: Rhizobiaceae. Молекулярная биология бактерий, взаимодействующих с растениями / Ред. Г. Спайк, А. Кондороши, П. Хукас. Русский перевод под ред. И.А. Тихоновича и Н А. Проворова. - СПб., 2002. - С. 373-415.
12. Хадри А.Е. Бисселинг Т. Реакция растений на Nod-факторы // Сб. Rhizobiaceae. Молекулярная биология бактерий взаимодействующих с растениями. Ред. Г. Спайк, А. Кондороши, П. Хукас. Русский перевод под ред. И.А. Тихоновича и Н.А. Проворова. - СПб., 2002. - С. 435-450.
References
1. Begun S.A., Til'ba V.A, Yakimenko M.V. Rasprostranenie medlenno- i bystrorastushchikh shtammov kluben'kovykh bakteriy soi v pochvakh Priamur'ya // V sb.: Selektsiya i tekhnologiya proizvodstva soi. VNIIsoi. - Blagoveshchensk, 1977. - S. 33-38.
2. Begun S.A. Vliyanie kluben'kovykh bakteriy na produktivnost' soi v rayonakh davnego soeseyaniya: dis. ... kand. biol. nauk. -Blagoveshchensk, 1982. - 180 s.
3. Begun S.A., Til'ba V.A. Skudno rastushchaya forma soi s neeffektivnym simbioticheskim apparatom // Nauch.-tekh. byul. VIR. - 1992. - Vyp. 220. - S. 71-74.
4. Gritsun A.T. Rol' bobovykh kul'tur (soi, klever) v nakoplenii biologicheskogo azota i povyshenii plodorodiya pochv v usloviyakh Dal'nego Vostoka // Agrokhimiya. - 1975. -№ 5. - S. 17-24.
5. Dorosinskiy L.M., Til'ba V.A., Begun S.A. Vliyanie bakterizatsii na urozhay soi i fiksatsiyu molekulyarnogo azota v pochvakh Dal'nego Vostoka. // Soya i nitragin. Nauch.-tekh. byul. -1976. - № 1. - S. 18-22.
6. Mishustin E.N., Shil'nikova V.K. Kluben'kovye bakterii i inokulyatsionnyy protsess. - M.: Nauka, 1973. - 288 s.
7. Trepachev E.P., Atrashkova N.A., Khabarova A.I. O metodakh opredeleniya i razmerakh fiksatsii atmosfernogo azota bobovymi rasteniyami // V sb.: Biologicheskiy azot v zemledelii nechernozemnoy zony SSSR. -M.: Kolos, 1970. - S. 27-74.
8. Til'ba V.A. K voprosu opredeleniya chislennosti kluben'kovykh bakteriy soi v pochve // Mikrobiologicheskie i biokhimicheskie metody issledovaniya pochv. - Kiev, 1971. - S. 51-55.
9. Til'ba V.A., Begun S.A. Ob ispol'zovanii biologicheskogo azota amurskimi sortami soi // Biologiya, genetika i mikrobiologiya soi. - Novosibirsk, 1976. - S. 74-79.
10. Til'ba V.A., Begun S.A., Sadovskaya E.V. Opredelenie effektivnosti shtammov Rhizobium japonicum na pervichnom etape otbora // Rezervy povysheniya effektivnosti soevodstva: sb. nauch. tr. Sib. Otd. VASKhNIL VNII soi. -Novosibirsk, 1988. - S. 79-89.
11. Khardi A.E., Spaynk G., Bisseling T., Brevin N. Raznoobrazie protsessov obrazovaniya kornevykh kluben'kov i ikh infitsirovaniya rizobiyami // V sb.: Rhizobiaceae. Molekulyarnaya biologiya bakteriy, vzaimodeystvuyushchikh s rasteniyami / Red. G. Spayk, A. Kondoroshi, P. Khuras. Russkiy perevod pod red. I.A. Tikhonovicha i N.A. Pro-vorova. - SPb., 2002. - S. 373-415.
12. Khardi A.E. Bisseling T. Reaktsiya rasteniy na Nod-faktory // Sb. Rhizobiaceae. Molekulyarnaya biologiya bakteriy vzaimodeystvuyushchikh s rasteniyami / Red. G. Spayk, A. Kondoroshi, P. Khuras. Russkiy perevod pod red. I.A. Tikhonovicha i N.A. Provorova. - SPb., 2002. - S. 435-450.
