CC BY
66
УДК 574.632
Немцева Н.В., Гоголева О.А.
Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Росскийской академии наук, Оренбург E-mail: [email protected]
ВИДОВАЯ СТРУКТУРА И БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩЕГО БАКТЕРИОПЛАНКТОНА ПОЙМЕННЫХ ВОДОЕМОВ ОРЕНБУРГСКОЙ ОБЛАСТИ
Исследован углеводородокисляющий бактериопланктон пресных пойменных водоемов. Показано, что в эвтрофном водоёме численность и видовое разнообразие углеводородокисляю-щих бактерий выше, чем в мезотрофном водоёме. В углеводородокисляющем бактериопланк-тоне озера Беленовское отмечено преобладание штаммов с более низкими значениями каталаз-ной активности, чем в озере Рудничное.
Ключевые слова: углеводородокисляющий бактериопланктон, пресные водоёмы, Pseudomonas, Acinetobacter, нокардиоформные актиномицеты.
В настоящее время проблема нефтяного загрязнения актуальна не только для морских вод, но и для пресных водоемов [1, 2]. Пресные водоемы служат источником питьевой воды для населения, а также имеют рыбохозяйственное значение. Особенно значение водоемов как источников питьевой воды увеличивается в регионах испытывающих недостаток пресной воды. Оренбургская область относится к маловодным регионам [3]. На территории области сосредоточены крупные промышленные объекты, что определяет характер загрязнения поверхностных вод: основными загрязняющими веществами являются нефть, нефтепродукты и отходы их переработки, фенолы, соли тяжелых металлов, по степени опасности, относящиеся ко 2-4 классу [4]. В связи с этим особое значение приобретает изучение углеводородокисляющего бактериопланктона пресных водоемов, так как именной этой группе принадлежит ведущая роль в разрушении углеводородов.
Материалы и методы
Из стоячих водоемов была обследованы пойменные озера реки Урал - Беленовское, Рудничное (Оренбургский район Оренбургской области).
По морфометрическим и гидрохимическим показателям озера схожи, основное различие заключается в интенсивности антропогенной нагрузки, испытываемой водоемами. Озеро Беленовское испытывает высокую антропогенную нагрузку - на берегу озера располагаются два населенных пункта, а также фермерские хозяйства, сброс не очищенных стоков происходит в водоем. Озеро Рудничное удалено от
населенных пунктов и по результатам химического анализа воды характеризуется слабым уровнем загрязнения [5].
На пойменных озерах взятие проб проводилось с учетом пространственного и временного мониторинга на фиксированных точках в течение 2004-2005гг. Пробы брали из нескольких точек в пределах водоема, после чего равные объемы проб смешивались для получения одной интегрированной пробы. Обработку проб проводили непосредственно в день отбора. Выделение гетеротрофных и углеводородо-кисляющих бактерий проводили по методикам описанным ранее [6].
Идентификацию выделенных штаммов микроорганизмов проводили до вида, а в некоторых случаях до рода или группы, общепринятыми методами на основании морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических свойств [7-9].
Морфологию бактерий оценивали с помощью иммерсионной и фазово-контрастной микроскопии (микроскопы "Standard - 25", «Axiostar plus» - Carl Zeiss), в окрашенных и нативных препаратах. При определении биохимических свойств выделенных микроорганизмов использовали коммерческие тест-системы фирмы LACHEMA (Чехия): «ENTERtest» (1 и 2) и «NEFERMtest». Количественное определение уровня каталазной активности углеводоро-докисляющих бактерий проводили по методу Бухарина О.В. с соавтр. [10].
Результаты и обсуждение
Характеристика углеводородокисляющего бактериопланктона озера Рудничное. Доля уг-
леводородокисляющих бактерий в общей численности гетеротрофного бактериопланктона была не значительна, максимальные значения приходились на осенний период. Отмечено, что из зимних проб углеводородокисляющие бактерии не выделялись (рис. 1).
Из гетеротрофного бактериопланктона озера Рудничное было выделено 8 штаммов уг-леводородокисляющих бактерий, представленных видами Pseudomonas fluorescens (штамм № 2051), Pseudomonas putida (штаммы № 2052, 2023), Pseudomonas aeruginosa (штаммы № 2025, 2053), Pseudomonas sp. (штамм № 2024), Enterobacter sp., (штамм № 2022), Xanthobacter sp. (штамм № 1021) (табл. 1).
Наибольшее количество углеводородокис-ляющих бактерий было выделено в осенний период. В этот период в сообществе присутствовали только грамнегативные виды, доминировали по численности Enterobacter sp. (штамм № 2022) и P. aeruginosa (штамм № 2053). В летний период в углеводородокисляющем сообществе присутствовали виды рода Pseudomonas, с доминированием вида P. putida (штамм № 2052). В весенний период доминировал вид P. aeruginosa (штамм № 2025) (табл. 1).
В углеводородокисляющем бактериоплан-ктоне озера Рудничное также, как и в озере Беленовском, по численности доминировали виды рода Pseudomonas. Разнообразие родов углево-дородокисляющих бактерий было ниже, чем в озере Беленовское.
Морфологически все виды были представлены палочками, оксидазо- и каталазоположи-
тельными. В основном грамнегативные изоля-ты были представлены видами рода Pseudomonas и лишь один вид идентифицирован как Enterobacter sp. Все штаммы, выделенные из углеводородокисляющего бактериопланктона озера Рудничное, способны к росту на среде с нефтепродуктами только в присутствии дополнительного источника углерода.
Распространенность каталазной активности у исследуемых штаммов составила 100%. В углеводородокисляющем бактериопланктоне озера доминировали штаммы со значениями каталазной активности от 4,6 до 6,0 усл.ед., штаммы со значениями признака от 3,1 до 4,5 усл. ед. занимали второе место по численности. Доля
Таблица 1. Углеводородокисляющие бактерии выделенные из оз. Рудничное
№ штамма Сезон Численность, КОЕ/л Таксон
2025 весна 600 Pseudomonas aeruginosa
1021 весна 200 Xanthobacter sp.
2051 лето 210 Pseudomonas fluorescens
2052 лето 600 Pseudomonas putida
2023 осень 630 Pseudomonas putida
2053 осень 800 Pseudomonas aeruginosa
2024 осень 400 Pseudomonas sp.
2022 осень 900 Enterobacter sp.
18,00% 16,00% 14,00% 12,00% 10,00% 8,00% 6,00% 4,00% 2,00% 0,00%
16,61%
10,10%
5,98%
- 0%
Рисунок 1. Доля углеводородокисляющих бактерий в общей численности гетеротрофного
бактериопланктона оз. Рудничное
штаммов с более низкими значениями исследуемого признака (от 1,0 до 3,0) была незначительна (рис.2).При этом выраженность признака среди штаммов, выделенных из озера Рудничное, колебалась в пределах от 1,8 до 5,4 усл.ед., а среднее значение экспрессии признака составило 4,1±0,9 усл.ед. Минимальные и максимальные значения признака отмечены среди псевдомонад (1,8 усл. ед. - у штамма P. putida № 2023 и 5,4 усл.ед. - у штамма Pseudomonas sp. № 2024).
Характеристика углеводородокисляющего бактериопланктона озера Беленовское. Общая численность углеводородокисляющих бактерий в озере Беленовское была выше, по сравнению с озером Рудничное. В озере Беленовское доля грампозитивных бактерий в углеводородокисляющем бак-териопланктоне составляла более 30%, тогда как в озере Рудничное - менее 5%. Углево-дородокисляющие бактерии в озере Беленовское составляли значительную часть гетеротрофного бактериопланктона. Наибольшая доля этих бактерий была отмечена в осенний период (более 30%) (рис. 3).
Из озера Беленовское было выделено 9 штаммов уг-леводородокисляющих бакте-
яз ц
о
S
т
ю о н о
сс ц
о ч
рий, представленных видами Pseudomonas fluorescens (штаммы № 2013, 2013/1), Pseudomonas putida (штамм № 2015), Pseudomonas sp. (штамм № 2011), Pantoea agglomerans (штамм № 2012), Acinetobacter sp. (штамм № 2014), Bacillus sp. (штамм № 1013), Micrococcus sp. (штамм № 1011) и один изолят был отнесен к группе нокардиоформных акти-номицет (штамм № 1012) (табл. 2).
Наибольшее видовое разнообразие в угле-водородокисляющем сообществе отмечено в осенний период (табл. 2). В этот период доминировали микроорганизмы из группы нокар-
> 4,6
3,1-4,5
< 3,0
усл.ед.
Рисунок 2. Распределение бактерий в зависимости от выраженности каталазной активности (оз. Рудничное)
35,00% 30,00% 25,00% 20,00% 15,00% 10,00% 5,00% 0,00%
31,27%
16,12%
13,21%
11,48%
Рисунок 3. Доля углеводородокисляющих бактерий в общей численности гетеротрофного бактериопланктона по сезонам в озере Беленовское
диоформных актиномицет, а также P. fluorescens. Для озера Беленовское в зимний и весенний периоды характерна высокая численность угле-водородокисляющих бактерий при их небольшом видовом разнообразии. В эти периоды выделяли только грамнегативные штаммы. Например, штамм 2015 (P. putida) изолирован из зимней пробы, штаммы № 2014 (Acinetobacter sp.) и № 2011 (Pseudomonas sp.) - из весенних проб. В летний период отмечено доминирование P. fluorescens (штамм № 2013).
В углеводородокисляющем бактериоплан-ктоне озера Беленовское по численности доминировали бактерии рода Pseudomonas, вторым по численности был вид Bacillus sp., на третьем месте - Acinetobacter sp., на четвертом месте -бактерии группы нокардиоморфных актиномицет. Бактерии рода Pseudomonas были представлены 3 видами (P. fluorescens; Pseudomonas sp.; P. putida), численно доминировал вид P. putida.
Выделенные грамнегативные изоляты морфологически были представлены подвижными палочками, обладали каталазной активностью. Лизоцимная активность отсутствовала. Среди выделенных псевдомонад три штамма обладали гемолитической активностью - штаммы № 2013, 2013/1, отнесенные нами к виду P. fluorescens и штамм № 2015, идентифицированный как P. putidа. Все выделенные штаммы имели недиффундирующий в среду пигмент, ок-сидазо- и каталазоположительные, не обладали лизоцимной и антилизоцимной активностью. Желатиназной активностью обладали Bacillus
Таблица 2. Углеводородокисляющие бактерии, выделенные из озера Беленовское
№ штамма Сезон Численность, КОЕ/л Таксон
2011 весна 800 Pseudomonas sp
2014 весна 1000 Acinetobacter sp.
1011 лето 460 Micrococcus sp.
2013 лето 600 Pseudomonas fluorescens
2012 осень 100 Pantoea agglomerans
1012 осень 600 Группа нокардиоформных актиномицет
1013 осень 110 Bacillus sp.
2013/1 осень 700 Pseudomonas fluorescens
2015 зима 1100 Pseudomonas putida
sp. (штамм 1013) и штамм № 1012 отнесенный к группе нокардиоформных актиномицет.
К потреблению дизельного топлива в качестве единственного источника углерода и энергии способны виды P. fluorescens (штаммы № 2013, 2013/1), P. putida (штамм № 2015) и Acinetobacter sp. (штамм № 2014). Виды Pantoea agglomerans и Pseudomonas sp. росли на среде с нефтепродуктами только в присутствии дополнительного источника углерода. Выявлено, что Bacillus sp. и Micrococcus sp. не растут на среде Раймонда с дизельным топливом в качестве единственного источника углерода, поскольку для потребления нефтепродуктов они нуждаются в присутствии дополнительного источника углерода. К потреблению нефтепродукта в качестве единственного источника углерода и энергии способен штамм № 1012, отнесенный к группе нокардиоформных актиномицет.
Распространенность каталазной активности у исследуемых изолятов составила 100 %. При этом выраженность признака среди выделенных штаммов варьировала в пределах от 1,9 усл. ед. до 6,4 усл. ед., со средним уровнем экспрессии признака - 3,7±0,9 усл. ед. (рис. 4). Наиболее широко признак варьировал среди грамнегативных штаммов, максимальные и минимальные значения признака в этой группе были отмечены у Pseudomonas sp. № 2011 (6,4 усл.ед.) и Acinetobacter sp. (1,9 усл. ед.). В углеводородокисляющем бактериопланкто-не преобладали штаммы с каталазной активностью от 3,1 до 4,5 усл. ед., тогда как штаммы с меньшей и большей активностью составляли незначительную долю от общего числа бактерий данной группы (рис. 4).
Таким образом, в исследуемых водоемах выявлено присутствие углеводородокисляю-щих бактерий. В эвтрофном водоеме (озеро Беленовское) численность углеводородокисляю-щих бактерий, их видовое разнообразие и доля грампозитивных бактерий выше, чем в мезотроф-ном озере (Рудничное).
Динамика численности углеводородокисля-ющих бактерий и их видовое разнообразие во всех исследованных водоемах подвержены сезонной изменчивости. В зимне-весенний период в углеводородокисляющем батериопланктоне доминировали грамнегативные виды (бактерии рода Pseudomonas), тогда как в летне-осенний -увеличивалась доля грампозитивных штаммов. Увеличение углеводородокисляющего бактери-
опланктона в осеннии период связано с массовым отмиранием водноИ растительности и привносом биогенных веществ с берегов водоемов, что согласуется с данными А.В. Ку-ракова с соавт. [2].
В углеводородокисляющем бактериопланктоне озера Беленовское отмечено преобладание штаммов с каталазнои активностью в пределах от 3,1 до 4,5 усл. ед., большая часть которых способна к потреблению нефтепродуктов в качестве единственного источника углерода и энергии. В мезотрофном оз. Рудничное численно доминировали штаммы с более высокими значениями каталазноИ активности от 4,5 до 6,0 усл.ед. Наиболее высокие значения каталазной активности были отмечены среди грамнегативных видов рода Pseudomonas, среди грампозитив-ных штаммов высокие значения активности были отмечены у бактерий рода Xanthobacter. С одной стороны, распространенность и вы-
Рисунок 4. Распределение бактерий в зависимости от выраженности каталазной активности (озеро Беленовское)
раженность каталазной активности выделенных штаммов зависела от их таксономической принадлежности. С другой, - присутствие в разнотипных водоемах штаммов с высоким уровнем каталазной активности демонстрирует их адаптивные возможности и пластичность данного признака микроорганизмов.
1.10.2014
Работа выполнена при поддержке грантов по программе фундаментальных исследований Президиума РАН «Живая природа: современное состояние и проблемы развития» проект № 12-П-4-1039, гранта Оренбургской области в сфере научной и научно-технической деятельности (соглашение №38 от 30.06.2014)
Список литературы:
1. Миронов О.Г. Биологические проблемы нефтяного загрязнения морей // Гидробиологический журнал. - 2000. - Т. 36. -№ 1. - С. 82-96.
2. Кураков А.В., Ильинский В.В., Котелевцев С.В., Садчиков А.П. Биоиндикация и реабилитация экосистем при нефтяных загрязнениях. - М.: Изд. «Графикон». - 2006. 336 с.
3. Гидрология СССР. Т. XLIII. Оренбургская область. / Под ред. Е.И. Токмачева. - М.: Недра. - 1972. 272 с.
4. Еремин М.Н. Оценка риска и управление безопасностью территорий региона. - Екатеринбург: УрО РАН. - 2003. 269 с.
5. Игнатенко М.Е. Характеристика симбиотических связей микроорганизмов в альгобактериальных сообществах природных водоемов. Автореф. дис. ... канд. биол. наук. Оренбург. - 2008. 20 с.
6. Гоголева О.А., Немцева Н.В., Бухарин О.В. Каталазная активность углеводородокисляющих бактерий // Прикл. биохимия и микробиология. - 2012. - Т. 48. - № 6. - С. 612-617.
7. Определитель бактерий Берджи. В 2-х томах. Т.2: пер. с англ. / Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уилльямса. - М.:Мир. - 1997. 368 с.
8. Вейант Р., Мосс У., Уивер Р., Холлис Д., Джордан Дж., Кук Э., Дейншвар М. Определитель нетривиальных патогенных граматрицательных бактерий (аэробных и факультативно анаэробных). Пер. с англ. - М.: Мир. - 1999. 791с.
9. Нестеренко О.А., Квасников Е.И., Ногина Т.М. Нокардиоподобные и коринеподобные бактерии. - Киев: Наукова Думка. - 1985. 334 с.
10. Бухарин О.В., Черкасов С.В., Сгибнев А.В., Забирова Т.М., Иванов Ю.Б. Влияние микробных метаболитов на активность каталазы и рост Staphylococcus aureus 6538 Р. // Бюлл. эксп. биол. 2000. - Т. 130. - № 7. - С. 80 - 82.
Сведения об авторах:
Немцева Наталия Вячеславовна, заведующий лабораторией водной микробиологии Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Росскийской академии наук, доктор медицинских наук, профессор Гоголева Ольга Александровна, старший научный сотрудник лаборатории водной микробиологии Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Росскийской академии наук, кандидат биологических наук 460000 г. Оренбург ул. Пионерская, 11, e-mail: [email protected]
