Відновлення спінового зонда в оцінці життєздатності біологічних об’єктів Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

КЛІТИННА БІОФІЗИКА

Фізика живого, Т. 16, No1, 2008. С.44-49. © Нардід О.А.

CELL BIOPHYSICS

УДК 577.325.33

ВІДНОВЛЕННЯ СПІНОВОГО ЗОНДА В ОЦІНЦІ ЖИТТЄЗДАТНОСТІ БІОЛОГІЧНИХ ОБ’ЄКТІВ

Нардід О.А.

Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, вул. Переяславська 23, 61015, м. Харків, Україна, е-mail: [email protected]; [email protected]

Надійшла до редакції 01.04.2008

Досліджено процес відновлення спінового зонда ТЕМПОН у суспензіях гепатоцитів, мітохондрій, мікросом і екстрактах плаценти людини (ЕПЛ). Установлено, що швидкість відновлення спінового зонда залежить як від типу біологічного об'єкта, у середовищі якого він перебуває, так і від активності центрів, що відновлюють, у цьому об'єкті. На прикладі екстрактів плаценти обговорюється можливість використання процесу відновлення спінового зонда для характеристики редокс-потенціалу водно-сольових ЕПЛ і як первинний тест на їхню біологічну активність.

Ключові слова: електронний парамагнітний резонанс, відновлення спінового зонда, суспензії мітохондрій та мікросом, біологічна активність, екстракти плаценти.

ВСТУП

Одними з перших відновлення іміноксильних вільних радикалів, які застосовуються як спінові зонди й мітки, виявили Вівер, Кокер та ін. [14, 16]. Автори цих публікацій, описуючи механізм відновлення іміноксильних радикалів, справедливо вважали, що він полягає в одноелектронному відновленні вільної валентності іміноксильного радикала пластохіноном з утворенням гідроксил-аміну. З того часу реакції відновлення іміноксильних радикалів у біологічних мембранах і клітинних органелах найрізноманітніших біологічних об'єктів вивчалися неодноразово.

Щодо природи відновників іміноксильних радикалів у біологічних системах дотепер дотримуються двох точок зору. Відповідно до однієї з них відновлення іміноксильного фрагмента в клітині може відбуватися за рахунок клітинних метаболітів - досить сильних донорів електронів і протонів. До них можна віднести: аскорбат,

гідразин, гідрохінон, сполуки, які містять

8Н- групи, перекиси ліпідів та ін. [4, 6, 13].

З другої точки зору щодо ферментативної природи відновників, спінові зонди, як будь-яка стороння речовина, потрапляючи в клітину, гідроксилується ланцюгами переносу електронів до неактивної форми. Деякі автори припускають, що можливим донором електронів є гідрохінони.

Проводилося моделювання взаємодії іміноксильних радикалів з хінонами в розчинах [11].

Наявні публікації, в яких не тільки підтверджуються висновки наведених досліджень, але й робиться спроба об'єднати дві точки зору на природу відновника [12]. Автори вважають, що донорами електронів, які відновлюють спінові зонди, є 8Н-групи ферментів, розташовані в електрон-транспортному ланцюзі.

У зв'язку з цим, наявні на сьогоднішній день літературні дані свідчать про те, що єдиний механізм відновлення спінових зондів до гідроксиламінів шляхом приєднання електрона й протона по вільній валентності в життєздатних біооб’єктах здійснюється ферментними

системами. Варто вважати, що у функціонуючих біологічних об'єктах спіновий зонд безпосередньо контактує з певними ділянками дихальних ланцюгів, приймаючи від них електрон.

Все вищевикладене дозволяє зробити висновок, що процес відновлення спінових зондів можна використати для оцінки активності й життєдіяльності тих або інших біологічних систем як у інтактному стані, так і після таких впливів, як температура, рН, іонна сила, іонізуюче випромінювання й інших. Відповідно до цього метою даної роботи є порівняльне вивчення процесу відновлення спінового зонду в біологічних суспензіях гепатоцитів, мітохондрій, мікросом і екстрактах плаценти, а також оцінка

інтенсивності цього процесу залежно від вихідного стану досліджуваних біологічних об'єктів, що дозволить проводити первинну оцінку біологічної активності, здатності змінювати свої функціональні властивості біоматеріалу.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

Гепатоцити виділяли із печінки білих щурів-самців неферментативним методом [9] з використанням перфузійного середовища, що містить 2 мМ ЕДТА.

Мітохондрії виділяли за допомогою диференціального центрифугування з незначною модифікацією описаного методу [7].

Мікросомальну фракцію з гомогенату печінки щурів одержували методом диференціального центрифугування при 105 000 g протягом б0 хв у середовищі, що містить 1,15% KCl і 0,5 мМ ЕДТА, pH 7,4 [1].

Для одержання водно-сольового екстракту із тканини плаценти відмиті фрагменти подрібнювали, потім гомогенізували на високошвидкісному гомогенізаторі MPW-302 (Польща) 5 хв. Додавали 0,15 М NaCl у співвідношенні 1:1 і через певний час еквілібрації при температурі 4°С центрифугували при 3000 g протягом 15 хв. Після фільтрації відбирали надосад для досліджень.

Окислювально-відновну активність біологічних суспензій досліджували методом ЕПР спінових зондів [3, 5] з використанням водорозчинного зонда

ТЕМПОН (2,2,б,б-тетра-метил-4-оксопіперидин-1-оксил) фірми "АМгісЬ". Даний іміноксильний радикал добре розчинний у воді й інших полярних розчинниках. Кінцева концентрація зонда в зразках становила 0,8х10-4М. Спектри ЕПР реєстрували на спектрометрі "Брукер" ER 100D (Німеччина) зі стандартною термоприставкою. Розгортка магнітного поля становила 100 Гс. Постійна часу дорівнювала

0,5 с. Час розгорнення становив 100 с. У дослідженнях використовували скляні капіляри з внутрішнім діаметром 500 нм і об’ємом 0,1 мл. Контрольні досліди показали, що при описаних умовах не відбуваються зміни спектрів у результаті перемодуляції або інерційних ефектів.

Для стандартизації умов експерименту одночасно із сигналом ЕПР зонда реєстрували сигнал стандарту, що представляє собою кристал, решітка якого вміщує іони хрому.

Як параметр кінетики відновлення спінових зондів використовували відносні зміни амплітуди середньопольового компонента спектра ЕПР зонда (I) в залежності від часу.

Статистична обробка результатів проводилась за допомогою програм “Statistica v5.0” і “Origin б.1” (OriginLab Corporation, США). У випадках експонен-

ціальних залежностей типове значення коефіцієнта детермінації Я-квадрат становило 0,985 - 0,999.

Результати досліджень було оброблено статистично з використанням параметричного критерію Стьюдента-Фішера. Достовірно відмінними вважали результати при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ

Для визначення можливості щодо використання процесу відновлення спінового зонда до оцінки життєздатності біологічних об'єктів були проведені дослідження деяких біологічних суспензій, що перебувають у різних станах. Процес відновлення спінового зонда був вивчений у суспензіях гепатоцитів, мітохондрій, мікросом і екстрактах плаценти. На рис. 1 наведені криві відновлення спінового зонда при взаємодії з цими біологічними суспензіями. Найбільша швидкість відновлення зонда спостерігається в суспензії гепатоцитів (крива 1), менша швидкість - в екстрактах плаценти, далі в суспензії мітохондрій і в суспензії мікросом (криві 2, 3, 4).

110

100 90 80

“5 70

о

.І 60 ш

~ 50

40

ЗО 20

О 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22

Час (хв)

Рис. 1. Відновлення спінового зонда ТЕМПОН у суспензії гепатоцитів (1); водно-сольових екстрактах плаценти (2); суспензіях мітохондрій (3) і мікросом (4).

Хімічні реакції в живих системах, у тому числі й реакція відновлення спінового зонда, як і всі класичні хімічні реакції, характеризуються такими параметрами, як константа швидкості, порядок реакції, залежність від температури й т.п. Для опису реакції відновлення спінового зонда при контакті з біологічними об'єктами необхідно знати залежність швидкості реакції відновлення спінового зонда від кількості центрів, що відновлюють.

Раніше відзначалося, що реакція відновлення спінового зонда в біологічних об'єктах протікає в результаті взаємодії спінового зонда з певними ділянками ланцюга переносу електронів. Відповідно до цього процес відновлення спінового

Нардід О.А.

зонда при взаємодії з досліджуваними об'єктами має вигляд:

к

>N-0' + е- + Н ^ >N-0^ (1)

Необхідно відзначити, що в досліджуваних системах не відбувається витрати компонента реакції, що є донором електронів. Концентрація протонів у середовищі висока, і спостерігається тільки зміна концентрації іміноксилу й гідроксиламіну. Тому опис швидкості даної реакції можно записати в такому виді [5]: йе

-— = ке, (2)

аї

де С-концентрація іміноксилу; к-константа швидкості реакції. Якщо при цьому проінтегрувати дане рівняння з початковими умовами с=с0 1=0, то отримаємо наступне співвідношення:

c = c0e

(3)

або

ln c = ln c0 - kt (4)

Із рівняння (4) виходить, що для реакції першого порядку графік у координатах lnc, t повинен мати вигляд прямої лінії (напівлогарифмічна анаморфоза), тангенс кута нахилу якої дорівнює константі швидкості реакції.

Необхідно також ураховувати, що величина пікової амплітуди центрального компонента спектра ЕПР зонда I за інших рівних умов пропорційна його концентрації c. Зниження кількості радикальних центрів оцінюють по зменшенню амплітуди сигналу ЕПР [2, 5, 8, 15].

Залежність відновлення спінового зонда ТЕМПОН від часу для прикладу в суспензії гепатоцитів і його напівлогарифмічна анаморфоза наведені на рис. 2. Видно, що в координатах lnc, t залежність загибелі зонда являє собою пряму лінію. Це свідчить про те, що реакція відновлення спінового зонда стосовно іміноксилу як компонента реакції є реакцією першого порядку. У табл. 1 представлені константи швидкостей відновлення зонда в досліджених біологічних суспензіях, обчислені за тангенсом кута нахилу відповідних напівлогарифмічних анаморфоз.

Наведені в таблиці дані свідчать про те, що константи швидкостей відновлення зонда різні для різних видів біологічних об'єктів. Таким чином, ми бачимо, що відновлення спінового зонда в живих біологічних об'єктах по витраті іміноксильного радикала підкоряється кінетиці реакції першого порядку, а константа швидкості реакції відновлення зонда залежить від виду й особливостей метаболізму досліджуваного живого об'єкта.

Рис. 2. Залежність

Час (хв)

відновлення спінового зонда ТЕМПОН від часу в суспензії гепатоцитів (1) і його напівлогарифмічна анаморфоза (2).

Таблиця 1

Константи швидкостей відновлення спінового зонда при взаємодії в біологічних суспензіях (M±m; п=6)

Об’єкти кеф (хв-1)

Гепатоцити 0,072±0,009

Екстракти 0,029±0,004

плаценти

Мітохондрії 0,012±0,001

Мікросоми 0,009±0,002

Кінетика відновлення спінового зонда буде залежати також від кількості центрів, що відновлюють. Для вивчення такої залежності було проведено дослідження відновлення зонда в суспензії гепатоцитів з різною концентрацією клітин. Ці досліди проводили за наступною схемою: наявну суспензію клітин з концентрацією загального білка 53 мг/мл (вихідна концентрація) розводили середовищем інкубації в 1,2; 1,5; 2 рази з відповідним зменшенням концентрації загального білка. Кількість клітин була пропорційна концентрації білка в кожному конкретному випадку. Припускаючи, що в кожній окремій клітині кількість центрів, які відновлюють, однакова й постійна, зміна кількості клітин приводить до пропорційної зміни кількості центрів, які відновлюють. Результати експерименту представлені на рис. 3. З рисунка видно, що швидкість відновлення спінового зонда зменшується зі зменшенням концентрації клітин. Теплова інактивація (рис. 3, залежність 5)

ферментів порушує процеси, пов'язані з переносом електронів, і зонд не відновлюється. У таблиці 2 наведені константи швидкості відновлення спінового зонда в суспензії з різною концентрацією центрів, що відновлюють.

kt

Таблиця 2

Константи швидкостей відновлення спінового зонда в суспензії гепатоцитів при різній концентрації центрів, що відновлюють

(М±т; п=6)

Час (хв)

Рис. 3. Відновлення спінового зонда ТЕМПОН при взаємодії з гепатоцитами в різному розведенні: контроль (1); розведення в 1,2 рази (2); розведення в 1,5 рази (3); розведення в 2 рази (4); денатуровані гепатоцити (5).

З таблиці видно, що зменшення кількості центрів, що відновлюють, внаслідок зменшення концентрації клітин в 2 рази, приводить до зменшення константи швидкості реакції, приблизно в 2 рази, тому за цими співвідношеннями можна визначати концентрацію загального білка або кількість клітин у суспензії.

Можна також представити дані по зміні швидкостей відновлення спінового зонда від різної концентрації клітин у трохи іншому виді, наприклад, у вигляді залежності часу напівзагибелі зонда від концентрації білка й одержати калібрувальну лінію, по якій, знаючи час напівзагибелі зонда, можна визначити концентрацію загального білка або кількість клітин у суспензії (рис. 4).

Аналогічно змінюється швидкість відновлення спінового зонда при розведенні суспензії мітохондрій. На рис. 5 представлено залежності відновлення спінового зонда ТЕМПОН у суспензіях мітохондрій з різним розведенням. З

експериментальних даних, наведених на рисунку так як і у випадку з гепатоцитами можна

побудувати напівлогарифмічні анаморфози й

визначити константи швидкості реакції відновлення зонда залежно від кількості

мітохондрій у суспензії.

Концен- 181

грація білку (мг/мл) 53 44 35 26,5 16-

кеф (хв1) 0,083 ±0,011 0,072 ±0,009 0,061 ±0,008 0,046 ±0,008 14-

12

£

10

”1— 25

зо

—І— 35

І— 40

І— 45

“І— 50

55

С, (мг/мл)

Рис. 4. Залежність часу напіввідновлення спінового зонду при взаємодії з гепатоцитами від концентрації загального білка.

Час (хв)

Рис. 5. Відновлення спінового зонда ТЕМПОН при взаємодії з мітохондріями в різному розведенні: контроль (1); розведення в 1,2 рази (2); розведення в 1,5 рази (3); розведення в 2 рази (4).

Більш складною системою, як за своїм складом, так залежністю окислювально-відновних процесів спінового зонда від часу є водно-сольовий екстракт плаценти людини (ЕПЛ). На характер такої залежності можуть впливати присутність декількох активних центрів з різними константами швидкості реакцій відновлення, різний час проникнення молекул зонда до активних центрів, залучення радикалів у реакції рекомбінації, протікання в екстрактах реакцій відновлення нітроксилів і їхнього окислювання й т.п. Тобто , крива зміни

Нардід О.А.

інтенсивності сигналу ЕПР спінового зонда в залежності від часу в такій системі відображає складний, багатофакторний процес взаємодії нітроксильного радикала з активними центрами водно-сольових ЕПЛ, а також динаміку окислювально-відновної активності екстрактів при фіксованій температурі. Частково такий складний характер залежності спостерігається й у мікросомальних суспензіях. На рис. 6 представлені залежності відновлення спінового зонда в екстрактах плаценти трьох породілей. З рисунка видно, що незважаючи на складний склад такої біологічної системи, залежності швидкості відновлення спінового зонда в екстрактах відображають структурно-функціональні

особливості вихідного матеріалу. При однакових концентраціях загального білка (13 мг/мл) у досліджених екстрактах спостерігаються достовірні відмінності швидкостей відновлення в екстрактах плаценти другої породіллі порівняно з першою і третьою. Це підтверджується й значеннями констант швидкостей відновлення спінового зонда.

80-

•І 60-

0

1 .3

со

~ 40

20-

ч

Час (хв)

Рис. 6. Відновлення спінового зонда ТЕМПОН в екстрактах плаценти трьох породілей (1, 2, 3).

Так, для процесу відновлення спінового зонда в екстрактах плаценти другої породіллі кеф =0,029 хв"

1, а для плаценти першої і третьої - 0,024 хв"1 і 0,023 хв"1, відповідно. У той же час порівняльні дослідження впливу часу екстракції (2 й 12 годин) водно-сольовим розчином на окислювально-відновну активність екстрагованих ЕПЛ показали, що збільшення часу екстракції до 12 годин при 4°С не приводить до істотного підвищення окислювально-відновної активності

одержуваних екстрактів. Так, константа швидкості відновлення спінового зонда в екстрактах плаценти після 2-годинної екстракції становить

0,0292±0,0023

хв

а після 12-годинної

0,0295±0,0024 хв" . Тобто у цьому випадку для

повного екстрагування біологічно активних сполук фізіологічним розчином цілком достатньо й 2-х годин. Наведені експериментальні дані дозволяють висловити припущення, що параметри швидкості відновлення стабільних нітроксильних радикалів можуть бути використані для оцінки редокс-потенціалу водно-сольових ЕПЛ, а отже бути первинним тестом на їхню біологічну активність. Такий тест може використовуватися для оцінки вихідного матеріалу (плаценти), тобто його придатності для використання екстрактів у медичній практиці, що визначається фізіологічними особливостями, можливими патологіями вагітної жінки, методами його одержання, часу екстрагування й т.п. Можлива оцінка також впливу факторів зберігання (строк і температура кріоконсервування), стерилізації плаценти (або її екстрактів), а також інших впливів на вихідний матеріал [10].

ВИСНОВКИ

Таким чином, у результаті проведених досліджень на різних біологічних об'єктах (гепатоцитах, мітохондріях, мікросомах і екстрактах плаценти) було показано, що в цих біологічних суспензіях відбувається відновлення спінового зонда. Швидкість відновлення спінового зонда залежить як від типу біологічного об'єкта, з яким він контактує, так і від активності і кількості центрів, що відновлюють, у цьому об'єкті. При цьому теплова денатурація інактивує процеси, пов'язані з функціонуванням ферментів, що беруть участь у відновленні спінового зонда, у результаті чого відновлення не відбувається. Такі взаємозв'язки дозволяють використати процес відновлення спінового зонда в різних біологічних об'єктах для первинної оцінки їх життєздатності, біологічної активності, а також різних впливів, що ушкоджують даний біооб'єкт.

Література

1. Арчаков А.И. Оксигеназы биологических мембран.-М.: Наука, 1983. - 56 с.

2. Гендель Л.Я., Круглякова К.Е. Метод спиновых меток и зондов. - М.: Наука, 1986. -194 с.

3. Жданов Р.И. Парамагнитные модели биологически активных соединений. - М.: Наука, 1981. - 280 с.

4. Кольтовер В. К. Применение метода спинового зонда в исследовании биологических мембран // Успехи биологической химии: Сб. науч. тр.- М., 1974.-№15.- С. 232-254.

5. Кравцов Ю.В. Исследования методом спинового зонда некоторых структурных и функциональных характеристик биологических систем: Дис.... канд. биол. наук.- М.,1977.- 195 с.

6. Лихтенштейн Г.И., Кольтовер В.К. Метод спиновых меток в молекулярной биологии // Итоги

науки и техники (серия «Молекулярная биология»): Сб. науч. тр.- М.: ВИНИТИ, 1973.- С. 6-81.

7. Мосолова И.М., Горская А.И., Шольц К.Ф. и др. Выделение интактных митохондрий из печени крыс.: Методы современной биохимии.-М.: Наука.-1975.-С. 45-47.

8. Паршина Е.Ю., Гендель Л.Я., Рубин А.Б. Влияние

новых гибридных антиоксидантов - ихфанов - на кинетику аскорбат-индуцированного восстановления радикальных центров спиновых зондов в липосомах // Биофизика.-2005. - Т.50, вып.4.-

С. 676-679.

9. Петренко А.Ю., Сукач А.Н., Росляков А.Д., и др.

Выделение гепатоцитов крыс неферментативным методом: детоксикационная и дыхательная

активность // Биохимия.-1991 - Т.56, №9.-

С. 1647-1651.

10. Репина С.В., Нардид О.А., Розанова Е.Д., Цым-бал Л.В., Щетинский М.И., Науменко Е.И. ЭПР-исследование окислительно-восстановительных реакций водно-солевых экстрактов плаценты человека: влияние температуры хранения и времени экстрагирования // Проблемы криобиологии.-2005.-Т. 15, №4.- С. 591-598.

11. Чумаков В.М. Идентификация и исследование методом ЭПР природных семихинонных свободных радикалов в биологических системах: Автореф. дис.... канд. биол. наук.- М., 1969.-24 с.

12. Вaldassare J.I., Robertson D.E., Mc Afee A.., Ho Chien G. A spin-label study of energy coupled active transport in Escherichia coli membrane vesicles // Biochemistry.-1974. - Vol. 13.- P. 5210-5214.

13. Brown L.R., Wuthrich K. A spin label study of lipid oxidation catalyzed by heme proteins // Biochem. Biophys. Acta.- 1977. - Vol. - 464. - P. 356-369.

14. Corker G.A., Klein M.P., Calvin M. Chemical trapping of a primary quantum conversion product in photosynthesis // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.-1966.-Vol. 56, N5.- P. 1365-1369.

15. Matsumoto K., Hyodo F., Matsumoto A., Koretsky A.P., Sowers A.L., Mitchell J.B., Krishna M.C. High-Resolution Mapping of Tumor Redox Status by Magnetic Resonance Imaging Using Nitroxides as Redox-Sensitive Contrast Agents // Clin. Canc. Res.-2006.- Vol. 12.- P. 2455-2462.

16. Weaver E., Chon H.P. Spin label studies in

chlamidomonas // Science.- 1966.- Vol.153.-

P. 301-305.

ВОССТАНОВЛЕНИЕ СПИНОВОГО ЗОНДА В ОЦЕНКЕ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

Нардид О.А.

Исследован процесс восстановления спинового зонда ТЕМПОН в суспензиях гепатоцитов, митохондрий, микросом и экстрактах плаценты человека (ЭПЧ). Установлено, что скорость восстановление спинового зонда зависит как от типа биологического объекта, в среде которого он находится, так и от активности восстанавливающих центров в этом объекте. На примере экстрактов плаценты обсуждается возможность использования процесса восстановления спинового зонда для характеристики редокс-потенциала водно-солевых ЭПЧ и в качестве первичного теста на их биологическую активность.

Ключевые слова электронный парамагнитный резонанс, восстановление спинового зонда, суспензии митохондрий и микросом, биологическая активность, экстракты плаценты.

REDUCTION OF SPIN PROBE IN ESTIMATION OF VIABILITY OF BIOLOGICAL OBJECTS Nardid O.A.

The reduction process of TEMPON spin probe in the suspensions of hepatocytes, mitochondria, microsomes and human placenta extracts (HPEs) has been studied. The rate of spin probe has been established to depend both on the type of biological object, in the environment of which it is located, and on the activity of the reduction centers in this object. On the example of placenta extracts the possibility using the reduction process of spin probe is under discussion for the characteristics of redox-potential of aqueous-saline HPE and as a primary test on their biological activity.

Key words: electron spin resonance, spin probe reduction, biological suspensions, biological activity, placenta extracts.