CC BY
207
[гиена и санитария 3/2014
О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 614.7:616-008.9-074-092.9
Чаховский П.А.1, Янцевич А.В.2, Дмитроченко А.Е.2, Иванчик А.В.2
ВЭЖХ-МС-МЕТОДИКА АНАЛИЗА ЛИПИДНЫХ ПРОФИЛЕЙ СЫВОРОТКИ КРОВИ
морских свинок для выявления ранних изменений метаболизма при воздействии загрязнителей окружающей среды
ТУ «Республиканский научно-практический центр гигиены», 220012, г. Минск, Республика Беларусь; ^Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси, 220141, г. Минск, Республика Беларусь
Воздействие антропогенных факторов оказывает многостороннее влияние на организм человека и животных. В связи с их комплексным воздействием выявление негативных эффектов отдельных факторов представляет собой довольно сложную задачу. Метаболомная методология, позволяющая преодолеть указанные сложности, была применена при оценке характера и степени влияния отходов производства калийных удобрений на липидные профили экспериментальных животных при интраназальной затравке отходами производства калийных удобрений и потреблении питьевой воды, полученной из источников, расположенных в зоне потенциального действия калийного производства. Выделение липидов из сыворотки проводили с помощью специально разработанной методики, основанной на твердофазной экстракции, позволяющей удалить из образцов холестерин. Каждый образец был подвергнут анализу методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрической детекцией (ВЭЖХ-МС), после чего полученные хроматограммы обрабатывали с использованием метода главных компонент (МГК) и кластерного анализа. Разработанная методика позволяет эффективно разделять гидрофобные метаболиты в сыворотке крови. Установлен липидный профиль сыворотки крови опытных животных, в частности содержание фосфолипидов и оксисте-роидов, и обнаружены различия в метаболических процессах между опытными и контрольными животными. В сыворотке крови экспериментальных животных была повышена по сравнению с контрольной группой концентрация оксистероидов.
Ключевые слова: стероиды; липиды; сыворотка крови; метаболический профиль; промышленные отходы.
P. A. Chakhovskiy1, A.V Yantsevich2, A. E. Dmitrochenko2, A. V. Ivanchik2 — ANALYSIS OF SERUM LIPID PROFILES IN GUINEA PIGS FOR EARLY DETECTION OF CHANGES IN METABOLISM UNDER EXPOSURE TO ENVIRONMENTAL CONTAMINANTS
1The Republican Scientific and Practical Centre of Hygiene, Minsk, Republic of Belarus, 220012; 2The Institute of Bioorganic Chemistry, Minsk, Republic of Belarus, 220141
для корреспонденции: Чаховский Павел Анатольевич, chahovsky@gmail . com
94
The exposure to anthropogenic factors has a multifaceted impact on the body of humans and animals. Due to their complex influence the detection of negative effects of the certain factors is a rather complicated task. Metabolomic methodology which permits to overcome these difficulties, has been applied in the evaluation of the nature and degree of the impact of potash fertilizers production waste on lipid profiles of experimental animals after intranasal inoculation with potassic fertilizer production waste and consumption of drinking water obtainedfrom sources located in the zone ofpotential action ofpotassic fertilizer production. Isolation of lipids from serum was performed with the help of specially developed technique based on solid-phase extraction of samples which allows to remove cholesterin from the samples. Each sample was subjected to HPLC -MS analysis, after which the obtained chromatograms were treated with the use of the method of principal component analysis and cluster analysis. The developed technique allows to efficiently separate hydrophobic metabolites in blood serum. There was established serum lipid profile of experimental animals, in particular the content of phospholipids and oxysteroids, and there were found differences in the metabolic processes of the test and control animals. It is shown that in the serum of experimental animals, there is observed an increased concentration of hydroxysteroid as compared with the control group,.
Key words: steroids, lipids, blood serum, metabolic profile, industrial wastes.
Введение
Одна из важнейших задач системной биологии и функциональной генетики - интегрирование данных протеомики, транскриптомики и информации о метаболических процессах, происходящих в организме. Любое заболевание либо патологический процесс, протекающий в организме, отражается на содержании низкомолекулярных метаболитов в тканях и крови. Для интегральной характеристики низкомолекулярных метаболитов плазмы крови в 1971 г. был введен термин «метаболический профиль» [1]. Поскольку одновременный анализ нескольких классов метаболитов чрезвычайно сложен и практически нереализуем, для изучения метаболических профилей обычно используют серию методов, включая ядерномагнитно-резонансную (ЯМР) спектроскопию высокого разрешения [2] и хромато-масс-спектрометрию [3].
Как правило, при проведении метаболомных исследований ограничиваются определенной группой веществ, отделяемых от других компонентов при пробоподготовке. Получаемые при этом групповые данные легче интерпретировать.
Метаболические профили (в частности, мочи и плазмы крови) могут быть использованы для определения характера физиологических изменений, вызванных поступлением в организм токсичных соединений [4]. Во многих случаях наблюдаемые изменения могут дать дополнительную характеристику специфических поражений, например печени и жировой ткани.
Анализ содержания стероидов и липидов в сыворотке крови обладает большим диагностическим потенциалом [5]. Липидный состав сыворотки крови, стероидные гормоны, их предшественники и продукты их метаболических превращений характеризуют множество функциональных параметров организма. Эти вещества играют важную координирующую роль в регуляции метаболизма и сердечно-сосудистой функции, участвуют в ответе организма на острый и хронический стресс.
Стероидный профиль является уникальным диагностическим критерием ряда гинекологических и онкологических заболеваний, связанных с нарушением синтеза и метаболизма стероидных гормонов, при этом некоторые из них могут быть диагностированы только по стероидному профилю [6]. В профильном анализе весьма значима возможность использования абсолютных величин как простых переменных и сравнения их с нормой. Однако изменение соотношения величин может быть более важным. Кроме того, стероидный профиль дает информацию о большом количестве стероидов одновременно.
Определение стероидного профиля сыворотки крови - эффективный метод выявления почти всех нарушений метаболизма стероидов, который позволяет поставить
точный диагноз во многих клинических ситуациях, например при врожденной гиперплазии коры надпочечников, гиперальдостеронизме I типа, первичном гиперальдостеронизме, болезни Иценко-Кушинга, недостаточности надпочечников и др. Стероидный профиль важен при диагностике нарушений половой дифферен-цировки и функции половых желез, а также гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой недостаточности [7].
Избыточное поступление соли, являющейся превалирующим компонентом отходов калийных удобрений, в организм экспериментальных крыс с избыточной массой тела приводит к излишней активации синтеза альдо-стерона и вызывает гипертензию и поражение почек с метаболическим синдромом [8, 9].
В регионах промышленного производства с высокой степенью контаминации окружающей среды уровень заболеваемости населения, как правило, выше, чем в относительно «чистых» регионах. Объектом наших исследований был выбран г. Солигорск, расположенный в зоне масштабной добычи и переработки калийных руд. В районах солеотвалов и шламохранилищ калийных комбинатов образовалась зона хлоридно-натриевого засоления, которая охватывает подземные воды на глубину более 100 м, что может влиять на загрязнение источников питьевого водоснабжения и атмосферного воздуха.
Для оценки влияния загрязнения отдельных компонентов окружающей среды в регионе промышленного производства калийных удобрений нами проведен анализ липидных профилей сыворотки крови как индикатора ранних метаболических нарушений под влиянием смеси химических веществ.
Цель работы - выявление метаболических изменений у лабораторных животных при экспозиции к отходам производства калийных удобрений и потреблении питьевой воды, полученной из источников, потенциально подвергнутых влиянию отходов производства, с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрической детекцией (ВЭЖХ-МС).
Объектом исследования являлась сыворотка крови экспериментальных животных (морских свинок) опытной и контрольной групп.
Материалы и методы
Экспериментальные исследования проведены на 35 морских свинках (17 самок и 18 самцов) массой тела 305-347 г.
Условия содержания животных и их рацион соответствовали стандартизованным требованиям. Экспериментальные группы формировали с учетом массы тела и пола:
95
[гиена и санитария 3/2014
- опытная группа (затравка отходами промышленного производства калийных удобрений и питьевой водой из системы водоснабжения г. Солигорска), 20 особей (10 самок и 10 самцов);
- контрольная группа (затравка изотоническим раствором хлорида натрия для исключения результатов влияния стрессового фактора, вызванного процедурой затравки), 15 особей (8 самцов и 7 самок).
При проведении эксперимента ежедневно наблюдали за общим состоянием животных, потреблением корма и воды.
Для моделирования хронического ингаляционного воздействия (12 нед) отходов производства калийных удобрений руководствовались МУ .№11-11-10-2002 «Требования к постановке токсиколого-аллергологических исследований при гигиеническом нормировании белоксодержащих аэрозолей в воздухе рабочей зоны», включая определение затравочной дозы. Образцы из солеотвалов растирали в мраморной ступке до однородного пылеобразного состояния, растворяли в дистиллированной воде до необходимой концентрации с учетом массы тела экспериментальных животных (массу тела контролировали еженедельно для корректировки дозы). Расчетные дозы составили: на начало эксперимента -2,028 мг/0,1 см3, через 4 нед - 2,85 мг/0,1 см3, через 6 нед - 3,17 мг/0,1 см3, через 8 нед и до конца эксперимента 3,8 мг/0,1 см3 .
Морскую свинку без наркотизации фиксировали в положении на спине с приподнятой головой, пипеточ-ным дозатором вводили поочередно в ноздри (дробно) дозу теплого раствора (в течение 2-3 мин) таким образом, чтобы исключить чихание. Возникающие «хлюпающие» звуки подтверждали проникновение раствора в дыхательные пути.
Опытная группа животных «вдыхала» смесь ежедневно однократно 5 дней в неделю в течение 12 нед. Животные контрольной группы «вдыхали» физиологический раствор (0,9% NaCl).
Для отбора биологического материала животных наркотизировали (эфирный наркоз), после декапитации собирали кровь. Сыворотку получали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин, хранили при -20 С для дальнейших исследований. В сыворотке крови анализировали фосфолипиды, оксистероиды, жирные кислоты.
Пробоподготовка. К сыворотке крови добавляли внутренний стандарт - прогестерон до достижения концентрации 10-5 М (10 мкл на 1 мл образца). Затем для осаждения белков, содержащихся в образце, и экстракции стероидов добавляли метанол до конечной концентрации 70% (на 1 мл образца 2,33 мл метанола) с последующим центрифугированием в течение 15 мин при 10 000 g. Белки, содержащиеся в образце, образовывали при этом плотный осадок. Супернатант отделяли от осадка и пропускали через предварительно кондиционированную колонку для твердофазной экстракции (ТФЭ-колонка), содержащую 100 мг октадецилсилильного силикагеля. ТФЭ-колонку кондиционировали последовательным пропусканием 2 мл метанола, 2 мл воды и 2 мл 70% метанола. В первой стадии с колонкой связывается холестерин, содержание которого в плазме крови и других биологических жидкостях достаточно велико, а также ряд других высокогидрофобных липидов. После связывания холестерина колонку дополнительно промывали 2 мл 70% метанола. При высоком содержании холестерина в образце или большом объеме образца ис-
пользовали ТФЭ-колонку с большим содержанием сорбента. Элюаты объединяли и выпаривали. Выпаривание осуществляли при 50°С в струе инертного газа. Сухой остаток растворяли в 500 мкл метанола и центрифугировали в течение 10 мин при 10 000 g. При этом оседали полярные, нерастворимые в метаноле соединения. Супернанант отделяли от осадка и разбавляли водой до концентрации метанола 10%. Полученный раствор пропускали через предварительно кондиционированную ТФЭ-колонку (пропускали 2 мл метанола, 2 мл воды и 2 мл 10% метанола) и промывали 2 мл 10% метанола. Связавшиеся с колонкой стероиды элюировали 3 мл 80% метанола. Раствор выпаривали и сухой остаток растворяли в 100 мкл метанола. Полученный раствор анализировали с использованием ВЭЖХ-МС.
ВЭЖХ анализ. Анализ проводили на хроматографе Accela, оснащенном масс-спектрометрическим детектором LCQ-Fleet. Разделение выполняли на колонке Cosmosil 5C18-MS-II с геометрическими параметрами 4,6*150 мм («Nacalai Tesque», Япония).
Программа разделения (растворитель А - вода, растворитель В - метанол, скорость потока 500 мкл/мин): в течение 5 мин 60% В, 12 мин - линейный градиент 60-95% В, 10 мин - 95% В, 8 мин - линейный градиент 95-100% В, 5 мин - 100% В, 5 мин - 60% В.
Для масс-спектрометрического анализа использовали источник химической ионизации при атмосферном давлении (APCI). Параметры источника ионизации: температура испарителя - 350°C, поток осушающего газа - 35 ед., поток вспомогательного газа - 5 ед., температура капилляра - 275°С, напряжение на капилляре - 18 В, напряжение на ионном объективе - 80 В. Использовали режим сканирований, зависимых от данных (Data Dependent™), с применением ионной ловушки в диапазоне сканирования 50-1000 m/z.
Хроматограммы, полученные с помощью масс-спектрометрического детектора в режиме химической ионизации (полный ионный ток), переводили в текстовый формат с использованием программы Qual Browser из пакета Xcalibur (“Thermo Sci”, США). Полученную информацию обрабатывали с применением реализованного в пакете Statistica 10 метода главных компонент и инструментов для кластерного анализа и построения дендрограмм. Для расшифровки масс-спектров и идентификации индивидуальных соединений использовали справочник [10].
Результаты и обсуждение
В качестве исходной методики для адаптации применяли метод твердофазной экстракции стероидов из сыворотки и плазмы крови, описанный в руководстве фирмы «Macherey-Nagel” Solid phase extraction. Application guide, которое содержит рекомендации по применению колонок для твердофазной экстракции. Адаптированная методика пробоподготовки с твердофазной экстракцией позволила эффективно выделить фосфолипиды, окси-стероиды и жирные кислоты из сыворотки крови морских свинок.
Описанная методика хроматографического разделения дает возможность эффективно разделять как стероидные гормоны, так и липиды, присуствующие в сыворотке.
Согласно описанным методикам проведен анализ образцов. На рис. 1 (см. 2-ю полосу обложки) для примера приведены наложенные хроматограммы, полученные при анализе 3 образцов из опытной группы (выделены
96
Рис. 4. Масс-спектры вещества со временем удерживания 21,5 мин: а - химическая ионизация при атмосферном давлении в отрицательном режиме; б - химическая ионизация при атмосферном давлении в положительном режиме.
красным цветом) и 3 образцов из контрольной группы (выделены синим цветом). Аналогичная картина наблюдалась и в других случаях.
Для обработки указанных массивов данных применили метод главных компонент (МГК) и кластерный анализ, который позволил выявить различия липидных профилей между контрольной и опытной группами. МГК-график 1-й и 2-й главных компонент, полученных
при понижении размерности данных, представлен на рис. 2 (см. 2-ю полосу обложки). На графике легко заметить, что точки объединяются в 2 группы, локализованные соответственно в 1, 4 и 2, 3 квадрантах. При этом точки, соответствующие опытным образцам, преимущественно попадают в 1 и 4 квадрант, точки, соответствующие контрольным образцам, локализованы во 2 и 3 квадрантах. Дендрограмма, полученная при кла-
97
[гиена и санитария 3/2014
Идентификация присутствующих на хроматограмме пиков
Время удерживания, мин Основные пики в "+"-режиме Основные пики в "-"-режиме
19,15 393,7 446,8
412,8 479,6
430,7 491,8
448,7 493,5 623,4 524,4
19,35 87 227 271 335,5 353,3 371,2 389.1 448.2 493.3 405,4
21,50 316,1 390,0
372,8 446,6
430.3 448.4 779,1
23,8 319.4 391,6 429.5 783,2
24,35 414,8 448,8
432,3 516,4
449,9 897,4
31,73 313,3 330,9
33,9 231.5 245.5 263,3 281,1 295.1 305.2 371.3 521.0 663.1 279,4
42,52 319,9
338,4
340.2
353.3
370.1
383.3
401.4
419.1
Вещество
Фосфатидилхолин
Арахиновая кислота
Фосфатидная кислота 42:4
Арахиновая и докозате-траеновая кислоты
Докозапентаеновая
кислота
Линолевая кислота
Дигидроксихолестерин
стерном анализе, приведена на рис. 3. Таким образом, статистический анализ хроматографических данных свидетельствует о различиях метаболических процессов, протекающих в организмах экспериментальных животных, относящихся к контрольной и опытной группам.
Для выявления конкретных метаболических изменений были расшифрованы масс-спектры и идентифи-
цированы индивидуальные соединения (см. таблицу). Недостаточный для анализа объем образца не позволил обнаружить изменения профиля стероидных гормонов в сыворотке. Однако липиды с промежуточной полярностью детектировались на хроматограмме.
Индивидуальные соединения идентифицировали посредством анализа масс-спектров веществ, записанных при различных режимах ионизации. Так, масс-спектр вещества в двух режимах ионизации со временем удерживания 21,5 мин представлен на рис. 4. Анализ данного спектра показал, что вещество является диацил-sn-глицерофосфатом с молекулярной массой 780 (R1(311) = 20:0 жирная кислота (арахиновая), R2(331) = 22:4 жирная кислота (докозатетраеновая)).
Установлено, что хроматографический пик со временем удерживания 42,52 мин соответствует диги-дроксихолестерину, предположительно одному из предшественников в биосинтезе желчных кислот. Различия в содержании оксистероидов в сыворотке крови свидетельствует о возможном нарушении метаболизма желчных кислот. Можно заметить, что на хроматограммах, представленных на рис. 1, в сыворотке крови экспериментальных животных наблюдается повышенная по сравнению с контрольной концентрация оксистеро-идов (пики со временем удерживания 35-45 мин).
заключение. Использованная в работе методика позволяет с высокой степенью эффективности выявлять ранние нарушения липидного обмена при воздействии поллютантов окружающей среды. Полученные результаты свидетельствуют о том, что интраназаль-ное введение водных растворов солевых отвалов экспериментальным животным Cavia porcellus приводит к изменению метаболизма липидов и оксистероидов. В частности, наблюдаемое повышенное содержание предшественников желчных кислот (оксистероидов) у животных может быть связано с нарушением функции печени и ферментов, участвующих в биосинтезе желчных кислот. Таким образом, описанный подход может быть использован для выявления нарушений метаболизма липидов у жителей регионов с техногенным загрязнением.
Литер атура
1. Horning E.C., Horning M.G. Metabolic profiles: gas-phase methods for analysis of metabolites . Clin. Chem. 1971; 17(8): 802-9.
2. Constantinou M.A., Tsantili-Kakoulidou A., Andreadou I., Iliodro-mitis E.K., Kremastinos D.T., Mikros E. Application of NMR-based metabonomics in the investigation of myocardial ischemia-reperfusion, ischemic preconditioning and antioxidant intervention in rabbits . Eur. J. Pharm. Sci. 2007; 30(3-4): 303-14.
3. Lu W., Bennett B.D., Rabinowitz J.D. Analytical strategies for LC-MS-based targeted metabolomics. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2008; 871(2): 236-42.
4. Novotny M.V, Soini H.A., Mechref Y. Biochemical individuality reflected in chromatographic, electrophoretic and mass-spectro-metric profiles. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2008; 866(1-2): 26-47.
5. German J.B., Gillies L.A., Smilowitz J.T., Zivkovic A.M., Watkins S.M. Lipidomics and lipid profiling in metabolomics. Curr. Opin. Lipidol. 2007; 18(1): 66-71.
6. Schwarz E., Liu A., Randall H., Haslip C., Keune F., Murray M. et al. Use of steroid profiling by UPLC-MS/MS as a second tier test in newborn screening for congenital adrenal hyperplasia: the Utah experience. Pediatr. Res. 2009; 66(2): 230-5.
7. Rauh M. Steroid measurement with LC-MS/MS. Application
98
К ст. Чаховского и соавт.
Рис. 3. Дендрограмма, построенная на основании кластерного анализа и иллюстрирующая кластеризацию образцов по группам.
К ст. Чаховского и соавт.
Рис. 1. Совмещенные хроматограммы образцов 1-3 из контрольной группы (выделено красным цветом) и 15-17 из опытной группы (выделено синим цветом).
1.2Е5
1Е5
80000
60000
ю 40000
см
о
20000
0
-20000
-40000
-60000
-80000 -1.5Е5
Projection of the cases on the factor-plane ( 1 x 2) Cases with sum of cosine square >= 0.00
тз
18/3 9/з 21/1 ■ О
1 заем ' Ш о 28/1 ' 22/10 41 /1 п
1, jgm о
-1E5 -50000
0 50000 1E5
Factor 1: 65.71%
1.5E5
2E5 2.5E5
О Active
Рис. 2. График, полученный путем обработки хроматограмм с помощью МГК. Контрольная группа выделена синим цветом, опытная - красным.
