CC BY
80
Литература.
1 Патент 2181664 РФ, С2, МПК В28С5/04. Вибрационный смеситель / А.Б. Шуитанников В.Н. Иванец, I.E. Яванец и др. — Опубл. 27.04.2002, бюл. № 12.
2. Патент 2193916 РФ, С2, МПК B01F11/00. Вибрационный смеситель / В.Н. Иванец, Г.Е. Иванец, М.В. Баканов, Ю.А. Матвеев, А.Б. Шушпанников. — Опубл. 10.12.2002, бюл. № 34.
3. Патент 2209109 РФ, С2, МПКB01F11/00. Вибрационный смеситель / В.Н. Иванец, М.В. Баканов, Ю.А. Матвеев, А.Б. Шушпанников и др. — Опубл. 27.07.2003, бюл № 21.
4. Патент 2286203 РФ, С1, МПК B01F11/00, B01F3/18. Вибрационный смеситель /А.Б. Шушпанников, Г.Е. Иванец, А.Г. Золин и др. — Опубл. 27.10.2006, бюл. № 30.
VERTICAL-VIBRATING MIXERS - NEW TYPE OF RECEIVING POWDERED COMBINED PRODUCTS A.B. Shushpannikov
Summary. The article is devoted to the constructions of lifting gutter vertical-vibrating constantly working mixers for powdered materials.
Keywords and phrases: mixer, vibration, powder material.
УДК 664.91:637.522.05
ВЕТЕРИНАРНО-САНИТАРНЫЙ КОНТРОЛЬ МЯСНОГО СЫРЬЯ И КОНСЕРВОВ С ПРИМЕНЕНИЕМ УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫХ МЕТОДОВ
Е.А. ГОРОБЧУК, аспирант Московский государственный университет прикладной биотехнологии»
E-mail: [email protected]
Резюме. Проведены исследования по определению критериев безопасности и качества мясных консервов. Показано, что на стадии приемки сырья эффективен метод идентификации мяса на основе иммунодиффузии. Для определения возбудителей инфекций эффективны анализы на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией, а также с использованием иммунохроматографических тест-систем, которые позволяют сократить время анализа, по сравнению с классическими бактериологическими методами, в 2-3 раза.
Ключевые слова: мясные консервы, идентификация, видовой состав, безопасность, качество, иммунодиффузия, ДНК-диагностика, иммунохроматографические тест-системы.
На сегодняшний день важное значение приобретает своевременная ветеринарно-санитарная экспертиза сырья и продуктов животного происхождения. Способы определения показателей их безопасности и качества основаны на органолептических, физико-химических, биохимических, иммунологических, микробиологических и других методах анализа.
В последние годы дня контроля животноводческой продукции стали использовать ускоренные иммунологические и молекулярно-генетические методы [1, 2]. К молекулярно-генетическим методам относятся: гибридизация нуклеиновых кислот, рестрикционный анализ, анализ нуклеотидных последовательностей, полимеразная цепная реакция (ПЦР) [3]. Их приме-
няют для определения микробных контаминаций и видовой принадлежности мясного и растительного сырья. С помощью иммунологических методов можно определять различные токсины [5, 6].
При этом микробиологические методы исследования объектов ветеринарного надзора требуют усовершенствования с целью ускорения анализов и повышения уровня достоверности получаемых результатов, поскольку в практических условиях ветеринарные лаборатории выполняют значительный объем работ, связанных с бактериологическим контролем санитарного состояния производства. Поэтому постоянно ведется поиск новых и улучшение существующих методов. Целью нашей работы было совершенствование контроля показателей безопасности и качества мясного сырья и готовых консервов на основе ускоренных, чувствительных и специфичных методов.
Условия, материалы и методы. Объектами исследования служили образцы мясного сырья (свинина и говядина охлажденная, замороженная в блоках и полутушах) и готовые консервы.
Для определения видовой принадлежности мяса использовали тест-системы серии ORBIT, PRIME, SOFT, PROFIT. Принцип реакции (метод иммунодиффузии по Оухтерлони) основан на диффузии диагностических антител и испытуемого антигена из пропитанных дисков в гель. В случае их взаимодействия, образуется полоса преципитации между противоположными дисками.
Компонентами анализа служили испытуемый материал (сырое мясо), диски, пропитанные антителами к белкам говядины, свинины, баранины, и диски сравнения, пропитанные антигеном. От образца изучаемой продукции отбирали пробу по возможности без жира и соединительной ткани, соблюдая меры предосторожности, для предотвращения загрязне-
ния мясным соком предыдущих проб. Постановка реакции иммунодиффузии занимала по времени 10-20 минут и заключалась в следующем. На чашку с гелем в подписанные зоны пинцетами размещали диски, пропитанные специфичными антителами, соответствующими антигенами и мясным соком исследуемых образцов. Далее чашку инкубировали в термостате с постоянной комнатной температурой в течение суток. Учет и оценку результатов проводили визуально по линии преципитации между дисками с исследуемыми образцами и дисками с соответствующими специфическими сыворотками.
Определение Salmonella typhimurium и ботулини-ческого токсина в мясном сырье и готовых консервах проводили с использованием индикаторных им-мунохроматографических элементов (ИИХЭ).
Жидкую пробу наносили на подложку, где она перемещалась вдоль сборки мембран, реагируя с антителами, конъюгированными с коллоидным золотом (см. рисунок). Полученный иммунный комплекс.
имеющий вишневую окраску, поступал на нитроцел-люлозную мембрану, которая содержит «аналитическую» и «контрольную» зоны. Аналитическая зона захватывала бактерии с определенными антигенами, позволяя окрашенным частицам концентрироваться и образовывать видимую линию (полоску). Две окрашенные полосы на нитроцеллюлозной мембране позволяют сделать вывод о наличии в искомой пробе инфекционного агента. Окраска лишь контрольной зоны свидетельствует о его отсутствии и сохранности индикаторного реагента. Отсутствие окраски в обеих зонах указывает на непригодность ИИХЭ.
Помимо визуальной оценки результатов иммуно-хроматографического теста использовали видеоциф-ровой анализатор «Рефлеком», который дает возможность определять интенсивность окрашивания линий иммунохроматограммы. Это позволяет объективизировать результаты теста.
Результаты и обсуждение. Критерии видовой принадлежности мяса не относятся к показателям его безопасности в соответствии с существующим Сан-ПиН. Однако фальсификация одного вида мяса другим недопустима. Кроме того, она может влиять на этическую и религиозную специфику потребления продукции, в частности, мясных консервов. Таким образом, идентификация мяса при производстве консервов — весьма важный фактор на первой стадии. Существует много способов выполнения этой процедуры, основанных на морфологических критериях. Однако при поступлении блочного мяса идентификация с их использованием затруднена. Поэтому в лабораторной практике применяются гистологические, иммунологические методы и методы на основе ДНК-диагностики.
Для изучения возможности использования метода иммунодиффузии при определении видовой принадлежности мяса мы провели испытания на примере свинины и говядины. Для этого были проведены анализы в соответствии с ранее приведенной методикой. В качестве отрицательного контроля использовали мясо животных других видов. Мы модифицировали методику классической реакции преципитации в геле, при которой антиген и антисыворотка наносятся в лунки в агаре. Усовершенствование заключается в использовании дисков, на которые предварительно были нанесены моноклональные антитела и антигены. Это позволило сократить время постановки реакции на 3,5...4 ч (до 10...20 мин.).
Исследования показали, что метод иммунодиффузии позволяет четко идентифицировать блочное мясо, полученное от различных видов животных. В связи с этим его можно рекомендовать для практического применения.
На сегодняшний день в лабораторной практике для определения некоторых веществ в биологических материалах применяется иммунохроматографи-ческий метод. Основное его достоинство — специфичность и быстрота получения результатов [4]. Мы изучили возможность применения этого метода для индикации сальмонелл и выявления ботулиническо-го токсина непосредственно в готовых консервах.
Один из важных этапов проведения анализа мясного и растительного сырья на наличие Б.ЦрЫтипит — подготовка проб к проведению исследований.
В ходе экспериментов мы разработали и испытали новую методику проведения этой процедуры, которая заключается в следующем. Общую пробу
Рисунок. Схематическое изображение принципа действия индикаторного иммунохроматог-рафического элемента. Вверху: 1 — проба, содержащая биопатоген, наносимая на подложку для впитывания образца; 2 — подложка, с конъюгатом наночастиц золота и антител; 3 — антитела формирующие аналитическую зону; 4 — антитела формирующие контрольную зону; 5 — впитывающая подложка. Стрелками указано направление тока жидкости по мембране. Внизу: образование окрашенных комплексов в аналитической и контрольной зонах индикаторного элемента.
мясного сырья (25...50 г) необходимо гомогенизировать, элюировать буферным раствором и очистить от крупных частиц низкоскоростным центрифугированием (500... 1000 об/мин, 2...3 мин). Затем супернатант подвергается высокоскоростному центрифугированию (10000... 12000 об/мин в течение 5 мин) или фильтрации через мембранные фильтры Millipore 0,4 мм3. Осадок ресуспендируют в 1 см3 специального буфера. Полученную суспензию используют для проведения анализа.
Чувствительность индикации микроорганизмов можно повысить путем предварительного обогащения бактериальных культур. Поэтому подращивание осуществляли в колбах и пробирках с жидкой питательной средой в течение 6-8 ч при температуре 37 °С с периодическим перемешиванием на аппарате для встряхивания жидкости.
Модельные эксперименты с музейными культурами показали, что иммунохромато графические тест-системы обладают достаточной специфичностью и позволяют определять S. typhimurium, дифференцируя их от других микроорганизмов (E. coli, S. dublin, L. monocytogenes, Staph, aureus и др.).
Для выявления ботулинического токсина в готовых консервах пробоподготовку проводили в следующей последовательности: измельчение в гомогенизаторе, элюирование буфером, очистка центрифугированием при низких скоростях (500... 1000 об/мин) с целью сохранения максимального количества токсина в исследуемом образце, нанесение супернатанта на подложку индикаторного элемента. В результате проведенных исследований было установлено, что чувствительность индикаторных элементов для выявления ботулинического токсина типа А составляет 3,0 нг/мл. Полученные результаты подтверждены постановкой биопробы на лабораторных животных.
Для определения достоверности выявления S. typhimurium часть проб говядины искусственно обсеменяли суточной агаровой культурой сальмонелл.
Другая часть мясного сырья служила контролем. Подготовленные материалы при начальной концентрации тест-культур 1,25-105 в 1 г, исследовали без обогащения, а при 3,12104и 6,25-104 — обогащали.
В ходе исследований установлено, что в опытных образцах положительный результат зарегистрирован в 100 % случаев. Данные иммунохроматогра-фического анализа были подтверждены бактериологическими методами.
В опытах по выявлению ботулинического токсина в качестве положительного контроля использовали анатоксин, в отрицательном контроле — буферный раствор. Растворенный в буфере исследуемый материал (осадок мясной вытяжки) наносили на подложку ИИХЭ. Иммунная реакция «антиген-антитело» происходила там, где в качестве антигена использовался анатоксин, а у образцов с буферным раствором подобной реакции не отмечено.
Следовательно, иммунохроматографический метод позволяет достоверно контролировать наличие сальмонелл в мясном сырье, а ботулинического токсина — в готовых консервах. При этом затраты времени на проведение анализа без обогащения тест-культур с учетом подготовки проб не превышают 2 ч, а с обогащением — 10 ч. То есть применение иммунохроматографического метода без предварительного обогащения материалов позволяет сократить время анализа, по сравнению с классическим микробиологическим методом, в 20 раз, а с обогащением — более чем в 4 раза.
Необходимо также отметить компактность аналитической системы, высокую специфичность и возможность применения этого метода в полевых условиях.
Выводы. Таким образом, на основании выполненных исследований усовершенствованны методы контроля качества и безопасности мясного сырья и вырабатываемых из него консервов на основе методов иммунодиффузии и иммунохроматографии.
Литература.
1. Иванкин А.Н., Кузнецова Т.Г. Современные методы оценки качества и безопасности мясного сырья и мясопродуктов// Все о мясе. — 2005.-№4.-С. 26-30.
2 СамуйленкоАЯ., Кузнецов ДП, Кузнецова С.В. Иммуноферментный анализ в ветеринарной медицине // Ветеринария. - 2003,-№ 12,- С.20-24.
3. ШибатаД.К. Полимеразная цепная реакция и молекулярно-генетический анализ биотопов. — М.: Мир, 1999. — С. 395-425.
4. Индикация возбудителей особо опасных заболеваний с помощью иммунохроматографии и видеоцифрового анализа / С.П. Яркое, С.И. Третьяков, Л.А. Башарова, В.Н. Злобин //Вестник Российской АМН. — №12. — 2007. — С. 22-26
5. Solid phase DNA amplification: characterisation of primer attachment and amplification mechanisms / C. Adessi, G. Matton, G. Turcatti, J. Mermod, P. Mayer, E. Kawashima //Nucleic Acids Research. — 2000. — p. 87.
6. Muller A., Steinhart H. Recent developments in instrumental analysis for food quality //Food chem. — 2007. 101. —М3, — C. 1132-1144.
VETERINARY SANITARY CONTROL OF RAW MATERIAL AND CANNED MEAT USING IMPROVED
METHODS
E.A. Gorobchuk
Summary. The researches have been carried out to determine the criteria of safety and quality at different production phases of canned meat. Microbiological criteria and specific structure of raw material have been observed. It is shown that at the stage of acceptance of raw materials the method of identification of meat on the basis of immunodiffusion is effective and specific, while identifying pathogens the technique on the basis of immunohromatografia is effective which has been allowed the time reduction of the analysis in comparison with classical bacteriological methods in 2-3 times. Keywords: meat canned foods, identification, species composition, safety, quality, immunodiffusion, DNA-diagnostics, immunochromatographic test-systems.
