CC BY
123
ИММУНОПАТОЛОГИЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ ИММУНОЛОГИЯ
8. Grage-Griebenow E., FladH.D., ErnstM., Bzowska M., Skrzec-zynska J., Pryjma J. Human MO subsets as defined by expression of cD64 and cD16 differ in phagocytic activity and generation of oxygen intermediates. Immunobiology. 2000; 202 (1): 42-50.
9. Sanchez-Torres C., Garcia-Romo G.S., Cornejo-Cortes M.A., Ri-vas-Carvalho A., Sanchez-Schmitz G. CD16+ and CD16-human blood monocyte subsets differentiate in vitro to dendritic cells
with different abilities to stimulate CD4+ T cells. Int. Immunol. 2001; 13: 1571-81.
10. Pak Cheung Ng, Geng Li, Kit Man Chui, Winnie Chiu Wing Chu, Karen Li, Raymond Pui On Wong, Tai Fai Fok. Quantitative measurement of monocyte HLA-DR expression in the identification of early-onset neonatal infection. Biol. Neonate. 2006; 89 (2): 75-81.
Поступила 21.07.13
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 616.438-053.32-073.432-078.33
Л.Л. Панкратьева1, В.Е. Мухин2, Н.В. Чернова3, И.Г. Солдатова2, С.А. Румянцев12,
Н.Н. Володин1, А.г. Румянцев1
вариабельность размера вилочковой железы у недоношенных детей разного гестационного возраста с осложненным течением неонатального периода: ультразвуковые и клиникоиммунологические параллели
Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева Минздрава России , 117997, г Москва, ул. Саморы Машела, д. 1; 2ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздрава России, 117997, г Москва, ул. Островитянова, д. 1; 3Городская больница № 8 Департамента здравоохранения г. Москвы, 127287, г Москва, 4-й Вятский пер., д. 39
Тимус, являясь центральным органом иммунной системы, в котором осуществляются процессы дифференциров-ки и клональной селекции Т-лимфоцитов, играет важную роль в формировании иммунной системы у детей первых месяцев жизни. Цель. На основании ультразвукового исследования изучить объемную характеристику вилочковой железы у недоношенных детей и установить наличие взаимосвязи полученных данных с количественными и фенотипическими характеристиками Т-лимфоцитов периферической крови и развитием отдельных патологических состояний на 1-м месяце жизни. Материалы и методы. 76 недоношенных новорожденных 25-34 нед гестации в отделении реанимации и интенсивной терапии. Объемная характеристика тимуса оценивалась при помощи ультразвукового метода исследования в возрасте 36 нед постконцептуального возраста и представлена тимическим индексом (ТИ). Забор крови для иммунофенотипирования Т-лимфоцитов проводили в динамике, начиная с пуповинной крови, и далее на 7-8, 14-16-е, 21-23-и сутки и в возрасте 1 мес жизни. Результаты. Объемная характеристика тимуса в возрасте 36 нед скоррегированного постконцептуального возраста может быть крайне вариабельна и не зависит от гестационного возраста и антропометрических данных при рождении. Низкие значения ТИ ассоциированы с большей частотой развития бронхолегочной дисплазии тяжелой степени тяжести и прогрессирующих стадий некротизирующего энтероколита, осложнившихся перфорацией кишечника (р < 0,05). Статистически значимых различий в частоте развития феномена стойкой абсолютной лимфопении на 1-м месяце жизни между группами детей с низкими и высокими значениями ТИ не выявили. Низкие значения ТИ коррелируют с критически низкими показателями как относительного, так и абсолютного количества Т-регуляторных CD4+CD25+Foxp3+-лимфоцитов периферической крови новорожденных (Rs = 0,56; p = 0,001 и Rs = 0,49; p = 0,005 соответственно). Заключение. Дальнейшее изучение процесса формирования адаптивного иммунитета на первых месяцах жизни послужит базой для совершенствования диагностических и превентивных терапевтических стратегий.
Ключевые слова: тимический индекс; недоношенность; экстремально низкая масса тела (ЭНМТ); некротизирующий энтероколит; бронхолегочная дисплазия; CD4+CD25highFoxp3+ Т-регуляторные клетки.
L.L. Pankratyeva1, V.E. Mukhin2, N.V Chernova3, I.G. Soldatova2, S.A. Roumiantsev1,2, N.N. Volodin1, A.G. Roumiantsev1
VARIABILITY IN THYMIC SIZE IN CRITICALLY ILL NEONATES: ULTRASOUND IMAGING, CLINICAL AND IMMUNOLOGICAL PARALLELS
Tederal Research and Clinical Centre of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology, 1171981, Moscow, Russian Federation; 2Pirogov’s National Research Medical University, 117997, Moscow, Russian Federation; 3City hospital №8, 127287, Moscow, Russian Federation
The thymus is of extreme importance during the first months of life as it provides the environment for the T-lymphocyte differentiation and maturation. Aim. To assess the variation in size of the thymus in preterm neonates and to identify relations between thymic size, phenotypic characteristics of peripheral blood T-lymphocytes and severity of complications during the first month of life. Patients and methods. We observed 76 preterm neonates (25-34 weeks' gestation) admitted to neonatal intensive care unit. The thymic size was assessed by sonography as a volume estimate, thymic index (Ti), at 36 weeks of postconceptional age. T cells were analyzed on day 1 (cord blood), 7-8, 14-16, 30 by multicolor flow cytometry. Results. A correlation between thymic size and anthropometric measurements and gestational age was not demonstrated. Infants with low Ti values had a significantly higher incidence of progression to severe necrotizing enterocolitis with intestinal perforation and severe bronchopulmonary dysplasia than infants with median and high Ti values (p<0.05). Analyzing abnormal laboratory
- 37 -
ИММУНОЛОГИЯ № 1, 2014
data, an association between Ti values and incidence of lymphopenia during the first month of life was not revealed. Ti was positively correlated with CD4+CD25highFoxp3+ T-regulatory cell percentage and absolute counts on days 7-8 of postnatal life (Rs=0.56, p=0.001 and Rs=0.49, p=0.005 respectively). Conclusion. Further elucidation of adaptive immune system in preterm neonates will help to establish new strategies for the treatment and prevention of severe diseases of prematurity.
Key words: thymic index; prematurity; extremely-low-birth-weight (ELBW) neonates; necrotizing enterocolitis; bronchopulmonary dysplasia; CD4+CD25kghFoxp3+ T-regulatory cells.
Введение. Успехи, достигнутые в перинатологии в последние годы, привели к значительному снижению уровня неонатальной смертности. В то же время возник ряд серьезных проблем, связанных с отдаленными последствиями перинатальной патологии.
В последние годы во всем мире исследователи и практические врачи уделяют пристальное внимание комплексу проблем, связанных с изучением онтогенеза иммунной системы в норме и функционированием ее при патологических состояниях. Иммунным механизмам принадлежит ключевая роль в патогенезе основных заболеваний перинатального периода, что во многом определяет как их исход, так и эффективность этапа реабилитации. Наряду с известными на сегодня нарушениями в системе врожденного иммунитета у недоношенных детей, проблема формирования адаптивных реакций иммунной системы имеет не меньшее значение [1, 2].
На процесс формирования фенотипа адаптивных реакций иммунной системы влияют многочисленные факторы, причем генетические факторы имеют важное, но не решающее значение. Ключевую роль в этом процессе отводят морфофункциональному состоянию тимуса [3].
Тимус (вилочковая железа) является центральным органом иммунной системы, в котором осуществляются процессы диф-ференцировки и клональной селекции Т-лимфоцитов [4]. Роль тимуса в формировании иммунной системы в постнатальном периоде до конца не ясна. В литературе практически отсутствуют данные о влиянии преждевременных родов на сложный и многоэтапный процесс созревания Т-лимфоцитов в тимусе и формирование иммунной системы в целом. Известно, что лимфоциты пуповинной крови здоровых новорожденных характеризуются наивным фенотипом (cD45RA+) ввиду отсутствия антигенной стимуляции в антенатальном периоде [5]. В то же время выраженная антигенная стимуляция во внутриутробном периоде в условиях относительной незрелости регуляторных механизмов иммунной системы может способствовать развитию тяжелых форм перинатальной патологии [6].
В настоящее время считается, что процесс инволюции тимуса начинается с конца 1-го года жизни ребенка, и наряду с изменениями структуры, утрачивается и его способность к генерации новых клонов Т-лимфоцитов [7]. Однако в ряде исследований показано, что объем вилочковой железы в раннем детском возрасте напрямую зависит от влияния многих внешних факторов. Так, у детей, получавших грудное молоко в качестве основного источника питания в течение первых 6 мес жизни, объем тимуса по данным ультразвукового исследования (УЗИ) значимо превышал таковой у детей, находившихся на искусственном вскармливании [8]. В другом исследовании выявлена взаимосвязь между развитием фунизита (гистологический маркер реакции системного воспалительного ответа плода) и инволюцией тимуса у плода [9]. При проведении аутопсии у 100 новорожденных продемонстрировано, что факт реализации инфекции в неонатальном периоде, а также увеличение длительности заболевания способствуют инициа-
Панкратьева Людмила Леонидовна (Pankratyeva Liudmila Leonidovna), e-mail: [email protected]; Мухин Владимир Евгеньевич (Mukhin vladimir Evgen’evich); Чернова наталья владимировна (Chernova Natal’ya Vladimirovna); солдатова Ирина Геннадьевна (Soldatova Irina Gennad’evna); румянцев сергей Александрович (Roumiantsev Sergey Alexandrovich); володин николай николаевич (volodin Nikolay Nikolaevich); румянцев александр Григорьевич (Roumiantsev Alexandr Grigor’evich)
ции процесса острой инволюции тимуса у доношенных детей [10]. В результате анализа факторов риска у новорожденных с бронхолегочной дисплазией показано, что размер тимуса (по данным стандартного рентгенографического исследования) может зависеть от состояния ферментной системы коры надпочечников у недоношенных детей и иметь прогностическое значение [11].
С учетом вышеуказанного следует, что размер тимуса в неонатальном периоде и раннем детском возрасте вариабелен и зависит от целого ряда факторов как инфекционной, так и неинфекционной природы. Остается неясным, существует ли взаимосвязь между объемом вилочковой железы и пулом периферических Т-лимфоцитов, а также развитием и тяжестью течения отдельных патологических состояний у недоношенных детей разного гестационного возраста, в том числе с экстремально низкой массой тела (ЭНМТ) при рождении.
Для решения вышеуказанных вопросов предпринято настоящее исследование.
Цель исследования. На основании УЗИ изучить объемную характеристику вилочковой железы у недоношенных детей с осложненным течением неонатального периода, установить наличие взаимосвязи полученных данных с количественными и фенотипическими характеристиками Т-лимфоцитов периферической крови и развитием отдельных патологических состояний, тяжестью их течения на 1-м месяце жизни.
Материалы и методы. Работу проводили на кафедре нео-натологии (зав. - д-р мед. наук, проф. М.В. Дегтярева) ФУВ совместно с отделом клеточных технологий и регенеративной медицины (руководитель - д-р мед. наук, проф. С.Н. Быковская) ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздрава России в рамках приоритетного направления развития № 3 «Профилактика, диагностика и лечение врожденных и перинатальных заболеваний у детей» c ноября 2010 г по февраль 2012 г. Обследование новорожденных детей проводили на базе родильного отделения (зав. - Н.А. Березина), отделений реанимации и интенсивной терапии новорожденных детей № 1 (зав. - О.И. Милева) и № 2 (зав. - канд. мед. наук
О.А. Бабак), отделений патологии новорожденных № 1 (зав. - канд. мед. наук О.В. Потапова) и № 2 (зав. - О.В. Миронюк) городской больницы № 8 Департамента здравоохранения г. Москвы (главврач - канд. мед. наук. А.Б. Дуленков).
Под наблюдением находились 76 недоношенных новорожденных 25-34 нед гестации с осложненным течением неонатального периода, потребовавших проведения интенсивной терапии по совокупности клинико-анамнестических, лабораторных и инструментальных данных. Критериями исключения новорожденных детей из исследования стали врожденные пороки развития, несовместимые с жизнью, и синдромальные формы патологии.
Масса тела (МТ) недоношенных детей при рождении составила от 690 до 2070 г. Данные о МТ, гестационном возрасте (ГВ), оценке по шкале Апгар на 1-й и 5-й минутах жизни представлены в табл. 1.
Состояние всех недоношенных детей при рождении расценивалось как тяжелое за счет клинических проявлений дыхательной недостаточности II-III степени, нарушения кровообращения, неврологической симптоматики. Всем детям с первых минут жизни осуществляли непрерывный мониторинг жизненно важных функций организма и проводили интенсивную терапию. По клинико-лабораторным и инструментальным признакам пневмонию диагностировали у 72 (95%) новорожденных детей, некротизирующий энте-
- 38 -
ИММУНОПАТОЛОГИЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ ИММУНОЛОГИЯ
Таблица
Характеристика недоношенных детей с осложненным течением неонатального периода
ГВ (в нед) МТ (в г) Me (21 Q3) (min-max) Рост (в см) Me (21; 23) (min-max) Оценка по шкале Апгар на 1-й минуте жизни Me (21; 23) (min-max) Оценка по шкале Апгар на 5-й минуте жизни Me (21; 23) (min-max)
25-28 (n = 23) 1120 (780;1190) (700-1300) 33 (32; 38) (31-38) 6 (5; 6) (3-7) 7 (6; 7) (5-7)
29-31 (n = 28) 1410 (1130; 1640) (690-1830) 37 (36; 40) (30-42) 6 (5; 6) (4-7) 7 (7; 7) (6-8)
32-34 (n=25) 1610 (1380;1770) (1180-2070) 40 (38; 42) (36-43) 6 (6; 6) (5-7) 7 (7; 7) (7-8)
роколит (НЭК) - у 25 (33%), гнойный менингит - у 4 (5%), инфекцию мочевыводящих путей - у 12 (16%), омфалит и флебит пупочной вены - у 1 (1%). Кандидоз кожи и слизистых оболочек выявили у 8 (11%) детей. У 14 (18%) детей нельзя было исключить наличие внутриутробной генерализованной инфекции. С момента рождения 35 (46%) детей нуждались в искусственной вентиляции легких (ИВЛ). Респираторную поддержку при помощи назального СРАР получал 41 (54%) ребенок. Недостаточность кровообращения отметили у 30 (39%) детей. Геморрагический синдром (легочное, желудочное кровотечение, кожно-геморрагический синдром) развился у 36 (47%) новорожденных. По данным нейросонографического исследования у 22 (29%) детей обнаружили внутрижелудочковые кровоизлияния I-III степени. Судорожный синдром отметили у 14 (18%) детей. Ишемическую нефропатию I-III степени выявили у 20 (26%) детей. Септический шок развили 3 (4%) детей. Все дети получали инфузионную, антибактериальную, противогрибковую и по-синдромную терапию.
В качестве источника биоматериала использовали периферическую кровь в объеме 400-500 мкл. Забор крови производили с помощью вакуумных систем BD Vacutainer, содержащих антикоагулянт K2EDTA.
Мононуклеарные клетки (МНК) выделяли методом градиентного центрифугирования. Для этого периферическую цельную кровь разводили с фосфатно-солевым буфером (ФСБ) в соотношении 1:1, после чего наслаивали на среду с плотностью 1,077 г/мл для выделения мононуклеарной клеточной фракции (Ficoll histopaque Sigma, США) и центрифугировали в течение 30 мин (400g). После выделения в градиенте плотности собирали интерфазное кольцо и дважды отмывали в ФСБ.
Для определения фенотипа лимфоцитов в работе использовали метод проточной цитометрии. Экспрессию маркеров оценивали в соответствии с протоколом, разработанным производителем набора антител (АТ) (Miltenyi Biotec, GmbH, Германия). В состав набора входили следующие АТ: анти-CD45, меченные VioBlue (клон 5B1), анти-CD3, меченные FITC (клон BW264/56), анти-CD45RO, меченные PerCP (UCHL1), анти-CD8, меченные PE (клон BW135/80), анти-CD4, меченные FITC (клон M-T466), анти-CD4, меченные APC (клон M-T466), анти-CD25, меченные APC (клон 4E3), анти-Foxp3, меченные PE (клон 3G3), и соответствующий им изотипический контроль (IgG1 или IgG2 с соответствующим флюоресцентным конъюгантом).
Оценку экспрессии поверхностных антигенов проводили в соответствии с рекомендациями производителя тестовых наборов. Суспензию клеток отмывали от культуральной среды в ФСБ, содержащем 0,01M EDTA и 0,1% BSA (центрифугирование 300g, 10 мин).
Затем клеточную суспензию переносили в цитометрические пробирки, добавляли соответствующие моноклональные АТ, меченные флюоресцентными красителями, и инкубировали 15 мин в темноте при
1 комнатной температуре. После чего клетки отмывали в ФСБ и сразу же анализировали на проточном цитофлюориметре.
Для внутриклеточного окрашивания лимфоцитов использовали набор Treg detection Kit (Miltenyi Biotec, Германия). В соответствии с протоколом, клетки инкубировали в пермеа-билизирующем растворе в течение 30 мин при температуре 4°С. Затем клетки дважды отмывали в пермеабилизирующем буфере. Для минимизации неспецифического связывания АТ к внутриклеточным антигенам, к суспензии клеток добавляли реагент, блокирующий рецепторы к Fc-фрагментам АТ. Клетки окрашивали моноклональными АТ с соответствующими флюоресцентными красителями (30 мин при температуре 4°С). По истечении времени инкубации суспензию клеток отмывали в ФСБ и анализировали на проточном цитофлюориметре.
Измерения проводили на проточном цитофлюориметре MACSQuant (Miltenyi Biotec GmbH, Германия). Процентное содержание позитивных по специфическим маркерам клеток подсчитывали при помощи программного обеспечения MACsQuantify (Miltenyi Biotec GmbH, Германия) (рис. 1, 2).
Забор крови для иммунофенотипирования Т-лимфоцитов у недоношенных детей проводили в динамике, начиная с пуповинной крови, и далее на 7-8, 14-16, 21-23 сутки и в возрасте 1 мес жизни.
Объемная характеристика тимуса оценивалась при помощи ультразвукового метода исследования и представлена тимическим индексом (ТИ), который является произведением наибольшего поперечного размера (ширина тимуса, см) и максимального размера сечения в сагиттальной плоскости (в см2). Исследование проводили одним и тем же специалистом на аппарате Logiq 500 (GE Healthcare, США) с использованием линейных датчиков 5-10 МГц. Возраст детей при обследовании составил 36 нед скоррегированного постконцептуального возраста.
Статистическую обработку данных выполняли с использованием пакета прикладных программ «Statistica 9.1»
Рис. 1. Гейтинг CD4+CD25h‘вhFoxp3+-субпопуляции лимфоцитов.
- 39 -
ИММУНОЛОГИЯ № 1, 2014
Рис. 2. Гейтинг CD8+ (слева) и CD4+ (справа) субпопуляций лимфоцитов.
(StatSoft Inc., США). Количественные признаки описывали медианами и квартилями (Ме (LQ; UQ)). Качественные признаки описывали абсолютными и относительными частотами их значений. Для количественных признаков сравнение в несвязанных группах проводили с использованием непараметрического теста Kruskal Wallis ANOVA (K-w ANOvA) и непараметрического теста Манна-Уитни (U-test), сравнение в связанных группах - с помощью парного теста Вилкоксо-на (Wilcoxon matched pair test). Для сравнения частот значений признаков в группах применяли двухсторонний точный критерий Фишера (ТКФ). С целью изучения статистической связи между явлениями применяли непараметрический коэффициент корреляции Спирмена. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.
Результаты. УЗИ вилочковой железы провели у 76 недоношенных детей с осложненным течением неонатального периода в возрасте 36 нед скоррегированного постконцептуального возраста.
Пр сопоставлении значений ТИ с антропометрическими данными и сроком гестации на момент родоразрешения не выявили значимых корреляционных зависимостей (ТИ - ГВ: Rs = -0,07; p = 0,633; ТИ - МТ: Rs = -0,22; p = 0,151; ТИ -рост: Rs = -0,13; р = 0,369).
При ретроспективном анализе данных УЗИ тимуса от-
метили сильную вариацию ТИ (коэффициент вариации составил 51%), что позволило вычислить интерквартильный интервал значений ТИ (интервал средних значений) и определить интервалы минимальных и максимальных значений данного показателя. С учетом полученных результатов выделили три группы детей: 1-я (n = 38) - со значениями ТИ в интервале Q1-Q3 (Me 9,8 (7,4%; 12,8%)); 2-я (n = 19) - со значениями ТИ в диапазоне Q3-Max (12,9-25,2%); 3-я (n = 19) - со значениями ТИ в диапазоне Min-Q1 (1,3-7,3%).
Результаты проведенного сравнения по половому составу, ГВ, МТ и тяжести состояния при рождении показали, что по этим критериям группы были сопоставимы (табл. 2).
При анализе инфекционных антенатальных факторов риска выявили, что у матерей детей 2-й и 3-й групп по сравнению с 1-й группой статистически значимо чаще отмечали хронические очаги инфекции (26,1 и 52,4%, р = 0,048; RR 2 95% CI (1,011; 3,95); 26,1 и 54,1%, р13 = 0,397; RR 2,2 95% CI (1,142; 4,239)).
Гистологически верифицированный хориамнионит также значимо чаще встречался во 2-й и 3-й группах, чем в 1-й (9,2 и 36,4%, р = 0,03; RR 3,5 95% CI (1,167; 10,495); 9,2 и 40%, р1-3 = 0,013; RR 4 95% CI (1,377; 11,62)).
При анализе взаимосвязи между антенатальной стероидной профилактикой респираторного дистресс-синдрома и значениями ТИ статистически значимых различий не обнаружили.
При изучении инфекционных факторов риска в неонатальном периоде мы не установили значимых различий в частоте развития неонатального сепсиса в изучаемых группах (в 1-й группе - 12%, во 2-й - 16%, в 3-й - 15%; р > 0,05, ТКФ).
Количество инфекционно-воспалительных очагов у недоношенных детей на протяжении 1-го месяца жизни также значимо не различалось в исследуемых группах (табл. 3).
Учитывая отсутствие значимых различий в общем количестве очагов инфекции в группах недоношенных детей, мы проанализировали частоту развития отдельных патологических состояний неонатального периода, для которых характерно развитие осложнений, в том числе тех, что приводят к инвалидизации.
При анализе частоты развития клинической симптоматики НЭК у недоношенных новорожденных в исследуемых группах на 1-м месяце жизни выявили, что по совокупности клинико-инструментальных данных НЭК развивался статистически значимо чаще как у детей с низкими (3-я группа), так и с высокими (2-я группа) значениями ТИ, чем у детей 1-й группы. При оценке стадии течения НЭК показано, что клиническая симптоматика НЭК у детей 1-й группы соответствовала I стадии и проявлялась в виде незначительного вздутия живота, умеренного расширения кишечных петель и единичными горизонтальными уровнями жидкости по данным рентгенологического исследования. При оценке стадии течения НЭК у детей с низкими и высокими значениями ТИ
Таблица 2
Распределение детей по группам в зависимости от ГВ, пола, МТ при рождении и оценки по шкале Апгар
Характеристики групп Группа детей p, ANOVA
1-я (п = 38) 2-я (п = 19) 3-я (п = 19)
ГВ, нед 31 (29; 32) 31 (28; 32) 29 (28; 31) 0,172
Половой состав: Абс. % Абс. % Абс. % p, ТКФ
мальчики 20 51,2 10 55,4 11 56,8 > 0,05
девочки 18 48,8 9 44,6 8 43,2
МТ, г Оценка по шкале Апгар: 1 мин 5 мин 1400 (1120; 1640)(690-2070) 6 (5; 6) 7 (7; 7) 1380 (1180; 1610)(700-1800) 6 (5; 6) 7 (7; 7) 1240 (1130; 1640)(750-1830) 6 (5,6) 7 (6,7) 0,409 0,924 0,121
- 40 -
ИММУНОПАТОЛОГИЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ ИММУНОЛОГИЯ
Таблица 3
Сравнение количества инфекционно-воспалительных очагов у детей трех групп на 1-м месяце жизни
Таблица 5
Характеристика детей, потребовавших проведения ИвЛ
Количество
очагов
инфекции (Me (Q1; Q3), min-max)
Группа детей
1-я 2-я 3-я
1 (1; 2) (1-3) 1 (1; 2) (1-3) 1 (1; 2) (1-4)
p, anova
> 0,05
Частота развития нЭК у детей трех групп Таблица 4
Группа детей НЭК, % р, ТКФ
Частота развития
1-я 15,7 (6/38) Р,-3 < 0,05 Р, 2 < 0,05
2-я 47,3 (9/19)
3-я 52,6% (10/19)
Прогрессирование клиники - II стадия
1-я 0 (0/6) Р2-2 < 0,05 Р, 3 < 0,05
2-я 56 (5/9) Pj > 0,05
3-я 80 (8/10)
Прогрессирование клиники - III стадия
2-я 20 (1/5) Р2-3 < 0,05 RR = 4,375 95%
3-я 87 (7/8) CI 0,74; 25,7)
отметили прогрессирование клиники НЭК до II стадии. В
же время у детей с низкими значениями ТИ статистически значимо чаще диагностировали развитие III стадии НЭК с последующим развитием перфорации кишечника (табл. 4).
В настоящее время известно, что бактериальная инфекция усугубляет тяжесть течения респираторного дистресссиндрома за счет инактивации не только эндогенного, но и экзогенно вводимого сурфактанта под действием бактериальных токсинов и провоспалительных цитокинов. Активный воспалительный процесс в легких приводит к вынужденной необходимости применять более жесткие режимы ИВЛ, что в большинстве случаев приводит к дополнительному повреждению альвеолярного эпителия и запуску мощного провоспалительного каскада с последующим тяжелым поражением легких и формированием бронхолегочной дисплазии (БЛД) [12].
Мы проанализировали частоту развития тяжелой степени БЛД у недоношенных детей, находящихся на ИВЛ, в трех группах. В табл. 5 представлены основные клинические характеристики детей, нуждавшихся в проведении механической вентиляции легких, а также средние параметры ИВЛ на 1-й неделе жизни.
Несмотря на отсутствие значимых различий при сравнении частоты применения заместительной сурфактантной терапии в 1-е сутки жизни, продолжительности респираторной терапии и параметров ИВЛ у детей 2-й и 3-й групп, частота развития тяжелой степени БЛД составила 75% у детей 3-й группы и 11% у детей 2-й. В 1-й группе детей с тяжелой степенью БЛД, потребовавших проведения ИВЛ, не выявили (1/9 (11%) во 2-й группе против 6/8 (75%) в 3-й группе, р = 0,015; RR = 6,75; 95% cI (1,019; 44,713)).
При анализе результатов иммунологического обследования недоношенных детей на 1-м месяце жизни обнаружили ряд закономерностей.
Установили, что доля cD3+cD45RO+ Т-лим-фоцитов была статистически значимо выше в образцах пуповинной крови у детей 2-й и 3-й групп, чем у детей 1-й группы (табл. 6), что
Параметр Группа детей P, anova/ ТКФ
1-я (п = 9) 2-я (п = 9) 3-я (п = 8)
ГВ, в нед 29 (28; 30) 30 (29; 32) 31 (31; 32) > 0,05
Препарат сурфактанта в родильном зале 8/9 (88%) 6/9 (66%) 7/8 (87%) > 0,05
fiO2 0,3 (0,3; 0,4) 0,5 (0,4; 0,7) 0,35 (0,3; 0,5) > 0,05
PIP, см вод. ст. 20 (19; 25) 23 (20; 25) 22 (19; 27) > 0,05
PEEP, см вод. ст. 4 (4; 4) 5 (4; 5) 4 (4; 4) > 0,05
Продолжительность ИВЛ, в сут 7 (4; 12) 18 (13; 27) 19 (13; 29) < 0,05 Р13 < 0,001 Р1-2 = 0,01
может объясняться наличием в указанных группах такого антенатального фактора риска инфекции, как гистологически верифицированный хориоамнионит (см. выше).
При анализе содержания основных субпопуляций Т-лимфоцитов периферической крови в динамике отметили значимо более высокие значения абсолютного количества CD8+ Т-клеток на 7-8-е сутки жизни у детей с низкими значениями ТИ в 36 нед скоррегированного постконцептуального возраста. Абсолютное количество cD4+ Т-лимфоцитов
Рис. 3. Корреляционная зависимость значений ТИ (см3) и количественных характеристик Т-регуляторных клеток у недоношенных новорожденных на 7-8-е сутки жизни. а - % CD4+CD25+Foxp3+, б - абсолютные значения (Т09/л).
- 41 -
ИММУНОЛОГИЯ № 1, 2014
Таблица 6
Доля (в %) CD3+CD45RO+ Т-лимфоцитов в образцах пуповинной крови у детей трех групп
Группа детей p, ANOVA
CD3+CD45RO+, 1-я 2-я 3-я (post-hoc test)
6,4 (3,2; 9,6) 14,5 (7,9; 16,5) 16,3 (8,1; 19) <0,05 (Л-3 ,-2 = 0,°01)
Таблица 7
сравнение абсолютных значений CD8+-, CD4+- и CD4+CD25+- субпопуляций Т-лимфоцитов в трех группах на 7-8-е сутки жизни
Параметр Группа детей p, ANOVA
1-я 2-я 3-я (post-hoc test)
CD8+, -107л 0,74 (0,6; 0,92) 0,61 (0,41;1,13) 1,7 (0,8; 1,9) < 0,05 (p23 = 0,012, p-3 = 0,016)
CD4+, -107л 1,85 (1,2; 2,3) 1,65 (0,9; 2,5) 2,8 (1,52; 3,7) p > 0,05
CD4+CD25+, % 16,3 (12,5; 19,3) 18,9 (15,8; 22,3) 6,7 (6,1; 8,3) < 0,05 (p23 < 0,001; p-3 < (3,001)
оказалось сравнимым в исследуемых группах. При этом доля CD4+CD25+-KreTOK была значимо меньше у новорожденных в 3-й группе, чем в 1-й и 2-й (табл. 7).
При изучении частоты возникновения феномена стойкой абсолютной лимфопении (< 2 • 109/л) у новорожденных на 1-м месяце жизни, статистически значимых различий не выявили.
В нашем исследовании мы предприняли попытку изучить количественные характеристики CD4+CD25highFoxp3+ Т-регуляторных лимфоцитов периферической крови недоношенных детей на 1-м месяце жизни. Установили сильную прямую корреляционную зависимость между значениями ТИ в возрасте 36 нед постконцептуального возраста и относительными и абсолютными значениями Т-регуляторных клеток на 7-8-е сутки жизни (Rs = 0,56; p = 0,001 и Rs = 0,49; p = 0,005 соответственно) (рис. 3).
При анализе соотношений Treg/CD4+ и Treg/CD8+ в исследуемых группах детей, выявили, что у недоношенных новорожденных в 3-й группе указанные отношения оставались статистически значимо более низкими на протяжении всего периода наблюдения (рис. 4, 5).
На рис. 6 видно, что при сравнении соответствий абсолютных значений Т-регуляторных клеток абсолютным значениям CD4+- и CD8+-субпопуляций Т-лимфоцитов в единице объема изменение количества Т-регуляторных клеток происходит в области статистически значимо более низких значений признака у детей с низкими значениями ТИ при сравнимых показателях CD4+- и CD8+-лимфоцитов (р < 0,001).
При определении двойных позитивных Т-клеток в периферической крови у недоношенных новорожденных установили, что доля CD4+CD8+-лимфоцитов в крови недоношенных детей с низким показателем объемной характеристики тимуса значимо превышает таковую у детей со средними и высокими значениями ТИ, начиная с 5-7-х суток жизни и прогрессивно увеличивается к концу 1-го месяца жизни (табл. 8).
Обсуждение. В нашем исследовании продемонстрировано, что у недоношенных детей разного ГВ объемная характеристика тимуса в возрасте 36 нед скоррегирован-ного постконцептуального возраста может быть крайне вариабельна и не зависит от ГВ, МТ и роста при рождении, а является отражением тяжести патологических процессов, развивающихся на 1-м месяце жизни.
Ввиду того, что размеры тимуса могут меняться под воздействием различных стрессовых для организма факторов, в литературе описаны нормативные ультразвуковые параметры вилочковой железы лишь для здоровых доношенных детей,
рожденных через естественные родовые пути [13]. В связи с высокой вариабельностью полученных значений ТИ мы вычислили интерквартильный интервал значений ТИ и определили интервалы минимальных и максимальных значений данного показателя, согласно которым недоношенных детей разделили на группы. Сравнивая исследуемые группы по таким ключевым параметрам, как срок гестации, пол, масса тела и рост при рождении, наличие хориоамниони-та у матери, состояние ребенка при рождении, значимых отличий не выявили. Это позволило сделать вывод о том, что размер тимуса у детей в возрасте 36 нед скоррегированного постконцептуального возраста не зависит от антропометрических данных, а также воздействия ключевых анте- и интранаталь-ных факторов.
При изучении вопроса о возможных различиях в частоте развития отдельных патологических состояний и тяжести их течения установили, что такие потенциально инвалидизирующие состояния, как БЛД и НЭК, встречаются значительно чаще у недоношенных детей с низкими и высокими значениями ТИ, чем у детей, у которых ТИ находится в диапазоне средних значений. При этом, несмотря на отсутствие различий в частоте генерализации инфекции, характере гемодинамических нарушений, проводимой этиотропной и патогенетической терапии, длительности и параметров ИВЛ, группа детей с низкими значениями ТИ характеризовалась значимо большей частотой развития БЛД
О
О
+ -Ц-.
со
о.
S
LL
Ю
СМ
О
ч
о
о
0,189
0,162
0,112 °'115
] 1-я группа
5-7-е 14-16-е
12-я группа \УУ/У
21-22-е
3-я группа
Рис. 4. Отношение Тreg/CD4+ месяца жизни.
Здесь и на рис. 5: по оси абсцисс < 0,001; ** -p ANOVA < 0,001;p1-3 2-3 < 0,001).
у детей трех групп в течение 1-го сутки; * - p ANOVA < 0,001; p1-21-3 2-3
со
О
О
+А-
со
о.
S
ю
см
а
ч
о
о
0,487
0,393
] 1-я группа
0,117
5-7-е 14-16-е 21-22-е
12-я группа ((%13-я группа
Рис. 5. Отношение Treg/CD8+ месяца жизни.
у детей трех групп в течение 1-го
- 42 -
ИММУНОПАТОЛОГИЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ ИММУНОЛОГИЯ
CD4+(a6c)
CD4+(a6c)
Рис. 6. Изменение в динамике абсолютных значений (406/л) CD4+CD25hiehFoxp3+ Т-регуляторных лимфоцитов относительно линейно изменяемых показателей CD4+ (406/л) и CD8+ (406/л) лимфоцитов у детей 2-й (2) и 3-й (3) групп (20-21-е сутки жизни).
тяжелой степени тяжести и прогрессирующих стадий НЭК, осложнившихся перфорацией кишечника.
Считается, что уменьшение размера тимуса сопровождается снижением периферического пула Т-лимфоцитов, что является фактором риска реализации и генерализации инфекции у новорожденных и детей раннего возраста [14]. Проанализировав стандартные лабораторные данные, мы не выявили статистически значимых различий как в частоте развития феномена стойкой абсолютной лимфопении, так и в количестве CD3+-, СО3+СВ4+-субпопуляций Т-лимфоцитов в периферической крови на 1-м месяце жизни между группами детей с низкими и высокими значениями ТИ. Однако при исследовании минорных субпопуляций выявили, что низкие значения ТИ ассоциированы с критически низкими показателями как относительного, так и абсолютного количества Т-регуляторных CD4+CD25+Foxp3+-лимфоцитов периферической крови новорожденных, в то время как максимальные значения данного показателя наблюдали в группе детей с высокими значениями ТИ. Еще один интересный аспект был продемонстрирован при определении двойных позитивных Т-клеток в периферической крови недоношенных новорожденных. Показано, что доля CD4+CD8+-лимфоцитов в крови недоношенных детей с низким показателем объемной характеристики тимуса значимо превышает таковую у детей со средними и высокими значениями ТИ начиная с 5-7-х суток жизни и прогрессивно увеличивается к концу 1-го месяца жизни.
В настоящее время значение нарушения формирования адаптивных реакций иммунной системы в патогенезе инвалидизирующих состояний
перинатального периода не определено. Однако полученные нами данные, а также результаты ряда экспериментальных работ, опубликованных в последние годы, свидетельствуют о целесообразности дальнейшего детального изучения указанного аспекта для понимания патогенетических основ заболеваний перинатального периода. Так, в исследовании D. Rosen и соавт. на экспериментальной модели убедительно продемонстрировано, что формирование тяжелой БЛД ассоциировано с уменьшением объема и нарушением структурности коркового слоя вилочковой железы с утратой поддерживающих клеток («клетки-няньки») и инфильтрацией легочной паренхимы аутоагрессивными CD4+- и CD8+-лимфоцитами [15]. Известно, что двойные позитивные клетки, прошедшие положительную селекцию, мигрируют в кортикомедуллярную зону, где подвергаются негативной селекции, суть которой заключается в элиминации аутоагрессивных клонов Т-лимфоцитов [16]. Взаимодействие тимоцитов с интерди-гитальными дендритными клетками, макрофагами, медуллярными эпителиальными клетками, экспрессирующими HLA-молекулы со встроенным аутологичным антигеном, вызывает элиминацию аутоагрессивных Т-лимфоцитов. Продемонстрированное в нашем исследовании прогрессивное увеличение доли двойных позитивных клеток в периферической крови недоношенных новорожденных с низкими значениями ТИ может являться косвенным признаком нарушения структурности кортикомедуллярной зоны вилочковой железы у недоношенных детей.
В настоящее время огромный научный интерес представляет изучение роли Т-регуляторного звена иммунной системы как фактора, обеспечивающего адекватное включение и реализацию механизмов адаптивного иммунитета при различных формах патологии у недоношенных детей разного ГВ, в том числе с ЭНМТ при рождении [17]. Так, в экспериментальных исследованиях на мышах показано, что системный воспалительный ответ может нарушать диф-ференцировку Т-регуляторных лимфоцитов. В то же время введение культивированных in vitro Foxp3+ Т-регуляторных лимфоцитов способствует уменьшению воспаления и купированию колита и синдрома острого повреждения легких [18, 19, 20]. В настоящее время не исключается контролирующая роль Т-регуляторных клеток в диффузной нейроэндокринной системе, нарушение функции которой может приводить к синтезу биологически активных нейропептидов, способных нарушать морфофункциональные свойства тимуса [21, 22].
Таким образом, объемная характеристика тимуса недоношенного ребенка на 1-м месяце жизни является вариабельной величиной и определяется комплексом патогенетических процессов, лежащих в основе заболеваний перинатального периода. Дальнейшее изучение морфологических особенностей тимуса у детей различного ГВ, а также изменения в динамике как основных, так и минорных субпопуляций Т-лимфоцитов в процессе формирования адаптивного иммунитета на первых месяцах жизни послужит базой для более глубокого понимания патогенетических основ заболеваний перинатального периода и совершенствования превентивных терапевтических стратегий.
Таблица 8
Изменения в динамике доли (в %) двойных позитивных лимфоцитов в периферической крови у детей в трех группах на 7-8-е и 21-22-е сутки жизни
Показатель Группа детей p, ANOVA (post-
1-я 2-я 3-я hoc test)
CD4+CD8+ 7-8-е сутки 1,2 (0,8; 1,7) 1,5 (1,1; 1,9) 1,8 (1,3; 2,7) > 0,05
cD4+cD8+ 21-22-е сутки 1,6 (0,9; 2,1) 1,9 (1,1; 2,4) 4 (2,8; 6,5) > 0,05 (^ 2-3 < 0,001)
p, Wilcoxon (matched pair test) > 0,05 > 0,05 = 0,013
- 43 -
ИММУНОЛОГИЯ № 1, 2014
ЛИТЕРАТУРА (REFERENCES)
1. Marodi L. Neonatal innate immunity to infectious agents. Infect. Immunol. 2006; 74 (4): 1999-2006.
2. MarchantA., GoldmanM. T cell-mediated immune responses in human newborns: ready to learn? clin. Exp. Immunol. 2005; 141 (1): 10-8.
3. LadE., YinX., RobeyE. Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection. Nature Immunol. 2006; 7 (4): 338-43.
4. Harris J., Hazenberg M., Poulin J., Higuero-Alhina D., Schmidt D., GotwayM. et al. Multiparameter evaluation of human thymic function: interpretation and caveats. Clin. Immunol. 2005; 115 (2): 138-46.
5. HarrisD., SchumacherM., Locascio J., Besencon F., Olson G., DeLuca D. et al. Phenotypic and functional immaturity of human umbilical cord blood T lymphocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996; 89 (21): 10006-10.
6. Lau J., Magee F., Qiu Z., Hoube J., Von Dadelszen P., Lee S.Chorioamnionitis with a fetal inflammatory response is associated with higher neonatal mortality, morbidity, and resource use than chorioamnionitis displaying a maternal inflammatory response only. Am. J. Obstetr. Gynecol. 2005;193 (3): 708-13.
7. LynchH., Goldberg G., ChidgeyA., Van den BrinkM., BoydR., Sem-powski G. Thymic involution and immune reconstitution. Trends Immunol. 2009; 30 (7): 366-73.
8. Jeppesen D., Hasselbalch H., Lisse I., Ersb0ll A., Engelmann M. T-lymphocyte subsets, thymic size and breastfeeding in infancy. Pe-diatr. Allergy Immunol. 2004; 15 (2): 127-32.
9. Toti P., De Felice C., Stumpo M., SchurfeldK., Di Leo L., Vatti R. et al. Acute thymic involution in fetuses and neonates with chorioamni-onitis. Hum. Pathol. 2000; 31 (9): 1121-8.
10. Glavina-DurdovM., Springer O., Capkun V., Saratlija-Novakovic Z., Rozic D., Barle M. The grade of acute thymus involution in neonates correlates with the duration of acute illness and with the percentage of lymphocytes in peripheral blood smear. Pathological study. Biol. Neonate. 2003; 83 (4): 229-34.
11. de Felice C., Toti P., Musard M., Peruzzi L., Paffetti P., Pasqui L.
et al. Early activation of the hypothalamic-pituitary-adrenal-axis in very-low-birth-weight infants with small thymus at birth. J. Matern. Fetal Neonatal Med. 2008; 21 (4): 251-4.
12. Jobe A. Mechanisms to explain surfactant response. Biol. Neonate. 2006; 89: 298-302.
13. Varga I., Uhrinova A., Toth F., Mistinova J. Assessment of the thymic morphometry using ultrasound in full-term newborns. Surg. Radiol. Anat. 2011; 33 (8): 689-95.
14. Ngom P., Solon J., Moore S., Morgan G., Prentice A., Aspinall R. Thymic function and T cell parameters in a natural human experimental model of seasonal infectious diseases and nutritional burden. J. Biomed. Science. 2011; 18: 41-4.
15. Rosen D., Lee J., CuttittaF., Rafiqi F., Degan S., Sunday M. Accelerated thymic maturation and autoreactive T cells in bronchopulmonary dysplasia. Am. J. Respir. crit. care Med. 2006; 174: 75-83.
16. Parel Y., Chizzolini C. CD4+ CD8+ double positive (DP) T cells in health and disease. Autoimmun. Rev. 2004; 3 (3): 215-20.
17. Sakaguchi S. Naturally arising Foxp3-expressing cD25+ cD4+ regulatory T cells in immunological tolerance to self and non-self. Nature Immunol. 2005; 6 (4): 345-52.
18. D’Alessio F., Tsushima K., Aggarwal N., West E., Willett M. CD4+CD25+Foxp3+ Tregs resolve experimental lung injury in mice and are present in humans with acute lung injury. J. clin. Invest. 2009; 119: 2898-913.
19. Bilate A, Lafaille J. Induced cD4+Foxp3+ Regulatory T cells in immune tolerance. Annu. Rev. Immunol. 2012; 30: 733-58.
20. Sakaguchi S., MiyaraM., Costantino C., Hafler D. FOXP3+ regulatory T cells in the human immune system. Nature Rev. Immunol. 2010; 10: 490-500.
21. Geenen V. Thymus-dependent T cell tolerance of neuroendocrine functions: principles, reflections, and implications for tolerogenic/negative self-vaccination. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2006; 1088: 284-96.
22. GarciaM. The importance ofthe nurse cells and regulatory cells in the control of T lymphocyte responses. BioMed Research International. 2013, Article ID 352414, 15 pages, 2013. doi:10.1155/2013/352414.
Поступила 21.03.13
МЕТОДЫ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 616.9-022-078.33
А.В. Маерле1, И.В. Сергеев1, Л.П. Алексеев1
метод иммуно-пцр: перспективы использования
1ФГБУ ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России, 115478, г. Москва
Использование методов иммуноферментного анализа (ИФА) и полимеразной цепной реакции (ПЦР) в лабораторной диагностике сложно переоценить. Специфичность ИФА и высокая чувствительность ПЦР были совмещены в методе иммуно-ПЦР Использование фрагмента ДНК в качестве метки для детекции взаимодействия антигенантитело позволило увеличить чувствительность детекции в 10-10 000 по сравнению с таковой при методе ИФА. Иммуно-ПЦР является высокочувствительным методом определения очень малых количеств антигена и антител.
Ключевые слова: иммуно-ПЦР, иммуноферментный анализ, перспективы использования.
A.V Maerle1,1.V Sergeev1, L.P. Alekseev1
IMMUNO-PCR METHOD: PROSPECT OF APPLICATION
Federal state institution State research center Institute of immunology, 115478, Moscow
Application of enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) and polymerase chain reaction (PCR) could hardly be overestimated. Specificity of ELISA and sensitivity of PCR were combined in method, termed immuno-PCR. Using DNA fragment as a reporter for antigen-antibody reaction permits to increase the sensitivity of detection 10-10000-fold compared to analogous ELISA. Immuno-PCR is a high-sensitive method for detection of very small amounts of antigens and antibodies.
Key words: Immuno-PCR method, immunosorbent assays, prospect of application
Маерле Артем Владимирович (Maerle Artem Vladimirovich), [email protected]; Сергеев Илья Викторович (Sergeev Il’ya Viktorovich); Алексеев Леонид Петрович (Alekseev Leonid Petrovich)
- 44 -
