ВАЛИДАЦИЯ СПОСОБА ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ 146S ИММУНОГЕННОГО КОМПОНЕНТА ВИРУСА ЯЩУРА В ВАКЦИНЕ ПРИ СРАВНЕНИИ ГРАФИКОВ ВТОРОЙ ПРОИЗВОДНОЙ ДЛЯ СИГМОИД РЕАКЦИИ АМПЛИФИКАЦИИ Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

DOI 10.24411/2074-5036-2020-10023 УДК 619:616.98:578.835.2:615.371

Ключевые слова: 146S иммуногенный компонент вируса ящура, вакцина, реакция амплификации, вторая производная, валидация

Keywords: 146S immunogenic component of foot and mouth disease virus, vaccine, second derivative, real time RT-PCR, validation

Доронин М.И., Михалишин Д.В., Стариков В.А., Лозовой Д.А., Борисов А.В.

ВАЛИДАЦИЯ СПОСОБА ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ 146S ИММУНОГЕННОГО КОМПОНЕНТА ВИРУСА ЯЩУРА В ВАКЦИНЕ ПРИ СРАВНЕНИИ ГРАФИКОВ ВТОРОЙ ПРОИЗВОДНОЙ ДЛЯ СИГМОИД

РЕАКЦИИ АМПЛИФИКАЦИИ

VALIDATION OF THE METHOD FOR DETERMINING THE CONCENTRATION OF THE 146S IMMUNOGENIC COMPONENT OF FMD VIRUS IN A VACCINE BY COMPARING THE SECOND DERIVATIVE FOR THE SIGMOID AMPLIFICATION REACTION

ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» Адрес: 600901, Россия, г. Владимир, мкр. Юрьевец

Federal Centre for Animal Health, Federal Governmental Budgetary Institution Address: 600901, Russia, Vladimir, Yur 'evets

Доронин М. И., к. б. н., стар. науч. сотрудник. E-mail: doronin@arriah.ru.

Doronin M. I., PhD in Biological Science, Senior Researcher. E-mail: doronin@arriah.ru Михалишин Д. В., к. в. н., зав. лабораторией. E-mail: mihalishindv@arriah.ru Michalishin D. V, PhD in Veterinary Science, Head of the Laboratory. E-mail: mihalishindv@arriah.ru Стариков В. А., к. в. н., вед. науч. сотрудник. E-mail: starikov@arriah.ru Starikov V. A., PhD in Veterinary Science, Leading Researcher. E-mail: starikov@arriah.ru Лозовой Д. А., д. в. н., зам. директора, доцент. E-mail: lozovoy@arriah.ru Lozovoy D.A., Doctor of Science (Veterinary Medicine), Associate Professor, Deputy Director for Research

and Development. E-mail: lozovoy@arriah.ru Борисов А. В., к. в. н., вед. науч. сотрудник. E-mail: borisov@arriah.ru Borisov A. V., PhD in Veterinary Science, Leading Researcher. E-mail: borisov@arriah.ru

Аннотация. В данной статье представлена оценка основных валидационных характеристик методики опосредованного определения концентрации 146S компонента вируса ящура при сравнении графиков второй производной для кривых обратнотранскриптазной полимеразной цепной реакции в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ) с применением квадратичной функции C146S ВЯ = 0,0111(Cp)2-1,0157Cp+20,446. Диапазон применения ОТ-ПЦР-РВ составил 0,0514,75 мкг/см3. При тестировании вируссодержащего материала с концентрациями 146S компонента от 0,05 до 5,00 мкг/см3 валидируемая методика характеризуется высокой специфичностью (e составляет 0,2-5,0 %), а также высокой прецизионностью в условиях сходимости и воспроизводимости. При оценке линейности и правильности доказано, что валидируемая методика дает свободные от ошибки результаты с высоким коэффициентом корреляции (r=0,9965, r—»1) и степенью достоверности (R2=0,993, R2—1). Результаты валидации ОТ-ПЦР-РВ удовлетворяют всем критериям приемлемости. Исходя из этого, предложенная методика является достоверной и может быть использована для опосредованной количественной оценки 146S иммуногенного компонента вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины.

Summary. This article presents an assessment of the main validation characteristics of the method of mediated concentration of 146S component offoot and mouth disease virus when comparing the graphs of the second derivative for real-time RT-PCR curves using a quadratic function C146S FMDV = 0,0111(СJ2-1,0157Cp+20,446. The range of application of real-time RT-PCR was 0.05-14.75 /ig/cm3. When testing a virus-containing material with concentrations of 146S component from 0.05 to 5.00 ig/cm3, the validated method is characterized by high specificity (e is 0.2-5.0%), as well as high precision under convergence conditions and under reproducibility conditions. When assessing linearity and correctness, it was proved that the validated method gives error-free results with a high correlation coefficient (r = 0.9965, r ^ 1) and a degree of confidence (R2 = 0.993, R2 ^ 1). Validation results of real-time RT-PCR satisfy all eligibility criteria. Based on this, the proposed method is reliable and can be used for indirect quantitative assessment of the 146S immunogenic component offoot and mouth disease virus in unactivated raw materials for the vaccine.

Введение

При изготовлении вакцин в области ветеринарии промежуточное сырье и выпускаемая продукция проходит тщательный многоступенчатый контроль в соответствии с требованиями системы обеспечения качества.

В процессе производства вакцин против ящура одним их этапов технологического контроля сырья является определение концентрации 146S компонента вируса ящура, полученного в суспензионной перевиваемой культуре клеток из почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21^^Р/ ARRIAH) [7]. 146S, или полные частицы обладают важнейшими биологическими свойствами вируса ящура и являются основными компонентами, определяющими иммуногенность вакцинных препаратов [8]. Традиционно для определения данного показателя вакцины применяли реакцию связывания комплемента в модификации А.Ф. Бондаренко. Одним из новых способов опосредованной оценки концентрации 146S компонента вируса ящура в неинак-тивированной суспензии для изготовления вакцины является сравнение максимальных экстремумов графиков второй производной (Ср) сигмоидных накопления флуоресцентного сигнала. Зависимость между количествами 146S частиц неинактивированного вируса ящура и максимальными экстремумами графиков второй производной кривой накопления флуоресцентного сигнала отражают в виде квадратичной функции С1463 ВЯ = 0,0111(Ср)2-1,0157Ср+20,446 с достоверностью аппроксимации 99,3 %. Данный способ является высокочувствительным и высокоспецифичным, позволяет анализировать большое количество образцов за 4-5 ч.

Оценку пригодности представленного способа проводят на основе результатов валидации, предполагающей определение специфичности, правильности, прецизионности, диапазона применения и линейности аналитической методики, а также предела обнаружения и количественного определения 146S компонента [5].

Специфичностью данной методики считается возможность однозначно опосредованно определять концентрацию 146S

частиц вируса ящура в исследуемой суспензии при наличии в анализируемой пробе посторонних антигенных компонентов [4].

Для определения точности указанной методики раскрывают понятия правильности и прецизионности. Правильность — близость к эталонному среднего значения концентрации 146S компонента вируса ящура, полученного в результате большой серии экспериментов. Прецизионностью называют степень разброса значений максимальных экстремумов графиков второй производной кривых накопления сигнала флуоресценции между сериями измерений для множества проб, взятых из одного и того же образца в условиях, определенных методикой [2, 4]. Соответственно проводят анализ повторяемости результатов измерений в условиях сходимости и воспроизводимости, определяя абсолютные и относительные показатели вариации [9, 10, 11].

Предел обнаружения рассматриваемой методики — наименьшая концентрация 146S частиц вируса ящура, которые могут быть качественно детектированы [5]. Пределом количественного определения считается наименьшее значение концентрации 146S компонента вируса ящура, которое можно оценить количественно [3, 4, 5].

Для доказательства существования прямо пропорциональной зависимости значений Ср и концентрации 146S компонента вируса ящура в пределах аналитической области методики оценивают ее линейность [5]. Интервал между максимальным и минимальным значениями концентрации 146S частиц, в котором алгоритм определения аналитических частиц имеет приемлемый уровень прецизионности, правильности и линейности является диапазоном применения представленной методики [5, 9].

Цель исследования заключалась в оценке валидационных показателей методики опосредованного определения концентрации 146S компонента вируса ящура в вакцине при сравнении максимальных экстремумов графиков второй производной сигмоидных накопления флуоресцентного сигнала в ОТ-ПЦР-РВ.

Материалы и методы

Вирус ящура. Для исследования применяли культуральный вирус ящура штаммов А/Забайкальский/2013, А/Турция/2006, А/Краснодарский/2013, О/Приморский/2014, О/Саудовская Аравия/2008, О/Чечено-Ин-гушский/1966, Азия-1/Таджикистан/2011, Азия-1/Пакистан/2018, САТ-2/Саудовская Аравия/2000, репродукцию которых осуществляли в суспензионной перевиваемой культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH.

Определение концентрации 146S компонента в ОТ-ПЦР-РВ при анализе максимальных экстремумов графиков второй производной сигмоидных накопления флуоресцентного сигнала. Оценку концентрации 146S частиц методом ОТ-ПЦР-РВ проводили на основе сравнительного анализа максимальных экстремумов графиков второй производной сигмоидных накопления флуоресцентного сигнала в соответствии с требованиями, описанными ранее [6].

Реакция связывания комплемента (РСК). Для определения концентрации 146S частиц вируса ящура применяли количественный вариант РСК, проведение которого осуществляли в соответствии с требованиями [1].

Оценка специфичности методики. Специфичность методики определяли по относительной погрешности (е) результатов, полученных одновременно с использованием ва-лидируемой методики ОТ-ПЦР-РВ и РСК [1]. Проводили исследование 9 модельных смесей культурального вируса ящура, которые содержали разное количество 146S частиц в смеси с 75S, 12S и 3^ компонентами [7]. Фракционирование культурального вируса ящура на компоненты проводили с помощью ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы при 40 000 об./мин. [8]. Анализ осуществляли в 5 повторениях. Относительную погрешность находили по

формуле: е=(С146S1-С146S):С146S, где С1463' -концентрация 146S компонента вируса ящура по результатам ОТ-ПЦР-РВ, С1463 - концентрация 146S компонента по данным РСК. Специфичность методики считали высокой при е < 5% [4, 5].

Оценка правильности методики. Для исследования правильности методики про-

водили анализ 350 проб культурального вируса ящура с известными значениями титра в ОТ-ПЦР-РВ. Данные были представлены в виде уравнения линейной зависимости между экспериментально найденными в ОТ-ПЦР-РВ (у) и истинными значениями концентрации 146S компонента (x): y=kx+b. Для полученной функции проверяли гипотезы о тождестве тангенса угла наклона (k) единице и равенстве свободного члена (b) нулю. При доказательстве верности указанных гипотез со степенью надежности, равной 0,05, использование валиди-руемой методики дает свободные от ошибки результаты [2, 5].

Оценка прецизионности методики. Для исследования прецизионности методики ОТ-ПЦР-РВ в условиях сходимости и воспроизводимости рассчитывали абсолютные и относительные показатели вариации [4, 5, 9].

Определение абсолютных показателей вариации. Размах вариации (R) оценивали как разность между наибольшим и наименьшим значениями Cp: R=Cp -Cp .

А А max А mm

Индивидуальное линейное отклонение (di) рассчитывали по формуле: di = |Cpi - Срср |. Среднее линейное отклонение (d) рассчитывали как среднее арифметическое из индивидуальных линейных отклонений по формуле: |:N, где di - индивидуальные линейные отклонения пороговых циклов амплификации, N — объем совокупности. Оценку дисперсии (52) показателей проводили с использованием формулы: 52=(£di2):N. Для характеристики размеров вариации Ct рассчитывали среднее квадратичное отклонение (5), пользуясь формулой: 5=V(52) [3, 11].

Определение относительных показателей вариации. Расчет коэффициента осцилляции (VR) проводили, пользуясь формулой: V^R^t^-lOO. Линейный коэффициент вариации (Cd) рассчитывали по формуле: C=d :Ct 100. Для оценки колеблемости ин-

d ср ср

дивидуальных значений пороговых циклов амплификации определяли коэффициент вариации (C5) по формуле: С5=5:0;ср100 [10, 11]. Метод считают надежным при C5<2% в условиях сходимости и C5<3% в условиях воспроизводимости [9].

Расчет нижнего предела обнаружения концентрации 146S компонента вируса ящура (ПОС1463). Наименьшую концентрацию 146S компонента вируса ящура с использованием валидируемой методики находили по формуле: ПОС1463 = 3,3^ь:к, где Sb - стандартное отклонение аналитического сигнала, которое соответствует стандартному отклонению свободного члена (Ь); к - тангенс угла наклона [3, 4, 10]. Свободный член Ь находили при анализе 5 модельных образцов с концентрациями 146S частиц вируса ящура: 0,001; 0,01; 0,10; 0,50; 1,00 мкг/см3.

Вычисление предела количественного определения концентрации 146S компонента вируса ящура (ПКОС146). Минимальное значение концентрации 146S компонента вируса ящура, определенное с соответствующей правильностью и прецизионностью валидируемой методики, рассчитывали, применяя формулу [10, 11]: ПКОС1468 = 10^ь:к. Полученное значение ПКОС1463 подтверждали экспериментально при исследовании 5 модельных суспензий вируса ящура с концентрациями 146S компонента, близкими к найденному значению предела количественного определения: 0,015; 0,030; 0,045; 0,050; 0,100 мкг/см3. Анализ проводили в 5 повторениях. Результаты исследования считали статистически достоверными при р<0,005.

Определение диапазона применения методики. Для исследования аналитической области валидируемой методики исследовали 8 модельных образцов со следующими значениями концентрации 146S частиц вируса ящура: 0,05; 0,50; 2,00; 5,00; 10,00; 14,00; 14,75; 15,00 мкг/см3 в 5 повторениях.

Определение линейности методики. Существование линейной зависимости порогового цикла амплификации и концентрации 146S компонента вируса ящура в пределах диапазона применения методики проверяли в экспериментально, определяя С{ для 50 проб с различными концентрациями 146S частиц в 5 повторениях. Полученные данные обрабатывали методом наименьших квадратов с использованием регрессии вида: С=кС+Ь, где к - угловой коэффициент; Ь - свободный член. Достоверность результатов анализа подтверждали, вычисляя коэф-

фициент корреляции (г), который по модулю должен быть > 0,99 [3, 4, 10].

Результаты и обсуждение

На первом этапе исследования определяли специфичности валидируемой методики для опосредованной оценки концентрации 146S компонента вируса ящура в сырье для вакцины при сравнении графиков второй производной для кривых ОТ-ПЦР-РВ. Подготавливали 9 модельных образцов, добавляя к суспензиям 146S частиц, определяющих иммуногенность вакцины [7, 8], смесь 75S, 12S и 3^ компонентов для выявления возможного их влияния на специфичность данной методики. Состав модельных образцов, а также результаты определения относительной погрешности (е) при исследовании в ОТ-ПЦР-РВ представлены в таблице 1.

Из данных таблицы 1 видно, что относительная погрешность опосредованного определения концентрации 146S компонента вируса ящура с помощью валидируемой методики при содержании 146S частиц 5,00 -4,00; 4,00 - 3,00; 3,00 - 2,00; 2,00 - 1,00; 1,00 -0,50; 0,50 - 0,10; 0,10 - 0,05 мкг/см3 составляла 0,20 - 1,50; 0,25 - 1,67; 0,35 - 2,00; 0,50 -2,00; 1,00 - 3,12; 2,00 - 3,54; 3,00 - 5,00 %, соответственно. Таким образом, отмечали высокую специфичность методики для суспензий с концентрациями 146S частиц вируса ящура от 5,00 до 0,05 мкг/см3, при исследовании которых относительная погрешность не превышала 5%. В исследовании не анализировали пробы с концентрациями 146S компонента более 5,00 мкг/см3, поскольку в неинактивированных суспензиях культу-рального вируса ящура содержание не превышает данного значения.

Следующий этап исследования посвящен оценке правильности валидируемой методики, тестируя в ОТ-ПЦР-РВ 350 проб вируса ящура с концентрациями 146S компонента: 0,10; 0,50; 1,00; 2,00; 3,00; 4,00; 5,00 мкг/см3 (по 50 проб на каждую концентрацию). Результаты исследования представлены на рисунке 1 в виде линейной функции у = 0,9963 х+0,0149, которая при степени достоверности (Д2) 0,9994, подтверждает, что тангенс угла наклона (к) стремится к единице

Таблица 1

Оценка специфичности методики опосредованного определения концентрации 146S компонента вируса ящура в сырье для вакцины при сравнении графиков второй производной для кривых ОТ-ПЦР-РВ (n=5, M±m)

№ смеси Состав модельной смеси Относительная погрешность (е) при измерении концентрации 1468 частиц в сырье для вакцины методом ОТ-ПЦР-РВ, %

название компонента содержание компонента в смеси, % концентрация 146S компонента, мкг/см3

1 146S 100 5,00 0,20-0,65

75S+12S+3,8S 0

2 146S 80 4,00 0,25-1,50

75S+12S+3,8S 20

3 146S 60 3,00 0,35-1,67

75S+12S+3,8S 40

4 146S 40 2,00 0,50-2,00

75S+12S+3,8S 60

5 146S 20 1,00 1,00-2,00

75S+12S+3,8S 80

6 146S 10 0,50 2,00-3,12

75S+12S+3,8S 90

7 146S 2 0,10 3,00-3,54

75S+12S+3,8S 98

8 146S 1 0,05 4,00-5,00

75S+12S+3,8S 99

9 146S 0,5 0,025 -*

75S+12S+3,8S 99,5

Примечание: * Ср превышают предельное значение, позволяющее применять функцию С1468 ВЯ = 0,0111(С )2-1,0157С +20,446.

1468 ВЯ ' 4 р ' р

(k = 0,9963), а свободный член (b) - к нулю (b = 0,0149). Таким образом, применение ва-лидируемой методики позволяет получать достоверные результаты.

На следующем этапе проводили оценку прецизионности методики опосредованного определения концентрации 146S частиц вируса ящура в сырье для вакцины при сравнении графиков второй производной для кривых ОТ-ПЦР-РВ с расчетом абсолютных и относительных показателей вариации.

Прецизионность в условиях сходимости определяли по вариабельности результатов реакции внутри одного исследования 5 суспензий культурального вируса ящура с концентрациями 146S компонента: 0,10; 1,00; 2,00; 3,00; 5,00 мкг/см3, которые одновременно тестировал один оператор на одном

анализирующем термоциклере в 20 повторениях. Результаты статистического анализа полученной совокупности максимальных экстремумов сигмоидных ОТ-ПЦР-РВ (Ср^ отражены в таблице 2, из данных которой следует, что размах вариации составил 0,040,29, среднее линейное отклонение - 0,0080,045, иными словами, уровень вариации CpJ в полученных выборках при указанных значениях концентрации 1468 частиц вируса ящура относительно средней величины признака низкий. Коэффициент дисперсии находился в диапазоне 0,000-0,004, среднее квадратичное отклонение составило 0,0110,063, что подтверждает незначительную степень отклонений индивидуальных значений Ср от среднего арифметического (Ср ). Таким образом, колеблемость индивидуальных

значений в выборках низкая, а значения Ср представляют собой надежную совокупность.

Для оценки колеблемости полученных значений CpJ внутри генеральной совокупности определяли относительные показатели вариации. Коэффициент осцилляции составлял 0,208-0,981%, иными словами, относительное изменение крайних значений CpJ по сравнению со средней величиной во всех выборках низкое. Линейный коэффициент вариации находился в диапазоне 0,044-0,152 %, следовательно, доля усредненного значения отклонений от Срср в каждой совокупности не значительна. Коэффициент вариации индивидуальных значений пороговых циклов амплификации составил 0,056-0,214 %, что соответствует общим требованиям, предъявляемым к валидируемым методикам (С5<2%) [3, 4, 5, 10].

Таким образом, при исследовании суспензий вируса ящура с концентрациями анали-та от 0,10 до 4,00 мкг/см3 в 20 повторениях с помощью предложенной методики одним оператором получены однородные и надежные совокупности значений максимальных экстремумов графиков второй производной сигмоид ОТ-ПЦР-РВ, которые можно применять для опосредованного выражения концентрации 146S компонента вируса ящура.

Следующий этап работы был посвящен исследованию прецизионности валидиру-емой методики в условиях воспроизводимости. Для этого анализ суспензий куль-турального вируса ящура проводили два оператора в разное время в 20 повторениях (40 измерений для каждой пробы). Полученные результаты отражены в таблице 2, из которой следует, что для генеральной совокупности значений Ср размах вариации составил 0,07-0,66, среднее линейное отклонение ^ср) — 0,009-0,055, иными словами, степень колеблемости Ср1 в полученных выборках относительно среднего уровня признака низкая. Дисперсия составила 0,000-0,008, среднее квадратичное отклонение — 0,012-0,091, что подтверждает незначительную степень отклонений индивидуальных значений Ср от среднего арифметического и высокий уровень достовер-

я 5

- _

-

о с" !

3 о

6 у = 0,99бЗх +0,0149 К" = 0,9994 . I .

5 4 У"

3 2 1

1 г

г

V 1 { л ) 1 1 ; ! 3 4 1 ! 5 6

Рис. 1. Исследование правильности методики опосредованного определения концентрации 1468 компонента вируса ящура при сравнении графиков второй производной для кривых ОТ-ПЦР-РВ (п=5)

ности результатов внутри каждой выборки максимальных экстремумов графика второй производной сигмоиды ОТ-ПЦР-РВ.

Исследуя относительные показатели вариации Ср1, выявили, что коэффициент осцилляции составил 0,365-2,231 %, линейный коэффициент вариации - 0,045-0,185 %, коэффициент вариации - 0,064-0,185 %, что соответствует общепринятым нормам (С5<3%) [3]. Исходя из полученных результатов, относительное изменение крайних значений Ср и доля усредненного значения абсолютных отклонений в сравнении со средним внутри каждой совокупности незначительна. Следует отметить, что вариация значений параметров валидации при исследовании суспензий вируса ящура с увеличением концентрации 1468 компонента от 0,10 до 5,00 мкг/см3 снижалась, а степень достоверности результатов возрастала.

В результате сравнительного анализа данных, полученных при оценке прецизионности валидируемой методики, доказали, что в условиях сходимости степень достоверности результатов опосредованного определения концентрации 1468 частиц вируса ящура выше по сравнению с оценкой, проводимой в условиях воспроизводимости, что соответствует общепринятым статистическим ожиданиям [9]. По абсолютным и относительным показателям вариации валидируемая методика удовлетворяла критериям приемлемости [3, 9, 11].

На следующем этапе исследования определяли предел обнаружения (ПОС1468) и

Таблица 2

Оценка прецизионности методики для опосредованного определения концентрации 146S частиц вируса ящура при сравнении графиков второй производной для кривых

ОТ-ПЦР-РВ (n=5)

Валидационные показатели методики Значения показателей валидации при исследовании суспензий с разными концентрациями 1468 частиц вируса ящура (мкг/см3)

при оценке условия сходимости условия воспроизводимости

прецизионности 0,10 1,00 2,00 3,00 5,00 0,10 1,00 2,00 3,00 5,00

объем выборки Cp (N) 20 20 20 20 20 40 40 40 40 40

среднее значение Cp (СРср) 29,569 27,078 24,811 22,811 19,198 29,579 27,066 24,802 22,779 19,197

суммарное значение

индивидуального линейного отклонения 0,896 0,844 0,630 0,354 0,168 2,192 2,424 1,932 1,818 0,342

по модулю (X|di|)

суммарное значение

квадрата модуля индивидуального 0,080 0,054 0,042 0,010 0,002 0,329 0,226 0,197 0,154 0,006

линейного

отклонения (Xdi2)

наибольшее значение Cp (Cp ) А v А max' 29,640 27,200 24,900 22,860 19,220 29,950 27,300 24,960 22,860 19,230

наименьшее значение Cp (Cpmin) 29,350 27,000 24,690 22,770 19,180 29,290 26,980 24,650 22,600 19,160

размах вариации (R) 0,290 0,200 0,210 0,090 0,040 0,660 0,320 0,310 0,260 0,070

среднее линейное отклонение (d,D) 0,045 0,042 0,031 0,018 0,008 0,055 0,061 0,048 0,045 0,009

дисперсия (52) 0,004 0,003 0,002 0,001 0,000 0,008 0,006 0,005 0,004 0,000

среднее квадратичное отклонение (5) 0,063 0,052 0,046 0,023 0,011 0,091 0,075 0,070 0,062 0,012

коэффициент осцилляции (VR), % 0,981 0,739 0,846 0,395 0,208 2,231 1,182 1,250 1,141 0,365

линейный

коэффициент 0,152 0,156 0,127 0,078 0,044 0,185 0,224 0,195 0,199 0,045

вариации (Cd), %

коэффициент вариации (C5), % 0,214 0,191 0,185 0,099 0,056 0,306 0,278 0,283 0,272 0,064

количественного определения (ПКОС1468) концентрации 1468 компонента вируса ящура в сырье для вакцины с помощью валиди-руемой методики. Проведя исследования в 7 повторениях, получили следующие значения свободного члена (Ь): 20,444; 20,446; 20,447; 20,448; 20,449; 20,443; 20,446. Учитывая, что стандартное отклонение свободного члена (8Ь) составило 0,002, а тангенс угла наклона (к) был равен (-0,45), провели расчеты и определили, что ПОС1468 данной методикой составил 0,01551 мкг/см3 (или 15,51 нг/см3), а ПКО - 0,047 мкг/см3 (или 47 мкг/см3).

Рассчитанное значение nKOC146S подтверждали экспериментально при исследовании 5 модельных образцов культурального вируса ящура с концентрациями 146S компонента: 0,015; 0,030; 0,045; 0,050; 0,100 мкг/см3 в пяти повторениях. Результаты анализа отражены в таблице 3.

Из данных таблицы 3 следует, что экспериментальное значение nKOC146S валиди-руемой методикой подтверждает расчеты и составляет 0,050 мкг/см3.

При исследовании 8 модельных образцов с концентрациями 146S компонента вируса

Таблица 3

Выявление предела количественного опосредованного определения концентрации 1468 компонента вируса ящура при сравнении графиков второй производной

для кривых ОТ-ПЦР-РВ (п=5, М±т)

№ суспензии вируса ящура Концентрация 1468 частиц (С1468), мкг/см3 Исследование суспензии в ОТ-ПЦР-РВ Экспериментальное подтверждение, что теоретическое значение ПКО,_ - 0,047 мкг/см3 1468 '

Ср концентрация 1468 частиц (С1468), мкг/см3

1 0,015 31,56 -* подтверждено

2 0,030 30,49 - подтверждено

3 0,045 30,14 - подтверждено

4 0,050 29,52 0,048 подтверждено

5 0,100 29,38 0,100 подтверждено

Примечание: «-» - концентрация 146S частиц не определена, так как значение максимального экстремума графика второй производной сигмоиды ОТ-ПЦР-РВ выходит за пределы функции С = 0,0111(С )2-1,0157Ср+20,446.

ящура: 0,05; 0,50; 2,00; 5,00; 10,00; 14,00; 14,75; 15,00 мкг/см3 определили, что аналитическая область опосредованной оценки содержания 146Б частиц при сравнении графиков второй производной для кривых ОТ-ПЦР-РВ находилась в диапазоне 0,0514,75 мкг/см3 при значениях Ср от 29,52±0,05 до 6,00±0,01, соответственно (п=5, р<0,005). При концентрациях 146Б компонента более

14,75 мкг/см3, по всей видимости, по причине высокого содержания полных вирусных частиц предложенная квадратичная модель не позволяла проводить достоверный опосредованный количественный анализ (п=5, р>0,01). Определен нижний предел значения Ср, который для разработанной модели С

ставил 29,65.

Таблица 4

1468 ВЯ = 0,0111(Ср)2-1,0157Ср+20,446 со-

Оценка параметров валидации методики опосредованного определения концентрации 1468 компонента вируса ящура в сырье для вакцины при сравнении графиков второй

производной для кривых ОТ-ПЦР-РВ

Параметр валидации методики Валидационный показатель Значения показателей валидации методики при исследовании вируса ящура с разными концентрациями 1468 компонента (мкг/см3)

0,05 0,10 0,50 1,0 3,0 5,0

специфичность относительная погрешность (е), % 4-5 3-3,54 2-3,12 1,0-2,0 0,35-1,67 0,20-0,65

сходимость среднее квадратичное отклонение (5), % н/и 0,063 н/и 0,052 0,023 0,011

коэффициент вариации (С5), % н/и 0,214 н/и 0,191 0,099 0,056

воспроизводимость среднее квадратичное отклонение (5), % н/и 0,091 н/и 0,075 0,062 0,012

коэффициент вариации (С5), % н/и 0,306 н/и 0,278 0,272 0,064

линейность коэффициент корреляции (г) 0,9965

правильность степень достоверности (Д2) 0,9930

тангенс угла наклона (к) 0,9963

свободный член (Ь) 0,0149

аналитическая область диапазон опосредованного количественного определения, мкг/см3 0,05-14,75

Примечание: н/и — не исследовали.

На заключительном этапе исследования проведена проверка линейной зависимости значения Ср и концентрации 1468 компонента вируса ящура в пределах аналитической области методики, тестируя 50 вируссодержащих суспензий с концентрациями аналита от 0,05 до 14,75 мкг/см3 в пяти повторениях. В результате анализа получена квадратичная функция С1468 вя = 0,0111(Ср)2-1,0157Ср+20,446 с коэффициентом корреляции (г), равным 0,9965, что позволяет судить о достоверности результатов статистического исследования.

Заключение

Проведена оценка основных валидацион-ных характеристик методики опосредованного концентрации 1468 компонента вируса ящура при сравнении графиков второй производной для кривых ОТ-ПЦР-РВ с применением квадратичной функции

С1468 вя = 0,0111(С)2-1,0157С+20,446 (таблица 4).

Выявлено, что диапазон применения ОТ-ПЦР-РВ составил 0,05-14,75 мкг/см3. При тестировании вируссодержащего материала с концентрациями 1468 компонента от 0,05 до 5,00 мкг/см3 валидируемая методика характеризуется высокой специфичностью (е составляет 0,2-5,0 %), а также высокой прецизионностью в условиях сходимости, (5 находилось в диапазоне 0,011-0,063%, 5<2%, С5 — 0,056-0,214%, С5<2%) и в условиях воспроизводимости (5 составило 0,012-0,091%, 5 <3%, С5 — 0,064-0,306%, С5<3%).

При оценке линейности и правильности доказано, что валидируемая методика дает свободные от ошибки результаты с высоким коэффициентом корреляции (г=0,9965, г^Г) и степенью достоверности (R2=0,993, R2^■1).

Результаты валидации ОТ-ПЦР-РВ удовлетворяют всем критериям приемлемости.

Исходя из этого, предложенная методика является достоверной и может быть использована для опосредованной количественной оценки 146S иммуногенного компонента вируса ящура в неинактивированном сырье для вакцины.

Список литературы

1. Бондаренко А. Ф. Качественный и количественный иммунохимический анализ вирусных белков. / А. Ф. Бондаренко. Суздаль, 1994. 92 с.

2. Государственная фармакопея XII изд. Ч. 1. М., 2010. С. 254-266.

3. Ланг Т. А. Как описывать статистику в медицине. Руководство для авторов, редакторов и рецензентов. / Т. А. Ланг, М. Сесик. М.: Практическая Медицина, 2011. 480 с.

4. Носырев П. ОАО «Ай Си Эн Лексредства» / П. Носырев, М. Носырева, Т. Рассказова, Н. Корнее-ва. // Практикум по GMP. Валидация аналитических методик: теория. URL: http://www.nedug.ru/news/%d1 (Дата обращения 12.11.2018).

5. 0ФС.1.1.0012.15 Валидация аналитических методик. Фармакопея.ру. URL: https://pharmacopoeia. ru/ofs-1-1-0012-15-validatsiya-analiticheskih-metodik. (Дата обращения 12.01.2020).

6. Патент РФ № 2619878/13, 18.05.2017. Способ определения концентрации 1468-компонента вируса ящура в вируссодержащем сырье для вакцины с применением метода обратной транскрипции-полимераз-ной цепной реакции в режиме реального времени // 2017. Бюл. №14. Лозовой Д. А., Доронин М. И., Миха-лишин Д. В. [и др.].

7. Пономарев А. П. Вирус ящура: структура, биологические и физико химические свойства. / А. П. Пономарев, В. Л. Узюмов, К. Н. Груздев. Владимир: Фолиант, 2006. 250 с.

8. Ререр Х. Ящур / Х. Ререр. Пер. с нем. Г. А. Сурковой; Под ред. и с предисл. канд. вет. наук П. В. Ма-лярца. Москва: Колос, 1971. 432 с.

9. СТБ ИСО 5725-2002. «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений». Части 1-6. — 01.11.2002.

10. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 7th еd. Paris, 2018. — Ch. 3.1.8.

11. Vallat B. OIE Quality Standard and Guidelines for Veterinary Laboratories: Infectious Diseases. 2nd ed. Paris, France, 2008. 67 p.

ILL

Подписной индекс журнала «Актуальные вопросы ветеринарной биологии»: Агентство «Роспечать» - 33184