CC BY
361
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК РЕСПУБЛИКИ ТАДЖИКИСТАН _2013, том 56, №1_
ФАРМАЦИЯ
УДК 615.072
Б.М.Холназаров, М.Ш.Наботов, А.Н.Шахматов, Г.М.Бобиев
ВАЛИДАЦИЯ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОГО МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО СОДЕРЖАНИЯ ТИМОФЕРА
Таджикский государственный педагогический университет им.С.Айни
(Представлено академиком АН Республики Таджикистан К.Х.Хайдаровым 23.11.2012 г.)
Приведены результаты валидации методики определения количественного содержания ти-мофера спектрофотометрическим методом. Показано, что методика пригодна для определения количественного содержания тимофера по параметрам: линейность, сходимость и правильность.
Ключевые слова: тимофер - спектрофотометрический метод - количественное определение - ва-лидация.
Разработка новых иммуномодулирующих препаратов является одной из актуальных проблем современных химии и фармакологии. Это объясняется тем, что большинство заболеваний человека сопровождается нарушениями деятельности иммунной системы или возникает вследствие их [1]. В Таджикистане разработан иммуностимулирующий препарат тимофер, представляющий собой водный раствор координационных соединений дипептида изолейцил-триптофан с ионом железа (II) в концентрации 148 мкг/мл [2]. Тимофер обладает высокой иммуностимулирующей активностью [3]. Одним из этапов внедрения любого препарата в медицинскую практику является валидация аналитических методик, с использованием которых контролируется его качество.
Целью данного сообщения является валидация методики количественного определения ти-мофера.
Материал и метод исследования
Количественное содержание тимофера определяли спектрофотометрическим методом по сравнению значений оптической плотности исследуемого и стандартного образцов препарата.
Валидацию проводили в соответствии с требованиями Методических рекомендаций [4] и Государственной фармакопеи Украины [5].
Валидировали следующие параметры: линейность, точность, правильность.
Методика количественного определения тимофера
Измеряют оптическую плотность раствора препарата на спектрофотометре при длине волны 280±2 нм в кварцевой кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют воду.
Параллельно в этих же условиях измеряют оптическую плотность раствора стандартного образца тимофера.
Адрес для корреспонденции: Холназаров Баходур Махмадназарович. 734005, Республика Таджикистан, г.Душанбе, ул. А.Каххарова, 111, ООО «Занд». E-mail: [email protected].
Содержание тимофера в процентах (Х) рассчитывают по формуле:
X = ^-100 ,
А
где Dl - оптическая плотность испытуемого раствора; Б0 - оптическая плотность стандартного раствора.
Содержание тимофера в препарате должно составлять от 90 до 110%.
Приготовление раствора стандартного образца тимофера. 0.0148 г (точная навеска) стандарта тимофера количественно с помощью воды переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объём раствора водой до метки.
Результаты и обсуждение
УФ-спектр тимофера в области 220-350 нм имеет максимум поглощения при 278±2 нм и плечи при 273-275±2 нм и 287-288±2 нм (рис.1).
УФ-спектр тимофера
2 п
1,9 -1,8 1,7 -1,6 -1,5 -„ 1,4 -& 1,3 -§ 1,2 -
° 1,1 -
^ 1 -0,9 -
I 0,8 -
1 0,7 -Ё 0,6 -О 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1
0 И-1-1-1-1-1-1-1-1-1
210 220 230 240 250 260 270 280 290 300
Длина волны, нм
Рис.1. УФ-спектр тимофера.
Первым этапом процедуры валидации является оценка полной неопределённости анализа (ДЛя), которая для уровня доверительной вероятности 95% [4] не должна превышать следующих величин:
М. < Вн ~В - 0.32 = 3.2%
При прогнозе неопределённости спектрофотометрического анализа тимофера использовали коэффициент Гаусса 1.65 для односторонней вероятности 0.95. При проведении количественного определения спектрофотометрическая неопределенность оптической плотности (по паспорту прибора) sA,r = 0.2%, неопределенность кюветы (экспериментально найдена) зсе!!,г = 0.1%. Предполагается, что будет проводиться трёхкратное измерение оптической плотности испытуемого раствора и раствора сравнения с выниманием кюветы.
1. Неопределённость взвешивания для стандартного образца на аналитических весах - не более 0.2 мг (0.0002 г), что составляет 100^0.0002/0.0157 = 1.27% для стандартного образца. - мерная колба вместимостью 100 мл - 0.12% - для стандартного образца. Полная неопределённость пробоподготовки
А™ г = л/1.272 + 0.122 = 1.28%
2. Неопределённость конечной аналитической операции (спектрофотометрии):
А РЛО,я
3. Полная прогнозируемая неопределённость анализа:
А™, =л/1.272 + 0.302 = 1.31%
Таким образом, прогнозируемая неопределённость анализа составляет 1.31%, что меньше максимально допустимой - 3.2%.
Для изучения линейности методики готовили растворы тимофера с концентрациями от 80 до 120% с шагом 5% согласно [4] и измеряли значение оптической плотности. Полученные данные приведены на рис.2.
1,2
л
т с о
к
т
8
п
к с е
тп
1,1
1
0,9
0,8
О 0,7
0,6 1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1
70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130
Концентрация тимофера, % Рис.2. График линейности метода количественного определения тимофера.
Ast = 0.94
Cst = 148 мкг/мл
Методом наименьших квадратов были рассчитаны параметры линейной зависимости У; = bXj + a, где а - свободный член для рассчитанной регрессионной прямой (отрезок, отсекаемый на оси ординат), b - угол наклона для рассчитанной регрессионной прямой: b = 0,00607, а = -0,0172.
В нашем случае AAs = 2.13^0.05 = 0.1065, рассчитанное значение свободного члена |а| = 0.0172, что ниже Аа, следовательно соблюдается критерий статистической незначимости. Критерием приемлемости линейности является коэффициент корреляции, величина которого должна быть не ниже 0.99. Коэффициент корреляции составил 0.999.
Определение сходимости проводили два аналитика в 5пяти повторностях (табл.1). Критерий приемлемости выражается величиной относительного стандартного отклонения, которое не должно превышать 10%. Среднее его значение составило 0.87%, что указывает на прецизионность методики в условиях воспроизводимости.
Таблица 1
Определение сходимости методики
Повторность Образец
№1 №2 №3 №4 №5
D* C** D* C** D* C** D* C** D* C**
1 0.95 146.7 0.947 147.03 0.954 146.7 0.947 149.1 0.951 146.7
2 0.919 147.5 0.929 149.1 0.931 147.9 0.925 146.7 0.937 147.5
3 0.957 148.6 0.951 146.9 0.938 146.9 0.932 148.2 0.922 147.8
4 0.934 146.4 0.942 148.8 0.923 148.8 0.929 147.3 0.918 146.9
5 0.935 148.8 0.921 146.4 0.941 149.1 0.937 147.03 0.924 146.45
6 0.945 148.5 0.94 147.5 0.95 146.6 0.941 146.6 0.94 148.2
7 0.959 147.8 0.949 148.1 0.935 147.03 0.945 146.9 0.939 147.03
8 0.94 147.9 0.945 146.7 0.929 147.5 0.936 147.8 0.927 147.5
9 0.923 148.4 0.921 147.8 0.937 147.3 0.93 148.4 0.942 147.8
10 0.954 146.7 0.956 147.3 0.944 147.03 0.942 147.2 0.936 148.2
Р 147.7 147.6 147.5 147.5 147.4
RSD, % 0.86 0.87 0.87 0.81 0.61
Примечание: анализы осуществлялись двумя аналитиками; Р - среднее значение; Я^Б* - относительное стан-
дартное отклонение; * - значение оптической плотности; ** - концентрация тимофера, мкг/мл.
Правильность методики устанавливали путём измерения количественного содержания тимофера в растворах, полученных добавлением к исследуемому раствору необходимого количества стандарта с концентрациями 20, 40, 50, 60, 80, 100, 110 мкг/мл до получения концентрации 148 мкг/мл. Критерий приемлемости - средний процент восстановления при использовании растворов заданных концентраций, должен находиться в пределах 100±5%.
Данные табл. 2 показывают, что средний процент восстановления находится в пределах от -100.47 до +102.5, среднее его значение составляет 100.64%.
Таблица 2
Определение правильности методики (результаты опытов с добавками)
№ Содержание тимофера, мкг/мл Добавлено тимофера, мкг/мл Ожидаемое содержание, мкг/мл Полученное содержание, мкг/мл Ошибка, %
1 20 128 148 148.7 -0.47
2 40 108 148 148 0
3 50 98 148 145.3 1.82
4 60 88 148 148.3 -0.2
5 80 68 148 144.3 2.5
6 100 48 148 148 0
7 110 38 148 146.8 0.81
Среднее значение 147.06 0.64
Выводы
Методика пригодна для определения количественного содержания тимофера.
Поступило 23.11.2012 г.
ЛИТЕРАТУРА
1. Игнатов П.Е. Иммунитет и инфекция. - М.: Время, 2002, 352 с.
2. Бобиев Г.М. Способ получения иммуностимулирующего препарата тимофер. Патент Республики Таджикистан № ТТ 255, приоритет 28.04.1998.
3. Бобиев Г.М., Хайдаров К.Х., Нораев Р.Х. - Ветеринария, 1999, № 10, с.30-33.
4. Руководство для предприятий фармацевтической промышленности/Методические рекомендации. - М.: «Спорт и культура-2000», 2007, 192 с.
5. Государственная Фармакопея Украины. - Киев, 2010.
Б.М.Холназаров, М.Ш.Наботов, А.Н.Шахматов, Г.М.Бобиев
ВАЛИДААТСИЯИ УСУЛИ СПЕКТРОФОТОМЕТРИИ МУАЙЯНКУНИИ
МИЦДОРИИ ТИМОФЕР
Донишго^и давлатии омузгории Тоцикистон ба номи С.Айни
Натичах,ои валидатсияи усули муайянкунии микдории тимофер тавассути усули спектрофотометрй оварда шудааст. Нишон дода шудаааст, ки усул барои муайянкунии микдории тимофер аз руйи нишондодх,ои хатият, наздикшавандагй ва дурустй кобили кабл аст. Калима^ои калиди: тимофер - усули спектрофотометры- муайянкунии мщдорй - валидатсия.
B.M.Kholnazarov, M.S.Nabotov, A.N.Shakhmatov, G.V.Bobiev THE VALIDATION OF THE SPECTROPHOTOMETRIC METHOD OF DETERMINATION OF QUANTITATIVE CONTENT OF THYMOFER
S.Ainy Tajik State Pedagogical University The results of validation of procedure of determination of quantitative content of thymofer by spec-trophotometric method are given. It is shown that the procedure is suitable for determination of quantitative content of thymofer by parameters: linearity, repeatability and accuracy. Key words: thymopher - spectrophotometric method - quantitative determination - validation.
