Валидация методики определения количественного содержания некоторых аминокислот в лекарственных формах методом ВЭЖХ Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 615.217+577.12.3

© Е.В. Симонян, Ю.В. Шикова, А.А. Хисамова, 2016

Е.В. Симонян1, Ю.В. Шикова2, А.А. Хисамова1 ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО СОДЕРЖАНИЯ НЕКОТОРЫХ АМИНОКИСЛОТ В ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМАХ МЕТОДОМ ВЭЖХ

'ФГБОУ ВО «Южно-Уральский государственный медицинский университет»

Минздрава России, г. Челябинск 2ФГБОУ ВО «Башкирский государственный медицинский университет»

Минздрава России, г. Уфа

Предложена методика количественного определения некоторых аминокислот при совместном присутствии, а также в сочетании с природными биологически активными компонентами методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в обращенно-фазовом варианте с УФ-детектированием. Методика проведения основана на предварительной дериватизации аминокислот фенилизотиацианатом. Установлено, что определение содержания кислоты глутаминовой в присутствии экстракта прополиса можно проводить в изократическом режиме, а в смеси с аспарагиновой кислотой - в градиентном режиме. В качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрила и аммония ацетата. Длина волны детектирования составляла 254 нм. Методика апробирована на суппозиториях с кислотой глутаминовой в присутствии экстракта прополиса и суппозиториях, содержащих глутаминовую и аспарагиновую кислоты. Была проведена валидационная оценка методики. Установлено, что относительная погрешность определения не превышает 0,3% для кислоты глутаминовой и 0,8% - для кислоты аспарагиновой. Определены воспроизводимость, правильность, процент восстановления, прецизионность и сходимость методики.

Ключевые слова: кислота глутаминовая, кислота аспарагиновая, высокоэффективная жидкостная хроматография, де-риватизация.

E.V. Simonyan, Yu.V. Shikova, A.A. Khisamova VALIDATION OF ASSAY METHOD FOR CERTAIN AMINO ACIDS IN DOSAGE FORMS BY HPLC METHOD

The paper proposes a method for assay determination of some amino acids in the joint presence of and in combination with natural bioactive components by high performance liquid chromatography (HPLC) in the reversed - phase variant with UV detection. The methodology is based on pre-derivatization of amino acids by phenylisothiocyanate. It is established that the determination of quantity of glutamic acid in the presence of the propolis extract can be carried out in isocratic mode, and in a mixture with aspartic acid - in a gradient mode. As the mobile phase a mixture of acetonitrile and ammonium acetate was used. The wavelength of detection was 254 nm. The method was tested on suppositories with glutamic acid in the presence of the propolis extract and aspartic acid. The method was assessed by validation technique. It is established that the relative error of determination does not exceed 0.3% for glutamic acid and not more than 0.8% for aspartic acid. Reproducibility, accuracy, recovery percentage, precision and convergence of the method have been determined.

Key words: glutamic acid, aspartic acid, high performance liquid chromatography, derivatization.

Для определения аминокислот (за исключением триптофана) в комбинированных лекарственных препаратах перспективным является метод обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с предварительной дериватизацией органическими реагентами [1]. Для дериватизации используют дансилхлорид, фенилизо-тиацианат и другие реактивы. Образующиеся производные аминокислот чрезвычайно устойчивы и могут быть разделены методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с хорошей селективностью и эффективностью.

Целью данного исследования было изучение возможности использования ВЭЖХ для количественного определения кислоты глута-миновой в суппозиториях в присутствии экстракта прополиса и в суппозиториях в присутствии кислоты аспарагиновой. Материал и методы В качестве объектов исследования были взяты суппозитории, содержащие кислоту глу-таминовую и экстракт прополиса (состав 1), и

суппозитории, содержащие глутаминовую и аспарагиновую кислоты (состав 2) [2].

Определение количественного содержания проводили после предварительной де-риватизации аминокислот фенилизотиациана-том, методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке с обращенной фазой и с УФ-детектированием фенилтиокар-бамаильных производных аминокислот (ФТК-АК) при длине волны 254 нм.

За основу была взята методика определения аминокислот с помощью ВЭЖХ, предложенная Лимнологическим институтом Сибирского отделения Российской академии наук [1]. При этом нашей задачей было не только апробировать ее на примере кислоты глутаминовой, но и адаптировать для анализа при совместном присутствии кислоты аспара-гиновой и других биологически активных соединений. Известно, что и глутаминовая, и аспарагиновая кислота отличаются сродством к гидрофильным элюентам и их рассчитанные коэффициенты гидрофобности составляют -

1,92 и -2,92 соответственно. Учитывая выраженный амфотерный характер соединений с преобладанием кислотных свойств и с целью предотвращения образования цвиттер-ионов, в качестве основного компонента подвижной фазы (ПФ) использовали раствор аммония ацетата.

Методика проведения испытания. Микрошприцем помещали 10 мкл исследуемого раствора в полипропиленовую пробирку объемом 1,5 мл и упаривали досуха в вакууме при температуре 25°С (водяная баня термостата). Микрошприцем добавляли в пробирку 30 мкл раствора №5 и упаривали досуха в вакууме при температуре 25°С. В ту же пробирку добавляли 20 мкл раствора №5, 2 мкл фе-нилизотиоцианата (ФИТЦ), перемешивали и выдерживали 20 мин при температуре 25°С. Для удаления из реакционной смеси растворителей и остатков ФИТЦ пробирку выдерживали 20 мин в вакууме при температуре 25°С. Растворяли сухой остаток в 125 мкл раствора №6, перемешивали. Режим хромато-графирования: длина волны детектирования -254 нм, скорость подачи элюента - 200 мкл/мин; градиент А/Б (96:4) - за 3,5 минуты; А/Б (90:10) - за 12 минут.

Раствор № 1. 1 М водный раствор аммония ацетата - элюент «А». Раствор № 2. 50 мл раствора № 1 переносили в мерную колбу вместимостью 1 л и доводили объем жидкости бидистиллированной водой до метки.

Раствор № 3. Ацетонитрил - элюент «Б».

Раствор № 4. 5 мл ацетонитрила, 2 мл триэтиламина и 3 мл бидистиллированной воды помещали в плотно закрывающуюся

Определение правильности методики проводили в модельных системах с концентрациями 70, 100 и 130% кислоты глутамино-вой и кислоты аспарагиновой. Результаты представлены в табл. 2.

Установлено, что процент восстановления для кислоты глутаминовой выше в составе 1 (с экстрактом прополиса) - 99,53%. В комбинированных суппозиториях данный показатель для кислот глутаминовой и аспара-гиновой составил 98,74 и 98,02 % соответ-

колбу и тщательно перемешивали. Раствор использовали для проведения дериватизации.

Раствор № 5. 1 мл ацетонитрила и 9 мл раствора № 2 помещали в плотно закрывающуюся колбу и тщательно перемешивали. Раствор использовали для перерастворения дериватов.

Раствор № 6. 0,1 М раствор кислоты хлороводородной для приготовления растворов РСО кислоты аминоянтарной и кислоты глутаминовой.

Приготовление раствора РСО кислоты аминоянтарной: около 0,05 г (точная навеска) кислоты аминоянтарной помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл и растворяли при перемешивании в растворе № 6. Фильтровали.

Приготовление раствора РСО кислоты глутаминовой: около 1,0 г (точная навеска) кислоты глутаминовой помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл и растворяли при перемешивании в растворе № 6. Фильтровали.

Приготовление раствора испытуемого образца суппозитория: около 3,0 г (точная навеска) суппозиторной массы помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляли около 50 мл раствора № 6 и взбалтывали в течение 20 мин. Доводили объем этим же раствором до метки, перемешивали и фильтровали, отбрасывая первые порции фильтрата.

Все образцы подвергались повторной фильтрации через фторопластовый фильтр с размером пор 0,45 мкм.

Результаты и обсуждение

Полученные данные количественного содержания аминокислот в исследуемых образцах представлены в табл. 1.

1

ственно, что также укладывается в диапазон отклонений 100±5%.

Результаты установления достоверности исследуемой методики представлены в табл. 3.

Прецизионность и сходимость методики оценивали по результатам анализа пробы в шести повторностях. Анализы проводил один и тот же специалист в разные дни. Относительное стандартное отклонение не превысило 15 %, а экспериментальное значение критерия Стьюдента было меньше табличного.

Таблица

Результаты количественного определения кислоты глутаминовой в суппозиториях методом ВЭЖХ

Состав 1 Состав 2

Найдено кислоты Валидационная Найдено кислоты Валидационная Найдено кислоты Валидационная

глутаминовои, г оценка глутаминовой, г оценка аспарагпновой, г оценка

0,9969 0,9971 0,0483

0,9912 = 2,24*10-3 0,9964 = 1,25* 10-3 0,0491 = 3,49* 10-4

0,9920 = 0,91 *10-3 0,9936 = 0,51*10-3 0,0490 ИЗБ = 1,43*10-4

0,9926 АХ = 2,36*10-3 0,9948 АХ = 1,31*10-3 0,0486 АХ = 3,66*10-4

0,9948 е = 0,23% 0,9955 е = 0,13% 0,0483 е = 0,75%

0,9914 0,9960 0,0489

Таблица 2

Результаты количественного анализа суппозиториев с различным содержанием кислоты глутаминовой и кислоты аспарагиновой

Проба Значение измеряемой величины в модельной смеси, г Значение, найденное экспериментально

абсолютная величина, г | процент восстановления

Содержание кислоты глутаминовой в составе 1, г

1.1 0,7000 0,6965 99,50

1.2 0,7000 0,6971 99,59

1.3 0,7000 0,6944 99,20

1.4 1,0000 0,9976 99,76

1.5 1,0000 0,9981 99,81

1.6 1,0000 0,9968 99,68

1.7 1,3000 1,2881 99,08

1.8 1,3000 1,2932 99,48

1.9 1,3000 1,2954 99,65

Средний процент восстановления 99,53

Содержание кислоты глутаминовой в составе 2, г

2.1 0,7000 0,6909 98,70

2.2 0,7000 0,6877 98,24

2.3 0,7000 0,6852 97,89

2.4 1,0000 0,9897 98,97

2.5 1,0000 0,9923 99,23

2.6 1,0000 0,9943 99,43

2.7 1,3000 1,2876 99,05

2.8 1,3000 1,2856 98,89

2.9 1,3000 1,2778 98,29

Средний процент восстановления 98,74

Содержание кислоты аспарагиновой в составе 2, г

3.1 0,0350 0,03412 97,49

3.2 0,0350 0,03409 97,40

3.3 0,0350 0,03421 97,74

3.4 0,0500 0,04861 97,22

3.5 0,0500 0,04876 97,52

3.6 0,0500 0,04901 98,02

3.7 0,0650 0,06445 99,15

3.8 0,0650 0,06452 99,26

3.9 0,0650 0,06396 98,40

Средний процент восстановления 98,02

Таблица 3

Результаты количественного определения кислоты глутаминовой в модельных смесях методом добавок_

Содержание действую- Добавлено РСО Содержание определяемого веще- Ошибка

щего вещества в лекар- определяемого ства, г

ственной форме, г вещества, г расчетное, г найденное, г абсолютная, % относительная, %

Содержание кислоты глутаминовой в составе 1, г

0,9932 0,0100 1,0032 0,9984 -0,0048 0,48%

0,9932 0,0200 1,0132 1,0098 -0,0034 0,34%

0,9932 0,0300 1,0232 1,0195 -0,0037 0,36%

0,9932 0,0400 1,0332 1,0292 -0,0040 0,39%

0,9932 0,0500 1,0432 1,0386 -0,0046 0,44%

Содержание кислоты глутаминовой в составе 2, г

0,9956 0,0100 1,0056 0,9989 -0,0067 0,67%

0,9956 0,0200 1,0156 1,0094 -0,0062 0,61%

0,9956 0,0300 1,0256 1,0204 -0,0052 0,51%

0,9956 0,0400 1,0356 1,0301 -0,0055 0,53%

0,9956 0,0500 1,0456 1,0408 -0,0048 0,46%

Содержание кислоты аспарагиновой в составе 2, г

0,0487 0,0100 0,0587 0,0563 -0,0024 4,09%

0,0487 0,0200 0,0687 0,0670 -0,0017 2,47%

0,0487 0,0300 0,0787 0,0768 -0,0019 2,47%

0,0487 0,0400 0,0887 0,0862 -0,0025 2,82%

0,0487 0,0500 0,0987 0,0965 -0,0022 2,22%

Заключение

Апробирована и адаптирована методика количественного определения глутаминовой кислоты при совместном присутствии кислоты аспарагиновой методом обращенно-

фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией с предварительной деривати-зацией органическими реагентами. Определены некоторые валидационные характеристики методики.

Сведения об авторах статьи: Симонян Елена Владимировна - к.фарм.н., доцент, зав. кафедрой фармации и химии фармацевтического факультета ФГБОУ ВО ЮУГМУ Минздрава России. Адрес. 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64. E-mail: [email protected]. Шикова Юлия Витальевна - д.фарм.н., доцент, зав. кафедрой фармацевтической технологии с курсом биотехнологии ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России. Адрес: 450008, г. Уфа, ул. Ленина, 3. E-mail: [email protected].

Хисамова Анна Александровна - соискатель кафедры фармации и химии фармацевтического факультета ФГБОУ ВО ЮУГМУ Минздрава России. Адрес. 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64. E-mail: [email protected].

ЛИТЕРАТУРА

1. Руденко, А.О. Определение важнейших аминокислот в сложных объектах биологического происхождения методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с получением фенилтиогидантоинов аминокислот / А.О. Руденко, Л.А. Карцова // Сорбционные и хроматогра-фические процессы. - 2010. - Т. 10, № 2. - С. 223-230.

2. Средство с глютаминовой кислотой и экстрактом прополиса, обладающее ноотропной активностью / Ю.В. Шикова [и др.] // Патент на изобретение RUS 2538636 21.06.2013.

УДК 615.453.6:615.256.55 © Коллектив авторов, 2016

А.Г. Ялкаев, Ф.Х. Кильдияров, В. А. Катаев, А. А. Федотова, Г.В. Аюпова ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КОМБИНАЦИЙ ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ В ТЕХНОЛОГИИ ТВЕРДОЙ ДОЗИРОВАННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ 11-ДЕЗОКСИМИЗОПРОСТОЛА

ФГБОУ ВО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Уфа

Для медикаментозного прерывания беременности в Российской Федерации используется комбинация таблеток мизо-простола 200 мкг (синтетический аналог простагландина E1) и 600 мг мифепристона (антигестагенный стероид). В зависимости от срока беременности используют разные режимы дозирования. На базе Уфимского института химии РАН синтезирован аналог простагландина E1 - 11-дезоксимизопростол (11-ДМП), который имеет более высокие утеротонические свойства, чем мизопростол.

Цель данной работы - разработка таблетированной лекарственной формы 11-ДМП. Для подбора эксципиентов исследовали 10 различных комбинаций 11-ДМП со вспомогательными веществами. После гранулирования и опудривания у таблеточных масс определяли сыпучесть, индекс Хауснера и коэффициент прессуемости. Шесть составов, имеющих оптимальные технологические показатели, использовали для таблетирования. У полученных таблеток изучили время распадае-мости, прочность на раздавливание и истираемость. По результатам эксперимента был отобран один состав.

Ключевые слова: 11-дезоксимизопростол, таблетки, композиция таблетки, сыпучесть, коэффициент прессуемости, влажное гранулирование, таблетирование.

A.G. Yalkaev, F.Kh. Kildiyarov, V.A. Kataev, A.A. Fedotova, G.V. Ayupova A PILOT STUDY OF COMBINATIONS OF EXCIPIENTS IN THE TECHNOLOGY OF SOLID DOSAGE FORMS OF 11-DESOXIMETASONE

In the Russian Federation a combination of 200 mcg of misoprostol (synthetic analogue of prostaglandin E1) and 600 mg of mifepristone (antigestagen steroid) is used for medical termination of pregnancy. Different dosing regimens depending on the gestational age are used. In Ufa Institute of Chemistry of Russian Academy of Sciences analogue of prostaglandin E1 was synthesized, posessing better uterotonic properties than misoprostol. It is named 11-desoxymisoprostol (11-DMP).

The purpose of this work is pharmaceutical development of 11-DMP formulation. In the study wet granulation method was used. 10 different drug compositions were investigated to select excipients. After granulation and lubrication tablet mass were studied for flow character, compressibility index and Hausner ratio. 6 formulations with optimal technological parameters were used for tableting. We have studied disintegration time, the hardness and tablet friability in the obtained tablets. One composition was selected according to the results of the experiment.

Key words: 11-desoxymisoprostol, tablets, drug composition, flow character, compressibility index, wet granulation, tabletting.

Прерывание беременности с минимальными осложнениями является актуальной проблемой в современном мире. Медикаментозный аборт, который можно использовать для решения этой задачи, более безопасен, чем хирургический, так как последний может вызвать воспалительные процессы, привести к механическим травмам и бесплодию. В Российской Федерации для медикаментозного аборта используется комбинация таблеток мизопростола 200 мкг (синтетический аналог простагландина Е^ и 600 мг мифепристона (антигестагенный стероид). В зависимости от срока беременности используют разные режимы дозирования [1]. За рубежом согласно рекомендациям ВОЗ мизо-простол используется для индукции родов в

дозе 25 мкг каждые 2 часа [6]. Для мизопро-стола характерны следующие побочные эффекты: диарея, метеоризм, тошнота, головная боль, метроррагия. Кроме того, он является относительно дорогостоящим препаратом, так как его получают в результате сложного химического синтеза.

В Уфимском институте химии РАН (УфИХ РАН) под руководством д.х.н. Мифта-хова М.С. в результате направленного поиска утеротоников среди 11 -дезоксипростагланди-нов Е- и F-групп был обнаружен перспективный аналог простагландина Е1 с более высокой утеротонической активностью, чем у ми-зопростола [2; 5]. Это 2-дезметоксикарбонил-2-этоксикарбонил-11-дезоксимизопростол или 11-дезоксимизопростол (11-ДМП) (рисунок).