ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИНОВ ГРУППЫ ОКАДАЙКОВОЙ КИСЛОТЫ И АЗАСПИРАЦИДОВ В МОЛЛЮСКАХ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ ─ ТАНДЕМНОЙ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ Текст научной статьи по специальности «Химические технологии»

УДК 543.(544+51)

Бревнова Б.О., Комарицких М.Ю., Захарычев В.В.

ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИНОВ ГРУППЫ ОКАДАЙКОВОЙ КИСЛОТЫ И АЗАСПИРАЦИДОВ В МОЛЛЮСКАХ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ -ТАНДЕМНОЙ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ

Бревнова Бажена Олеговна, студентка 5 курса факультета химико-фармацевтических технологий и биомедицинских препаратов, e-mail: starodubczewa.ej@yandex.ru;

Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125047, Москва, Миусская пл., д. 9

Комарицких Михаил Юрьевич, токсиколог, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный центр безопасности продукции водного промысла и аквакультуры», Москва, Россия Захарычев Владимир Владимирович, к.х.н., доцент кафедры химии и технологии органического синтеза, Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия

Проведена валидация методики определения окадайковой кислоты, динофизистоксинов, пектенотоксинов и азаспирацидов в моллюсках методом ВЭЖХ-МС/МС в соответствии с критериями Решения Комиссии 657/2002/ЕС. Проведены исследования специфичности, линейности, воспроизводимости, правильности, прецизионности, повторяемости, найдены значения предела решения, способности обнаружения и расширенной неопределенности.

Ключевые слова: биотоксины, окадайковая кислота, динофизистоксины, пектенотоксины, азаспирациды, валидация, высокоэффективная жидкостная хроматография, масс-спектрометрия.

VALIDATION OF THE QUANTITATIVE HIGH-PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY—TANDEM MASS SPECTROMETRY METHOD FOR OKADAIC ACID GROUP TOXINS AND AZASPIRACIDS DETERMINATION IN MOLLUSCS

Brevnova B.O., Komaritskikh M.Yu.*, Zakharychev V.V.

D.Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia

Federal State Budgetary Establishment «National Centre for Safety of Aquatic Fisheries Products and Aquaculture», Moscow, Russia

The quantitative HPLC-MS/MS method for okadaic acid, dinophysis toxins, pectenotoxins, and azaspiracids determination in molluscs was validated using the Commission Decision 657/2002/EC as guideline. Specificity, linearity, reproducibility, trueness, precision, repeatability, decision limits, detection capabilities, and expanded uncertainties in measurements were estimated.

Key words: biotoxins, okadaic acid, dinophysis toxins, pectenotoxins, azaspiracids, validation, high-performance liquid chromatography, mass spectrometry.

Введение

Морские биотоксины продуцируются определенными видами микроводорослей, таких как Dinophysis acuta, Protoceratium reticulatum и Alexandrium ostenfeldii. Фильтрующие моллюски -мидии, устрицы, гребешки, питающиеся этими водорослями, могут быть контаминированы различными видами морских биотоксинов. Среди них токсины группы окадайковой кислоты (сама окадайковая кислота (ОА), динофизистоксины (DTX) и пектенотоксины (РТХ)) и азаспирациды (AZA) вызывают у гурманов желудочно-кишечные расстройства [1].

В России отсутствуют подтверждающие методы анализа токсинов этих групп, что сильно затрудняет подготовку сопроводительной документации для

экспорта двустворчатых моллюсков в страны Евросоюза.

В настоящей работе проведена валидация методики одновременного определения ОА, DTX, PTX и AZA в тканях моллюсков в соответствии с рекомендациями Решения Комиссии 657/2002/ЕС [2].

Экспериментальная часть

Взвешивали 1,00 г измельченного мяса моллюсков в центрифужную пробирку. При проведении валидационных исследований перед экстракцией к навеске добавляли 1 мл одного из стандартных растворов смеси 3-х токсинов в метаноле (с концентрациями 80, 160, 240 нг/мл ОА, РТХ2 и AZA1) и тщательно перемешивали. Добавляли 4,5 мл метанола, гомогенизировали на вортексе в течение 3 мин, центрифугировали 10 мин при 20°С при 4000 об./мин. Надосадочную жидкость

переносили в колбу на 10 мл, экстракцию повторяли, экстракты объединяли, объем вытяжек доводили до 10 мл метанолом. Полученный экстракт фильтровали через мембранный ПТФЭ фильтр с размером пор 0,45 мкм и вводили в хроматографическую систему.

Исследование проводили с помощью жидкостного хромато-масс спектрометра с тройным квадруполем Bruker EVOQ Qube. Для хроматографического разделения использовали колонку с обращенно-фазовым сорбентом Acclaim 120 C18 50^2,1 мм, 3 мкм и градиентное элюирование. Фаза А представляет собой 5 мМ формиата аммония и 13,3 мМ муравьиной кислоты в

СНз

В

воде, фаза В — 90% ацетонитрила, 10% метанола с 5 мМ формиата аммония и 13,3 мМ муравьиной кислоты; режим элюирования: 0 мин 10% фазы В, 4—6 мин 80% фазы В, 6,5—9 мин 10% фазы В; температура колонки 40°С, объем вводимой пробы 20 мкл, объемная скорость потока подвижной фазы 0,3 мл/мин.

Детектирование проводили в условиях положительной ионизации электроспреем при напряжении на капилляре 4000 В; температура конуса 200°С, температура нагревателя осушающего газа — 300°С. Энергию соударений оптимизировали для каждого токсина (табл.1).

R1 = СН3, R2 = Н (OA) R1 = R2 = СН3 (DTX1) R1 = Н, R2 = СН3 (DTX2)

Н3С

R = СН2ОН (PTX1) R = СН3 (PTX2)

R1 = Н, R2 = СН3 (AZA1) СН3 Н R1 = R2 = СН3 (AZA2) R1 = R2 = Н (AZA3)

'" СН3

Таблица 1. Фрагментация: ионы-предшественники (01), дочерние ионы (03), энергия соударений (СЕ), линейность калибровочных зависимостей (Я2), относительные интенсивности сигналов(/), времена удерживания (т) биотоксинов.

Токсин Q1 (m/z) Q3 (m/z) CE (В) R2 I (%) т (мин)

OA 822,5 733,5 20 0,995 100 4.51

822,5 267,1 30 44

DTX1 836,5 747,2 20 0,998 100 5.18

836,5 823,2 30 25

DTX2 822,5 733,5 20 0,995 100 4.70

822,5 267,1 30 25

PTX2 876,6 823,0 20 0,997 100 4.81

876,6 805,0 20 55

AZA1 842,5 824,5 30 0,991 100 5.33

842,5 806,5 40 15

AZA2 856,5 838,5 30 0,997 100 5.53

856,5 820,5 40 15

AZA3 828,5 810,5 30 0,997 100 4.92

828,5 792,5 40 15

Обсуждение результатов

В соответствии с Решением Комиссии 657/2002/ЕС [2] для ОА, РТХ2 и Л2Л1 проведены исследования специфичности, линейности, воспроизводимости, правильности, прецизионности, повторяемости (г) (табл. 2). Правильность должна укладываться в пределы от 80 до 110 %, воспроизводимость не должна превышать значения, рассчитанного по уравнению Хорвитца [2] (21 % для 160 мкг/кг).

Для определения специфичности исследовалось 20 холостых проб моллюсков. На хроматограммах отсутствовали пики, интерферирующие с пиками аналитов.

Линейность калибровочной зависимости определяли, строя график зависимости для 6-ти уровней калибровки, измеряя площади пиков аналитов на хроматограммах матричных градуировочных растворов с концентрациями 2, 4, 8, 16, 24, 32 мкг/мл ОА, РТХ2 и AZA1, что соответствует содержанию аналитов в матрице 0,125, 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2 максимально допустимых уровня. Все зависимости в исследованных диапазонах были линейными с коэффициентами корреляции (Л2) от 0,991 до 0,998.

Были рассчитаны значения предела решения ССа (табл. 2) для вероятности ошибки а = 5% по ГОСТ Р ИСО 11843-2-2007 [3] по уравнению 1:

CCa = MRL + U

SE (y)

m

1

— + — +

K IJ (1)

1 MRL2

dx

где МИ! - максимально допустимый уровень; и( - одностороннее обратное ¿-распределение Стьюдента для ошибки а или в;

SE(у) - стандартная ошибка для у (у - отклик); т - наклон линии регрессии;

К - число вколов на образец (К=1); I - количество уровней калибровки (1=3);

3 - количество образцов на уровень (3=18); ^ - квадрат разности между уровнем добавки и средним значением х (х - уровень добавки).

Рассчитаны значения способности обнаружения ССв (табл. 2) для вероятности ошибки в = 5% по ГОСТ Р ИСО 11843-2-2007 [3] по уравнению 2:

CCP = MRL + (Ute + Uta) ^,

m \

1 1 MRL2 — + — + -

K IJ (2)

dx

Были рассчитаны значения расширенной неопределенности для концентраций,

соответствующих максимальному допустимому уровню в соответствии с ГОСТ Р 54500.3—2011 [4].

Таблица 2. Суммарные значения восстановления стандартных отклонений ($В), коэффициентов вариации (СУ), повторяемости, предела решения ССа и способности обнаружения ССр, расширенных неопределенностей измерений (V)

для ОА, РТХ2 и AZA1 из моллюсков с добавкой аналитов (п = 18)

Токсин Уровень R (%) SD (%) CV (%) r ССа ССр U

добавки (%) (мкг/кг) (мкг/кг) (%)

(мкг/кг)

80 108 9.7 8.5 8.1

ОА 160 102 6.5 6.3 6.0 178 196 10

240 102 5.9 5.7 5.5

80 108 7.2 6.7 6.3

РТХ2 160 105 5.1 4.9 3.6 183 206 20

240 97 7.4 7.7 6.0

80 104 8.7 8.4 8.1

AZA1 160 100 5.2 5.2 5.2 176 191 20

240 100 4.5 4.5 4.4

Заключение

Проведены валидационные исследования методики определения биотоксинов. По результатам проведенного исследования полученные

валидационные параметры соответствуют критериям, установленным Решением Комиссии 657/2002/ЕС, следовательно предлагаемый метод пригоден для количественного определения биотоксинов в мышечной ткани моллюсков.

Список литературы 1. Detection methods for okadaic acid and analogues / James K.J. [et al.] // In: Seafood and freshwater toxins /

Ed. L.M.Botana. New York, Basel: Marcel Dekker Inc., 2000. P. 217—238.

2. Comission Decision 657/2002/EC of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and interpretation of results.

3. ГОСТ Р ИСО 11843-2-2007. Статистические методы. Способность обнаружения. Часть 2. Методология в случае линейной калибровки.

4. ГОСТ Р 54500.3—2011 / Руководство ИСО/МЭК 98-3:2008. Неопределенность измерения — Часть 3. Руководство по выражению неопределнности измерения.