CC BY
72
Химия растительного сырья. 2012. №3. С. 157-161.
УДК 543.062:547.586.5:615.322:633.884
ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГИДРОКСИКОРИЧНЫХ КИСЛОТ В ЖЕЛЧЕГОННОМ СБОРЕ №2
© Я.И. Абрамова, B.C. Чучалин, Г.И. Калинкина', Н.Э. Коломиец
Сибирский государственный медицинский университет, Московский тракт,
2/7, Томск, 634050 (Россия), e-mail: [email protected]
Представлены результаты валидации методики количественного определения гидроксикоричных кислот в офи-цинальном желчегонном сборе №2 (ЖС-2). Установлено, что предлагаемая методика прямого спектрофотометрического определения гидроксикоричных кислот в ЖС-2 является точной, правильной, воспроизводимой и линейной.
Ключевые слова: валидация, желчегонный сбор, гидроксикоричные кислоты, точность, воспроизводимость, линейность.
Как уже сообщалось нами ранее, стандартизацию официнального желчегонного сбора №2 (ЖС-2) предложено проводить по содержанию гидроксикоричных кислот (ГКК) в перечете на хлорогеновую кислоту (ХГК) методом прямой спектрофотометрии. Метрологическая оценка предложенной методики пока -зала, что относительная ошибка методики с доверительной вероятностью 95% не превышает ±5%, т.е. находится в пределах случайной ошибки разработанной методики. Однако для того, чтобы предлагаемая аналитическая методика заняла достойное место в системе обеспечения качества, т.е. гарантировала достоверные и точные результаты анализа, дополнительно была проведена процедура ее валидации (аттестации). С практической точки зрения при проведении валидации в процессе разработки новых методик можно своевременно выявить их недостатки и на ранних стадиях существенно улучшить методику. Практика валидационных экспериментов дает понимание сути методики и осознание необходимости строгого соблюдения ее параметров. В результате при последующей эксплуатации валидированной методики значительно снижается вероятность ошибок.
В связи с этим целью данной работы явилось изучение степени пригодности предлагаемой методики для оценки качества ЖС-2 по показателю «содержание гидроксикоричных кислот», была проведена ее валидация по следующим характеристикам: прецизионность (повторяемость или сходимость) и воспроизводимость (лабораторная и межлабораторная), правильность и линейность.
Введение
Абрамова Яна Ильинична - аспирант кафедры фармацевтической технологии, e-mail: [email protected] Чучалин Владимир Сергеевич - заведующий кафедрой фармацевтической технологии, доктор фармацевтических наук, e-mail: [email protected] Калинкина Галина Ильинична - профессор кафедры фармакогнозии с курсами ботаники и экологии, доктор фармацевтическихнаук, тел.: (3822) 72-33-02, e-mail: [email protected] Коломиец Наталья Эдуардовна - ассистент кафедры фармакогнозии с курсами ботаники и экологии, кандидат фармацевтических наук, тел.: (3822) 72-33-02, e-mail: [email protected]
Экспериментальная часть
Объектами исследования являлись образцы ЖС-2, приготовленные из серийных образцов официнального лекарственного растительного сырья. Сборы готовили в соответствии с требованиями статьи «Сборы» ГФ XI. Образцы сборов упаковывали и хранили в соответствии с требованиями нормативной документации (ОСТ 43-3-84, ГОСТ 17768-90 и ГФ XI). Отбор проб для анализа, изучение характеристик подлинности и показателей качества осуществляли, руководствуясь общими статьями ГФ XI.
* Автор, с которым следует вести переписку.
Для количественного определения ГКК в образцах сбора ЖС-2 нами использован метод прямого спектрофотометрического определения. Содержание ГКК в пересчете на хлорогеновую кислоту в образцах ЖС-2 составило 1,156±0,026% (принятое опорное значение).
Методика количественного определения гидроксикоричных кислот в желчегонном сборе №2. Около 2,0 г (точная навеска) сбора помещают в колбу со шлифом вместимостью 250 мл, прибавляют 50 мл 60% спирта этилового. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 мин. Горячее извлечение фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл. Экстракцию указанным выше способом повторяют еще раз. Извлечение фильтруют через тот же фильтр в ту же мерную колбу и после охлаждения доводят объем до метки 60% этанолом и перемешивают (раствор А).
1 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора 95% спиртом этиловым до метки, перемешивают (раствор Б). Оптическую плотность раствора Б измеряют на спектрофотометре СФ-2000 при длине волны 327 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют 95% раствор спирта этилового.
Содержание суммы гидроксикоричных кислот в пересчете на хлорогеновую кислоту и абсолютно сухую массу сбора в процентах (Z) вычисляют по формуле:
D х V 1 х V 3 х 100
1 % , m х Е х V 2 х (100 - W )
где D - оптическая плотность испытуемого раствора; А^%% = 531 - удельный показатель поглощения РСО хлорогеновой кислоты при 327 нм; m - масса сбора, г; V - объем раствора А, мл; V2 - аликвота раствора А, мл; V3 - объем раствора Б, мл; W - потеря в массе при высушивании сбора, %.
Валидация методики проведена по повторяемости (сходимости), воспроизводимости (внутрилабора-торная и межлабораторная) и линейности [1-5]. Статистическую обработку результатов выполняли с помощью пакета прикладных программ «Statistica for Windows 8.0».
Обсуждениерезультатов
Повторяемость (сходимость) методики определяли в условиях, при которых шесть независимых результатов измерений получали одним и тем же методом в одной и той же лаборатории одним и тем же оператором с использованием одного и того же оборудования в пределах короткого промежутка времени. Результаты, полученные при статистической обработке, достоверны при доверительной вероятности 95%, вычисленные значения RSD - 2,10% и относительного доверительного интервала среднего значения -2,21% не превышают критериев приемлемости - 5%, что свидетельствует о прецизионности методики в условиях повторяемости (табл. 1).
Воспроизводимость методики определяли на идентичных образцах ЖС-2 совместным оценочным экспериментом в трех различных лабораториях СибГМУ на различных приборах разными операторами по три испытания образца на трех разных уровнях (концентрациях) в интервале 80-120% от принятого опорного значения. Пробоподготовку раствора А и расчет содержания ГКК проводили в соответствии с методикой. Раствор Б (V2) готовили путем увеличения аликвоты раствора А по следующей схеме:
- 1-й уровень: аликвота раствора А 2,0 мл - объем раствора Б 25,0 (80%)
- 2-й уровень: аликвота раствора А 2,5 мл - объем раствора Б 25,0 (100%)
- 3-й уровень: аликвота раствора А 3,0 мл - объем раствора Б 25,0 (120%)
Статистическое тестирование выбросов проводили с помощью критерия Кохрена, дисперсии и стандартные отклонения (повторяемости, межлабораторной воспроизводимости) для каждого уровня рассчитывали по ГОСТ Р ИСО 5725-2-2002 [5]. При рассмотрении данных, не обнаружив какой-либо зависимости, в качестве показателей прецизионности нами выбраны средние значения стандартных отклонений. Данные значения могут быть применены в диапазоне содержания ГКК от 0,023 до 0,042 по массе. Меры прецизионности для данного метода измерений не превышают критериев приемлемости как для внутрила-бораторной прецизионности 1,86%< 10%, так и для межлабораторной прецизионности 4,06% < 15%, что указывает на удовлетворительную воспроизводимость методики (табл. 2).
Таблица 1. Результаты оценки повторяемости методики
№ опыта 1 2 3 4 5 6
Оптическая плотность, Б 0,620 0,624 0,600 0,627 0,596 0,617
Содержание ГКК в пересчете на хлорогеновую кислоту, % 1,17 1,18 1,13 1,18 1,12 1,16
Метрологические характеристики
хср Б1 Б Бх Бг,% Р (%) t (Р,0 ДхСр 8,%
1,156 0,0006 0,024 0,01 2,1 95 2,57 0,026 2,21
Таблица 2. Результаты оценки воспроизводимости методики
Лаборатория №1 №2 №3
Уровни 1 2 3 1 2 3 1 2 3
Объем аликвоты раствора А, мл 2,0 2,5 3,0 2,0 2,5 3,0 2,0 2,5 3,0
Оптическая плотность Б1 0,616 0,776 0,919 0,536 0,708 0,834 0,498 0,606 0,747
Оптическая плотность Б2 0,638 0,769 0,884 0,547 0,727 0,849 0,506 0,620 0,760
Оптическая плотность Б3 0,627 0,752 0,909 0,534 0,698 0,817 0,486 0,598 0,732
Содержание ГКК, Хср 0,030 0,036 0,042 0,025 0,034 0,039 0,023 0,029 0,035
Метрологические характеристики
№ лаборатории Хср БІ Б Бх Б г, % Р, % t (Р, 9* Ах 8, %
1 0,03 2,68Е-07 0,0005 0,00030 1,73 95 4,3 0,001 4,3
1 0,04 3,38Е-07 0,0006 0,00034 1,61 95 4,3 0,001 4,0
1 0,04 7,20Е-07 0,0009 0,00049 1,98 95 4,3 0,002 4,9
2 0,03 1,09Е-07 0,0003 0,00019 1,32 95 4,3 8Е-04 3,3
2 0,03 4,81Е-07 0,0007 0,00040 2,09 95 4,3 0,002 5,0
2 0,04 5,68Е-07 0,0008 0,00044 1,92 95 4,3 0,002 4,8
3 0,02 2,25Е-07 0,0005 0,00027 2,04 95 4,3 0,001 5,0
3 0,03 2,75Е-07 0,0005 0,00030 1,79 95 4,3 0,001 4,5
3 0,04 4,35Е-07 0,0007 0,00038 1,89 95 4,3 0,002 4,7
Результаты оценки воспроизводимости методики
Уровень Р т С Бг по уровню Бя по уровню Бг метода Бк метода Бг %, метода Бк %, метода
1 3 0,026 0,446 0,00045 0,00081
2 3 0,033 0,440 0,0006 0,00144 0,0006 0,0013 1,84 4,06
3 3 0,039 0,418 0,00076 0,00173
Примечание: Хср - среднее выборки; Б - дисперсия; Б - стандартное отклонение; Бх - стандартное отклонение среднего результата (стандартная ошибка); Бг - относительное стандартное отклонение расчетной величины; Р - доверительная вероятность; 1 (р,£) - критерий Стьюдента при *£=2, £ - число степеней свободы; Ах - доверительный интервал среднего результата; 8 - относительная ошибка среднего результата; р - количество лабораторий, участвовавших в совместном оценочном эксперименте; т - общее среднее значение по уровню; С - значение тестовой статистики Кохрена при критических значениях (5%) 0,871 и (1%) 0,942 для п=3 ир=3; - стандартное отклонение повторяемости метода; - стандартное отклонение воспроизводимости метода.
Правильность методики устанавливали на идентичных образцах ЖС-2 с добавлением известного количества РСО хлорогеновой кислоты по три испытания образца на трех разных уровнях (концентрациях). Критерий приемлемости - средний процент восстановления при использовании растворов заданных концентраций, скорректированный на 100%, средняя величина которого должна находиться в пределах 100+5%. В разработанной методике процент восстановления находился в пределах от 96,72 до 103,09%, его средняя величина составила 99,41% (табл. 3).
Линейность аналитической методики определяли на пяти уровнях концентраций от принятого опорного значения расчетной величины (1,15%). Растворы готовили путем увеличения аликвоты по следующей схеме:
- 1-й уровень: аликвота раствора А 1,25 мл - объем раствора Б 25,0 (50%);
- 2-й уровень: аликвота раствора А 2,00 мл - объем раствора Б 25,0 (80%);
- 3-й уровень: аликвота раствора А 2,50 мл - объем раствора Б 25,0 (100%);
- 4-й уровень: аликвота раствора А 3,00 мл - объем раствора Б 25,0 (120%);
- 5-й уровень: аликвота раствора А 3,75 мл - объем раствора Б 25,0 (150%).
Критерий приемлемости - коэффициент корреляции не менее 0,995. В ходе определения линейности методики установлено, что график зависимости имеет линейный характер в области концентрации суммы ГКК 0,0117-0,0444 и описывается уравнением у=21,22х + 0,0004, значение остаточного стандартного отклонения равно 0,304, коэффициент корреляции близок к единице (0,999), это свидетельствует о сильной линейной зависимости значения оптической плотности от содержания действующих веществ в сборе. График зависимости представлен на рисунке.
Таблица 3. Результаты определения правильности методики
Уровни (концентрации) 1 1 1 2 2 2 3 3 3
Объем аликвоты раствора А, V, мл; 2,00 2,00 2,00 2,50 2,50 2,50 3,00 3,00 3,00
Оптическая плотность, Б 0,490 0,502 0,486 0,610 0,618 0,614 0,736 0,730 0,740
Содержание ГКК, г 0,023 0,024 0,023 0,029 0,029 0,029 0,035 0,034 0,035
Добавлено РСО ХГК, г 0,005 0,005 0,005 0,010 0,010 0,010 0,015 0,015 0,015
Содержание ГКК (ожидаемое), г 0,028 0,029 0,028 0,039 0,039 0,039 0,050 0,049 0,050
Оптическая плотность, Бі 0,610 0,627 0,583 0,846 0,823 0,800 1,020 1,028 1,030
Содержание ГКК (полученное), г Отношение, % 0,029 0,03 0,027 0,04 0,039 0,038 0,048 0,048 0,048
М полученное*100% М ожидаемое 102,3 103,1 98,5 102,9 99,1 96,8 96,7 98,0 97,3
\!яИ = 0,(1004+21,2207*х
График линейной зависимости между оптической плотностью и содержанием ГКК в ЖС-2
Заключение
1. Проведена аттестация (валидация) методики количественного определения ГКК в официнальном желчегонном сборе №2 методом прямой спектрофотометрии по прецизионности и воспроизводимости (лабораторная и межлабораторная), правильности и линейности.
2. На основании полученных данных установлено, что предлагаемая методика прямого спектрофотометрического определения является высокочувствительной, правильной и воспроизводимой.
3. В настоящее время нами рассматривается возможность ее использования для проведения сквоз-ной стандартизации «лекарственное сырье - жидкий и густой экстракты - таблетки» по показателю «количественное содержание действующих веществ».
Список литературы
1. Руководство 1СН «Валидация аналитических методик. Содержание и методология» Q2(R1): Официальные документы // Фармация. 2008. №4. С. 7-10.
2. Аладышева Ж.И., Беляев В.В., Береговых В.В. Практические аспекты работ по валидации аналитических методик // Фармация. 2008. №7. С. 9-14.
3. Арзамасцев А.П., Садчикова Н.П., Харитонов Ю.Я. Валидация аналитических методов // Фармация. 2006. №4. С. 8-12.
4. Евдокимова О.В. Валидация методики количественного определения суммы флавоноидов в столбиках с рыльцами кукурузы // Фармация. 2008. №7. С. 14-17.
5. ГОСТР ИСО 5725-2-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений. М., 2002. 42 с.
Поступило в редакцию 21 июня 2011 г. После переработки 10 июля 2011 г.
Abramova J.I., Chuchalin V.S., Kalinkina G.I. *, Kolomiets N.E. VALIDATION TECHNIQUES OF QUANTITATIVE DEFINITION OF HYDROXYCINNAMIC ACIDS IN CHOLAGOGIC GATHERING №2
The Siberian state medical university, Moscow st., 2/7, Tomsk, 634050 (Russia), e-mail: [email protected]
In article results validation techniques of quantitative definition hydroxycinnamic acids in cholagogic gathering (ChG) №2 are presented. It is established that the offered technique direct spectrophotometric definitions hydroxycinnamic acids in ChG №2 is exact, correct, reproduced and linear.
Keywords: validation, cholagogic gathering, hydroxycinnamic acids, accuracy, reproducibility, linearity, correctness.
References
1. Farmatsiia, 2008, no. 4, pp. 7-10. (in Russ.)
2. Aladysheva Zh.I., Beliaev V.V., Beregovykh V.V. Farmatsiia, 2008, no. 7, pp. 9-14. (in Russ.)
3. Arzamastsev A.P., Sadchikova N.P., Kharitonov Iu.Ia. Farmatsiia, 2006, no. 4, pp. 8-12. (in Russ.)
4. Evdokimova O.V. Farmatsiia, 2008, no. 7, pp. 14-17. (in Russ.)
5. GOSTR ISO 5725-2-2002 Tochnost' (pravil'nost' i pretsizionnost') metodov i rezul'tatov izmerenii. Chast' 2. Osnovnoi metod opredeleniia povtoriaemosti i vosproizvodimosti standartnogo metoda izmerenii. [ISO 5725-2-2002 Accuracy (trueness and precision) of measurement methods and results. Part 2. Methods for the determination of repeatability and reproducibility of a standard measurement method]. Moskow, 2002, 42 p. (in Russ.)
Received June 21, 2011 Revised 10 July 2011
* Corresponding autor.
