ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЕССОТОКСИНА В МОЛЛЮСКАХ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ ─ ТАНДЕМНОЙ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ Текст научной статьи по специальности «Химические технологии»

УДК 543.(544+51)

Бревнова Б.О. Комарицких М.Ю., Захарычев В.В.

ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЕССОТОКСИНА В МОЛЛЮСКАХ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ - ТАНДЕМНОЙ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ

Бревнова Бажена Олеговна, студентка 5 курса факультета химико-фармацевтических технологий и биомедицинских препаратов, e-mail: starodubczewa.ej@yandex.ru;

Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125047, Москва, Миусская пл., д. 9

Комарицких Михаил Юрьевич, токсиколог, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный центр безопасности продукции водного промысла и аквакультуры», Москва, Россия Захарычев Владимир Владимирович, к.х.н., доцент кафедры химии и технологии органического синтеза, Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия

Проведена валидация методики определения ессотоксина в моллюсках методом ВЭЖХ-МС/МС в соответствии с критериями Решения Комиссии 657/2002/ЕС. Проведены исследования специфичности, линейности, воспроизводимости, правильности, прецизионности, повторяемости, найдены значения предела решения, способности обнаружения и расширенной неопределенности измерений.

Ключевые слова: биотоксины, ессотоксины, валидация, высокоэффективная жидкостная хроматография, масс-спектрометрия.

VALIDATION OF THE QUANTITATIVE HIGH-PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY—TANDEM MASS SPECTROMETRY METHOD FOR YESSOTOXIN DETERMINATION IN MOLLUSCS

Brevnova B.O., Komaritskikh M.Yu.*, Zakharychev V.V.

D.Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia

Federal State Budgetary Establishment «National Centre for Safety of Aquatic Fisheries Products and Aquaculture», Moscow, Russia

The quantitative HPLC-MS/MS method for yessotoxin determination in molluscs was validated using the Commission Decision 657/2002/EC as guideline. Specificity, linearity, reproducibility, trueness, precision, repeatability, decision limits, detection capabilities, and expanded uncertainties in measurements were estimated.

Key words: biotoxins, yessotoxins, validation, high-performance liquid chromatography, mass spectrometry.

Введение

Ессотоксины представляют собой липофильные полициклические токсины, близкие по строению к сигуатоксинам. Их впервые выделили из пищеварительного аппарата гребешка приморского РайпореСеп yessoensis. Ессотоксины синтезируются динофлагеллятами Gonyaulax spinifera и Lingolodinium polyedrum, и при благоприятных условиях для их размножения эти токсины могут накапливаться в съедобных тканях гребешков, устриц и мидий. Не смотря на то, что до настоящего времени неизвестно их токсическое действие на человека, они ядовиты для мышей при внутрибрюшинном введении [1]. Поэтому ряд стран, включая страны Европейского Союза, Японию и Новую Зеландию, установили максимально допустимый уровень (МИ!) содержания для суммы ессотоксина (УТХ), гомоессотоксина (homoYTX), 45-гидроксиессотоксина (45-OH-YTX) и 45-

гидроксигомоессотоксина (45-OH-homoYTX) 1 мг эквивалентов ессотоксина на килограмм мяса моллюсков [2]. Поскольку в настоящее время коммерчески доступны только YTX и homoYTX, гармонизированная в ЕС Стандартная операционная процедура для определения липофильных биотоксинов в моллюсках [3] предполагает возможным считать факторы отклика для аналогичных токсинов одинаковыми и использовать YTX для непрямой количественной оценки содержания hYTX, 45 ^^ТХ и 45-OH-homoYTX. Предлагается использовать те же условия детектирования с регистрацией ионных переходов в режиме мониторинга множественных реакций для «гомологичных» или «гидроксилированных» ионов схожих токсинов.

Экспериментальная часть

Взвешивали 1 г мяса моллюска в центрифужную пробирку. При проведении валидационных исследований перед экстракцией к навеске добавляли 1 мл стандартного раствора токсина в метаноле (с концентрацией 0.5, 1, 1.5 мкг/мл YTX) и тщательно перемешивали. Добавляли 4,5 мл метанола, гомогенизировали на вортексе в течение 3 мин, центрифугировали 10 мин при 20°С при 4000 об./мин. Надосадочную жидкость переносили в колбу на 10 мл, экстракцию повторяли, экстракты объединяли, доводили объем до 10 мл метанолом. Полученный экстракт фильтровали через мембранный ПТФЭ фильтр с размером пор 0,45 мкм и вводили в хроматографическую систему.

R = H, n = 1 (YTX) R = H, n = 2 (homoYTX) R = OH, n = 1 (45-OH-YTX) R = OH, n = 2 (45-OH-homoYTX)

HHHHH

Исследование проводили с помощью жидкостного хромато-масс спектрометра с тройным квадруполем Braker EVOQ Qube на колонке с обращенно-фазовым сорбентом Acclaim 120 C18 (Thermo Fisher Scientific, США) 50^2,1 мм, 3 мкм и градиентным элюированием. Фаза А представляет собой 5 мМ формиата аммония и 13,3 мМ муравьиной кислоты в воде, фаза В — 90% ацетонитрила, 10% метанола с 5 мМ формиата аммония и 13,3 мМ муравьиной кислоты; режим элюирования: 0 мин 10% фазы В, 4—6 мин 80% фазы В, 6,5—9 мин 10% фазы В; температура колонки 40°С, объем вводимой пробы 20 мкл, объемная скорость потока подвижной фазы 0,3 мл/мин.

Детектирование проводили в условиях ионизации электроспреем при напряжении на капилляре 3000 В при отрицательной ионизации. Температура конуса составляла 200°С, температура нагревателя осушающего газа — 300°С. Энергию соударений оптимизировали для каждого токсина. Для этого в режиме мониторинга множественных реакций мы подобрали по два перехода фрагментации для каждого токсина с наиболее интенсивными сигналами, а также оптимизировали

значения энергии соударений (СЕ), соответствующие каждому переходу, изменяя их от 10 до 70 В с шагом 5 В. Для детектирования YTX использовали переходы (m/z) 1141,5 > 1061,3 (СЕ 30 В) и 1141,5 > 855,5 (60 В), для hYTX — 1155,5 > 1075,5 (30 В) и 1155,5 > 869,5 (60 В). Интенсивности сигналов вторых переходов (подтверждающих) составили 25% интенсивностей сигналов первых переходов (для количественного определения) для обоих токсинов.

Обсуждение результатов

В соответствии с Решением Комиссии 657/2002/ЕС [4] для YTX проведены исследования специфичности, линейности, воспроизводимости, правильности, прецизионности, повторяемости (or), найдены значения предела решения ССа и способности обнаружения ССß (табл. 1). Правильность должна укладываться в пределы от 80 до 110 %, воспроизводимость не должна превышать значения, рассчитанного по уравнению по уравнению Хорвитца [4] (16 % для 1000 мкг/кг).

Для определения специфичности исследовалось 20 холостых проб моллюсков. На хроматограммах отсутствовали пики, интерферирующие с пиками аналитов.

Линейность калибровочной зависимости определяли, строя график зависимости для 6-ти уровней калибровки, измеряя площади пиков аналита на хроматограммах матричных градуировочных растворов с концентрациями 12,5, 25, 50, 100, 150, 200 мкг/мл YTX, что соответствует содержанию аналита в матрице 0.125, 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2 максимально допустимых уровня. Все зависимости в исследованных диапазонах были линейными с коэффициентами корреляции (R ) 0,998 для YTX и 0,999 для homoYTX.

Для YTX были рассчитаны значения предела решения (ССа, табл. 1) для вероятности ошибки а = 5% по ГОСТ Р ИСО 11843-2-2007 [5] по уравнению 1:

ССа = MRL + U

SE ( у)

m

1

— + — +

K IJ (1)

1 MRL2

dx2

где ЫЯЬ - максимально допустимый уровень; и - одностороннее обратное ^распределение Стьюдента для ошибки а или в;

SE(у) - стандартная ошибка для у (у - отклик); т - наклон линии регрессии; К - число вколов на образец; I - количество уровней калибровки; 3 - количество образцов на уровень; ^ - квадрат разности между уровнем добавки и средним значением х (х - уровень добавки).

Рассчитаны значения предела количественного определения (ССв, табл. 1) для вероятности ошибки а = 5% по ГОСТ Р ИСО 11843-2-2007 [5] по уравнению 2:

3

HO3SO,

ССв = MRL + (Ue+ UjSEy)

m

(2)

1 1 MRL2

— + — +-7-

K IJ dx2

расширенном мкг/кг YTX,

Было рассчитано значение неопределенности для 1000 соответствующего максимальному остаточному уровню в соответствии с ГОСТ Р 54500.3—2011 [6].

Таблица 1. Суммарные значения восстановления (Я), стандартных отклонений (£Д), коэффициентов вариации (СУ), повторяемости (аг), предела решения ССа и способности обнаружения ССр, расширенной неопределенности измереня (и) УТХ из моллюсков с добавкой аналита (п = 18)

Токсин Уровень R (%) SD (%) CV (%) Or ССа ССр U

добавки (%) (мкг/кг) (мкг/кг) (%)

(мкг/кг)

500 105 8.6 8.2 8.1

YTX 1000 105 6.4 6.0 6.0 1130 1261 20

1500 101 7.3 7.2 5.5

Заключение

Проведены валидационные исследования методики определения ессотоксина. По результатам проведенного исследования полученные

валидационные параметры соответствуют критериям, установленным Решением Комиссии 657/2002/ЕС, следовательно предлагаемый метод пригоден для количественного определения ессотоксинов в мышечной ткани моллюсков.

Список литературы.

1. Pectenotoxins and Yessotoxins: Chemistry, Toxicology, Pharmacology, and Analysis / James K.J. [et al.] // In: Seafood and freshwater toxins / Ed. L.M.Botana. New York, Basel: Marcel Dekker Inc., 2000. P. 289—324.

2. Comission Regulation (EC) No 853/2004 of the European Parliament and of the Council of 29 April

2004 laying down specific hygiene rules for food of animal origin.

3. EU-Harmonized Standard Operating Procedure for determination of Lipophilic marine biotoxins in molluscs by LC-MS/MS. Version 5. January 2015. Vigo: EU-RL-MB, AESAN. 33 р.

4. Comission Decision 657/2002/EC of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and interpretation of results.

5. ГОСТ Р ИСО 11843-2-2007 Статистические методы. Способность обнаружения. Часть 2. Методология в случае линейной калибровки.

6. ГОСТ Р 54500.3—2011 / Руководство ИСО/МЭК 98-3:2008. Неопределенность измерения — Часть 3. Руководство по выражению неопределенности измерения.