CC BY
6
УДК 543.544.5.068.7
Мухамбетказина Е.С., Захарычев В.В., Марцынкевич А.М.
ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ АНАЛИЗА МЕЛАМИНА В РЫБНОЙ МУКЕ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Мухамбетказина Елизавета Сериковна, студентка 4 курса факультета химико-фармацевтических технологий и биомедицинских препаратов, e-mail:elsermukh@gmail.com;
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125047, Москва, Миусская пл., д. 9
Захарычев Владимир Владимирович, к.х.н., доцент кафедры химии и технологии органического синтеза, Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия Марцынкевич Андрей Михайлович, заместитель заведующего испытательной референс-лабораторией, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный центр безопасности продукции водного промысла и аквакультуры», Москва, Россия
Проведена валидация методики анализа меламина в рыбной муке методом ВЭЖХ в соответствии с критериями Решения Комиссии 657/2002/ЕС. Проведены исследования специфичности, линейности, воспроизводимости, правильности, прецизионности, повторяемости, найдены значения предела решения и способности обнаружения.
Ключевые слова: меламин, анализ, рыбная мука, высокоэффективная жидкостная хроматография, валидация.
VALIDATION OF THE QUANTITATIVE HIGH-PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY METHOD FOR MELAMINE DETERMINATION IN FISHMEAL
Mukhambetkazina Ye.S., Zakharychev V.V., Martsynkevich A.M.*
D.Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia
'Federal State Budgetary Establishment «National Centre for Safety of Aquatic Fisheries Products and Aquaculture», Moscow, Russia
The quantitative HPLC method for melamine determination in fishmeal was validated using the Commission Decision 657/2002/EC as guideline. Specificity, linearity, reproducibility, trueness, precision, repeatability, decision limits,and detection capabilities were estimated.
Key words: melamine, analysis, fishmeal, high-performance liquid chromatography, validation.
Введение
Структура меламина богата азотом (66% по сравнению с 10—12% в белке), из-за чего его добавляли в продукты питания и корма с целью фальсификации для имитации повышенного содержания белка, анализируемого по методам Къельдаля или Дюма [1]. Меламин может поступать в продукты или корма также непреднамеренно из меламинсодержащей тары. Вследствие
употребления контаминированных продуктов у людей и животных могут образовываться камни в почках [2], что иногда летально. Наиболее известен «Китайский молочный скандал-2008».
Поэтому возникает необходимость контроля содержания меламина в продуктах питания и кормах.
В Российской Федерации существуют только одни методические указания для определения меламина в молочных продуктах [3]. Однако при экспорте рыбной муки необходимы сертификаты анализов, среди показателей в которых указывается также содержание меламина. Из-за значительного различия в составе матриц метод ВЭЖХ-УФ/ДМД для молока может использоваться только как скрининговый; чтобы сделать его подтверждающим
обязательно требуется тщательная валидация на интересующей матрице [1].
В настоящей работе проведена валидация методики определения меламина в соответствии с рекомендациями Решения Комиссии 657/2002/ЕС
[4].
Экспериментальная часть
Навеску 1,00 г рыбной муки помещали в центрифужную пробирку вместимостью 10 см3, добавляли 5 см3 смеси ацетонитрил—вода (1:1), смесь встряхивали в течение 15 мин при максимальной интенсивности встряхивателя, центрифугировали при 4000 об./мин при 20°С. Надосадочную жидкость отфильтровывали, к аликвоте экстракта (1 см3) добавляли 0,2 см3 50 %-й трифторуксусной кислоты и центрифугировали 15 мин при 10 000 об/мин. Полученный экстракт фильтровали через мембранный ПТФЭ фильтр с размером пор 0,45 мкм и вводили в хроматографическую систему.
Исследования проводили с помощью жидкостного хроматографа Agilent Technologies 1200 Series с диодно-матричным детектором при длине волны 236 нм в режиме изократического
элюирования. Для хроматографического разделения использовали колонку Phenomenex LUNA 5u C18 250^2 мм с размером частиц 5 мкм. Подвижную фазу готовили, растворяя 0,17 моль уксуснокислого натрия в 1 л деионизированной воды, после чего значение рН раствора доводили до 4,6 при помощи ледяной уксусной кислоты. Температура колонки 40оС, объем вводимой пробы 20 мкл, объемная скорость потока подвижной фазы 0,3 мл/мин.
NH2
N
N
HN
w nh2
Меламин
Обсуждение результатов
Исследования специфичности, линейности, воспроизводимости, правильности, прецизионности, повторяемости, значения предела решения ССа и способности обнаружения ССР были проведены соответствии с Решением Комиссии 657/2002/ЕС [4]. Правильность должна укладываться в пределы от 80 до 110 %, воспроизводимость не должна превышать значения, рассчитанного по уравнению Хорвитца [4] (16 % для 1000 мкг/кг).
Для определения специфичности исследовалось 20 холостых проб рыбной муки. На хроматограммах отсутствовали пики, интерферирующие с пиками аналитов.
В Российской Федерации в соответствии с техническим регламентом Таможенного союза ТР ТС 033/2013 [5] содержание меламина в молоке не допускается (менее 1,0 мг/кг), для других продуктов и кормов, в том числе рыбной муки нормативы отсутствуют. Поэтому был выбран подход определения предела решения ССа и способности обнаружения ССР, который используется для «запрещенных веществ» (forbidden substances). Значение 1,0 мг/кг мы использовали как условный «предельный уровень», аналогичный тому, который подразумевается под названием maximum required performance limit (MRPL) в Решении 657/2002/ЕС.
Линейность калибровочной зависимости определяли, строя график зависимости для 6-ти уровней калибровки, измеряя площади пиков аналита на хроматограммах матричных градуировочных растворов с концентрациями 12,5, 25, 50, 100, 150, 200 мкг/мл меламина, что соответствует содержанию аналита в матрице 0,125, 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2 предельных уровня. Зависимость в
исследованном диапазоне
была
линеинои
коэффициентом корреляции (Я) 0,999.
Значения воспроизводимости, правильности, прецизионности и повторяемости получены в результате трехдневного эксперимента с использованием 18 образцов рыбной муки с добавкой аналита в концентрациях 1,0, 1,5 и 2,0 мг/кг (табл. 1).
Суммарные значения восстановления приведены в табл. 2.
Таблица 1. Значения восстановления для меламина в образцах рыбной муки с ^ добавкой.
День Уровень добавки (мг/кг) Восстановлен ие (%) SD (%) RSD (%) n
1,0 88,1 11,5 13,0 6
1 1,5 93,0 8,3 9,0 6
2,0 94,9 5,7 6,0 6
1,0 76,9 9,9 12,9 6
2 1,5 89,2 5,1 9,0 6
2,0 85,8 6,1 7,1 6
1,0 73,9 7,9 10,8 6
3 1,5 80,9 7,4 9,2 6
2,0 85,1 4,5 5,3 6
Таблица 2. Суммарные значения
восстановления для меламина в образцах рыбной муки с добавкой (n = 18)
Уровень добавки (мг/кг) Восстановление (%) SD (%) RSD (%)
1,0 79,6 9,8 12,2
1,5 109,1 6,6 6,1
2,0 88,6 5,4 6,1
Было рассчитано значение предела решения ССа для вероятности ошибки а = 1% по ГОСТ Р ИСО 11843-2-2007 [6] по уравнению 1:
ССа = 2,33 + ± + МрИ, (1)
т \К и сСх2
где 2,33 - одностороннее обратное I-распределение Стьюдента для значения Р=0,99;
^К(у) - стандартная ошибка для у (у - отклик);
т - наклон линии регрессии;
К - число вколов на образец;
I - количество уровней калибровки;
и - количество образцов на уровень;
Сх - квадрат разности между уровнем добавки и средним значением х (х - уровень добавки).
Рассчитаны значения предела количественного определения (ССР) для вероятности ошибки а = 5% по ГОСТ Р ИСО 11843-2-2007 [6] по уравнению 2:
сс^ = (2,33 +1,64)^(1+17^ (2) 4 ' т \К и Сх2
где 1,64 — одностороннее обратное I-распределение Стьюдента для значения Р=0,95.
Значение предела решения ССа составило 0,15 мг/кг, предела количественного определения ССР — 0,25 мг/кг.
Заключение
Проведены валидационные исследования методики определения меламина в рыбной муке. По результатам проведенного исследования
полученные валидационные параметры
соответствуют критериям, установленным Решением Комиссии 657/2002/ЕС, следовательно предлагаемый метод пригоден для количественного определения меламина в рыбной муке в лаборатории.
Список литературы.
1. Toxicological and health aspects of melamine and cyanuric acid: report of a WHO expert meeting in collaboration with FAO supported by Health Canada, Ottawa, Canada, 1—4 December 2008. Geneva: World Health Organization Press, 2009. 67 pp.
2. Skinner C.G., Thomas J.D., Osterloh J.D. Melamine toxicity // Med. Toxicol. March 2010,Vol. 6, Is. 1, P. 50-55.
3. Определение меламина в молоке и молочных продуктах: Методические указания. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2008. 17 с.
4. Comission Decision 657/2002/EC of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and interpretation of results.
5. Технический регламент Таможенного союза «О безопасности молока и молочной продукции» (ТР ТС 033/2013).
6. ГОСТ Р ИСО 11843-2-2007 Статистические методы. Способность обнаружения. Часть 2. Методология в случае линейной калибровки.
