CC BY
26
© Астраханцев А. Ф., Царева О. А., 2000 УДК 616. 441 -008.63
ВАКУОЛЯРНО-ЛИЗОСОМАЛЬНАЯ СИСТЕМА ТИРОЦИТОВ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ГИПОФУНКЦИИ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
А. Ф. Астраханцев, О. А. Царева
Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П.Павлова
В экспериментах на лабораторных животных с помощью радиоиммунологического и электронномикроскопического методов исследования изучены тиреоидный статус и ультраструктура тироцитов щитовидной железы при гипофункции индуцированной введением экзогенного трийодтиронина и ингибиторов белкового синтеза. Выявлены изменения в вакуолярно-лизосомальной системе, отражающие нарушения образования йодтиронинов и свидетельствующие об усилении процессов аутофагоцитоза в цитоплазме фолликулярных эндокриноцитов.
Исключительно важное значение вакуолярно-лизосомальной системы тироцитов у животных различных классов и человека отмечается в работах целого ряда авторов [2, 4, 7]. Под действием лизосомальных гидролаз в фолликулярных эндокриноцитах щитовидной железы происходит образование тироксина - гормона, обладающего в целостном организме широким спектром регулирующего воздействия на разнообразные клетки, ткани и органы. В клинической практике все большее внимание уделяется гипотирозу -синдрому, развитие которого обусловлено гипофункцией щитовидной железы характеризующейся снижением содержания тиреоидных гормонов в сыворотке крови [1]. Поэтому представляется актуальным изучение изменений вакуолярно-лизосомальной системы тироцитов при гипофункции щитовидной железы в различных экспериментальных условиях.
Целью настоящего исследования является изучение изменений гормонального статуса экспериментальных животных и вакуолярно-лизосомальной системы тироцитов щитовидной железы при гипофункции инду-
цированной введением экзогенного трийодтиронина и ингибиторов белкового синтеза.
Материалы и методы
Исследования выполнены на 23 белых нелинейных крысах самцах массой 180-220 г, содержащихся в стандартных условиях вивария. Трийодтиро-нин (Т3) вводили подкожно в разовой дозе 100 мг/ кггсутки в течение 7 дней. Контрольные крысы в те же сроки получали инъекции растворителя (0,0025 М NaOH). Забой осуществляли через 24 часа от последней инъекции препарата. ,
Ингибиторы биосинтеза белка -актиномицин D (AmD) и циклогекси-мид (Цг) (Renal) вводили четырехкратно в/брюшинно в разовой дозе 0,2 и 1 мг/кг, соответственно, с интервалом в 12 часов. Животных забивали через 6 часов от последней инъекции препарата. Контролем служили крысы, которым вводили в те же сроки растворитель (5% этанол).
По описанной выше схеме крысам вводили AmD и Цг на фоне введения Т3 подкожно в дозе 100 мг/кггсутки в течение 6-х и 7-х суток от начала вве-
дения гормона. Животных забивали через 6 часов от последней инъекции соответственно AmD и Цг. Контролем служили крысы, которые в соответствующие сроки получали инъекции растворителя (0,025 М NaOH) и в/брюшинно растворитель (5% этанол).
Сывороточный уровень гормонов исследовался в день забоя. Кровь отбирали из брюшной аорты и отстаивали до получения сыворотки. Содержание Т3 и Т4 измеряли радиоиммунным методом при помощи наборов “Orion Diagnostica”; ТТГ определяли иммуно-ферментным методом (наборы Umelisa) и радиоиммунным методом (“Orion Diagnostica”).
Для электронно-микроскопичес-кого исследования небольшие кусочки (lrl мм) паренхимы щитовидной железы префиксировали в 2,5% растворе глутарового альдегида при 4°С в течение 4 часов. Материал промывали в фосфатном буфере pH 7,4 (три смены по 30 минут). Постфиксацию проводили в 1% растворе 0s04, дегидратацию - в возрастающей концентрации этанола и заключали в смесь аралдита и эпо-на. Полутонкие срезы изготовляли с помощью ультрамикротома УМТП-4 и окрашивали гематоксилином и эозином. Ультратонкие срезы изготовляли с помощью ультрамикротома УМТП-6, контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца и исследовали под электронным микроскопом ЭМ-125К.
Количественную оценку лизосо-мального компонента вакуолярной системы проводили на экране электронного микроскопа путем подсчета числа лизосом цитоплазмы тироцитов в 10 случайных полях зрения. При этом учитывали раздельно количество первичных лизосом и вторичных лизосом с гомогенным и гетерогенным содержимым.
Результаты исследований обрабатывали методом вариационной статистики. Для каждой серии результатов вычислялась средняя арифметическая
сгруппированного ряда (М) и стандартная ошибка средней арифметической (т). Достоверность различий оценивалась с использованием t-критерия Стьюдента. Вычисления проводились с использованием специальной прикладной программы “ Sigma Plot “ в среде Windows 3.11. Достоверными считались результаты при р<0,05.
Результаты и их обсуждение
В результате радиоиммуно-логического исследования сыворотки крови экспериментальных животных установлено, что во всех сериях опытов наблюдается в той или иной степени падение концентрации Т3 по сравнению с контролем. Наиболее существенное снижение значения Т3 (приблизительно в 5 раз) происходит у животных, получавших инъекции циклогексими-да (табл. 1). Исключение составляет модель с семидневным введением Т3 в дозе 100 мг/кг, при котором обнаружено значительное увеличение концентрации данного гормона в сыворотке крови по сравнению с контролем (табл. 1). Данный факт, по-видимому, объясняется высокой дозой вводимого препарата и накоплением его в крови экспериментальных животных.
При изучении концентрации Т4 в сыворотке крови отмечается общая тенденция в сторону ее понижения практически при всех условиях эксперимента. Особенно сильно (в 38 раз по сравнению с контролем) снижается концентрация Т4 при введении экзогенного Т3 и в 6 раз - при введении цикло-гексимида на фоне инъекций Т3 (табл. 1). Такое понижение уровня Т4 свидетельствует об резком угнетении секреции эндогенных йодтиронинов.
Наиболее существенное понижение уровня ТТГ (табл. 1) о+мечается при введений экспериментальным животным экзогенного Т3 (в 21 раз по сравнению с контролем), при совместном введения актиномицина D с Т3 (в 17 раз) и циклогексимида с Т3 (в 14 раз).
Таблица 1
Изменение тиреоидного статуса крыс при экспериментальной гипофункщм
Серия Масса тела,г (М±ш) Масса железы, г (М1ш) Концентрация гормонов в сыворотке кров»
Т3, нмоль/л (М+т) Т4, нмоль/л (М!т) ТТГ, МЕД/л (М1т)
Контроль (п=5) 200,612,27 30У611,08 1,89710,047 27,485+1,332 1,47510,074
Т3 (п=5) 192,4±1,2** 20,610,81*** 6,71+0,33** 0,7610,05*** 0,07Ю,02***
АмБ (п=5) 191,812,44** 2811,23 1,1Ю,07*** 17,6612,1** 0,6410,03***
АмБ+Тз (п=4) 181,515,07** 25,811,65* 0,96Ю,09*** 14,6811,09** 0,0910,01***
Цг (п=5) 19112,48* 2411,16* 0,3910,15*** 11,0612,31** 0,2610,02***
Цг+Тз (п=4) 18311,71* 21,511,19* 0,98Ю,24* 4,6510,31*** 0,1110,03***
выраженная редукция гранулярной зн-доплазматической сети с уменьшением числа и плотности распределения рибосом на ее мембранах. Наиболее выраженные изменения эндоплазма-тической сети обнаруживаются при введении актиномицина О и циклогексимида. При этом, наряду с редуктивными изменениями
эндоплазматической сети определяется вакуолизация ее цистерн, свидетельствующая о более глубоких нарушениях процессов синтеза и транспорта веществ в клетке. Совместное введение1 актиномицина ВиТ3 приводит к более выраженному эффекту. В тироци-тах обнаруживаются лишь отдельные мелкие фрагменты гранулярной эндоплазматической сети. Полученные результаты указывают на наличие синергизма в действии актиномицина 0 и Т3, что весьма вероятно, если принимать во внимание способность этого гормона ингибировать синтез ТТГ на уровне транскрипции [12]. При совместном введении циклогексимида и Т3 подобный эффект не наблюдается, что позволяет предположить наличие различных
Вероятно, данный факт является следствием особенности влияния экзогенного Т3 нй синтез ТТГ, заключающейся в торможении гормонального синтеза по принципу обратной связи [8]. Наряду с этим, возможен механизм непосредственного влияния Т3 на синтез ТТГ, т.к. известна способность Т3 вступать в связь с гипофизарным рецептором Ь-1, а также промотором гена Ь-субъединицы тиреотропина и ингибировать синтез ТТГ на уровне транскрипции [12]. Кроме того, на гипофизарном уровне Т3 способен тормозить биосинтез рецепторов тиреотропин-релизинг гормона и, тем самым, уменьшать восприимчивость тироцитов к стимуляции со стороны гипотолямуса [9]. И, наконец', следует учитывать возможность Т3 на гипоталамическом уровне блокировать синтез и выделение тиреотропин-релизинг гормона, регулирующего секрецию и выделение ТТГ [11].
При ультраструктурном исследовании паренхимы щитовидной железы практически во всех сериях экспериментов в тироцитах обнаруживается
механизмов влияния данных препаратов на синтетическую активность тиро-цитов.
Во всех сериях эксперимента отмечаются частичные редуктивные изменения со стороны комплекса Гольджи. При экспериментальной гипофункции щитовидной железы в результате введения актиномицина О и актиномици-на 0 совместно с Т3, он представлен лишь небольшим скоплением диктио-сом и микро-пузырьков.
Динамика изменений лизосомаль-ного компонента вакуолярной системы наиболее ярко свидетельствует о функциональном состоянии фолликулярных эндокриноцитов. Проведенная сравнительная количественная оценка вакуолярно-лизосомальной системы позволяет обнаружить, что наиболее характерными изменениями при всех экспериментальных воздействиях являются уменьшение количества первичных лизосом и увеличение числа вто-
ричных лизосом в цитоплазме тироци-тов (табл. 2).
Уменьшение количества первичных лизосом может быть связано с нарушением процесса образования лизосом (лизосомогенез), поскольку практически при всех изученных условиях эксперимента отмечались редуктивные изменения со стороны эндоплазмати-ческой сети и комплекса Гольджи. Необходимо учитывать также и то, что уменьшение числа первичных лизосом может явиться следствием ускорения процессов их трансформации во вторичные лизосомы.
Обращает также на себя внимание достоверное увеличение числа вторичных лизосом с гомогенным содержимым, обнаруженное во всех экспериментальных сериях (табл. 2). Эти данные имеют особое значение, поскольку обнаруживаются на фоне дисбаланса тиреоидных гормонов (гипо-функциональные изменения) и, по-ви-
Таблица 2
Количественная характеристика ультраструктурных изменений вакуолярно-лизосомального аппарата тиреоцитов при экспериментальной гипофункции
Серия
Количество лизосом в среднем на 1 Э.Г.
Первичных
Вторичных с гомогенным со-деожимым
Вторичных с гетерогенным содер-жимым ___________
Контроль
(П=5)
28,4+1,76
5,5±0,5
0,2±0,13
Тз
(п=5)
16,2+1,22
11,0±0,75
2,7+0,52
АмБ
10=51
23,7±1,02
11,2+0,62
0,7+0,21
АмБ+Тз
(п=4)
24,0±1,13
11,9+0,69
1,0±0,14
Цг
(п=5)
24,4+1,28
10,2±0,76
0,3+0,51
Цг+ Тз (п=5)
21,7+1,28
10,1+1,06
2,6±0,45
Примечание. Достоверность различий по отношению к контролю: * р<0,05;** р <0,01 *** р<0,001.
димому, указывают на торможение протеолиза тиреоглобулина - факт, обнаруженный при сходной экспериментальной ситуации и другими исследователями [10].
Увеличение количества вторичных лизосом с гетерогенным содержимым в цитоплазме тироцитов экспериментальных животных, с одной стороны, свидетельствует о нарушениях гормонального синтеза, с другой - указывает на усиление процессов аутофагоцитоза [3]. В пользу данного положения свидетельствует скопление вторичных лизосом с гетерогенным содержимым вблизи редуцированных каналов эндоплазмати-ческой сети (при введении актиномици-на D и сочетанного введения актиноми-цина D с Т3) и островков митохондрий с явно выраженными деструктивными изменениями (при введении циклогек-симида и сочетанного введения цикло-гексимида с Т3).
Выводы
1. Гипофункция щитовидной железы, вызванная введением экзогенного Т3 актиномицина D, циклогексимида, сопровождается существенными изменениями в вакуолярно-лизосомальной системе тироцитов.
2. Изменения в вакуолярно-лизосомаль-ной системе отражают нарушения образования йодтиронинов и одновременно свидетельствуют об усиление процессов аутофагоцитоза в цитоплазме фолликулярных эндокриноцитов.
ЛИТЕРАТУРА
1. БалаболкинМ.И. Эндокринология.-М: Универсум паблишинг, 1998. - 581 С.
2. Кондратенко Е.И., Теплый Д.Л., Масло-в.А.К. Ультраструктурные изменения тире-оидного фолликулярного эпителия, вызванные введением антиоксидантов // XVII Рос. конф. по электронной микроскопии. - Черноголовка, 1998. - С. 256.
3. Маянская H.H. Лизосомы и регенерация // Современные проблемы регенерации: Материалы Второй Всесоюз. школы молодых ученых и специалистов по современным пробле-
мам регенерации / Пол ред. Г.Л. Билича, В.Л. Коллы. - Йошкар-Ола, 1982. - С. 41 - 48.
4. French E.I., Hodges R.D. Fine struxtural studies on the thyroid gland of the normal domestic towe // Cell. Tissue. Res. - 1977. - Vol. 178, N3. - P. 397-410.
5. Fujita H., Shinkawa I. Electron microscopic studies on the thyroid gland of the hagfish, Eptatretus Burgeri. ( a part of phylogenetic studies of the thyroid gland ) // Arch. Histol. Jpn. -1975. - Vol. 37, N4. - P. 277-289.
6. Neve P., Authelet М., Golstein J. Effect of aging on the thyroid gland of the cream hamster. Further evidence for two different mechanisms of hormone secretion // Cell Tissue Res. -1981. - Vol. 220, N3.-P. 499-509.
7. Neve P. Rondeaux P. Age-related accumulation of lysosomes and other cytolopcal features in active thyroid follicles of the CBA mouse // Cell. Tissue Res. -1994. - Vol. 265, N2. - P. 275-285.
8. Circadian and pulsatile TSH secretion wider physiological and pathophysiological conditions IG. Brabant, K. Prank, U. Ranft, et at. // Ho*m. Metab. Res. Suppl. -1990. - VoL 23. - P. 12-17.
9. Differential regulation of thyrotropin - rellasing hormone in vivo and in vitro (GH3, сей»)/M. Yamada, T. Monden, T. Saton, et al. // Biophys. Res. Commun. -1992. - Vol. 184, N1. -P. 367-
“ 372.
10. Effect of iodine intake on thyroid secondary lysosomes after subtotal thyroidectomy / P. Neve, I.R. Starling, J. Golstein, P.P. Krupp // Endocrinology.-1989.-Vol. 123, N1.-P. 478-486.
11.Rendeel J.M.M., de Creef W.J., Visser T. J. Effect of thyroid status on relese of hupothalamic thurotropin - relasing Hormone // Horm. Metab. Res. Suppl. - 1990. - Vol. 23. - P. 1-4.
12. Thyroid hormone regulation of human pituitary a - subbunit gene expression: ( Pap, 4 - th Thyroid Sump. Brain and Thyroid Grar.) // Ada Med. Austr. - 1992. - Vol. 19, N1. - P. 66-68.
VACUOLAR-LYSOSOMIC THYROCYTE SYSTEM IN CASE OF EXPERIMENTAL HYPOFUNCnON OF THYROID GLAND. Astrahantsev A.F., Tsaryova O.A. Thyroidin status and thyrocyte idtrsKtrHCfure of thyroid gland in case of hypofundiaii induced by introduction of exogenic triiodothyronine and inhibitors of luminous synthesis wm® studied ¡»the corse of experiments on laboratory animals usieg radioimmunologic and electronamicroscopic techniques. Changes in vacuoiar-fysesemie system were observed which reflected the disturbance in iodothyronine formation and indicated mteasifWatioa of autophagocytosis process in cytoplasm offofficata’ endocrmocytes.
і
