CC BY
21
ВАКЦИНЫ «ГРИППОЛ» И «ВАКСИГРИП» АКТИВАТОРЫ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ СИСТЕМЫ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА
U U U
В КЛЕТКАХ ОСТРОЙ МОНОЦИТАРНОИ ЛЕИКЕМИИ ТНР1-
Соколова Татьяна Михайловна
Докт. биол. наук, ведущий научный сотрудник
Полосков Владислав Васильевич
младший научный сотрудник
Шувалов Александр Николаевич
младший научный сотрудник
Лаборатория Интерфероногенеза Федерального научно-исследовательского центра (ФНИЦЭМ) им. Н.Ф. Гамалеи» МЗ
РФ, г. Москва
АННОТАЦИЯ
Цель. Исследование действия применяемых гриппозных вакцин «Гриппол» и «Ваксигрип» на экспрессию 8 генов рецепторов врождённого иммунитета (TLR 2, 3, 4, 7, 8, 9, RIG1, MDA5) в линии клеток острой моноцитарной лейкемии ТНР-1.
Метод. Уровни экспрессии TLR/RLRs генов определены количественным методом ОТ-ПЦР в реальном времени (CFX-96, «Био-рад»). Полученные ПЦР-продукты анализированы электрофорезом в агарозном геле и по температурам плавления. Относительная оценка экспрессии генов (дельтаCq) сделана в программе CFX Manager «Gene expression analysis».
Результат. Вакцины «Гриппол» и «Ваксигрип» вызывают стимуляцию группы TLR/RLRs рецепторных генов в различной степени. Вакцина «Гриппол» многократно стимулирует транскрипцию гена MDA5 и активирует экспрессию TLR3, 4, 7, 8, RIG1 генов. Сплит-вакцина «Ваксигрип» эффективный стимулятор RIG1 гена и также генов TLR3, 7, 8 генов. Имму-номодулирующие характеристики вакцин зависят от их молекулярного состава.
Выводы. Наши результаты показывают возможность использования моноцитарной клеточной линии ТНР-1 как чувствительной и удобной модели для оценки активности инактивированных гриппозных вакцин на генном уровне.
ABSTRACT
Background. Studies expression activity of 8 genes innate immune receptors (TLR 2, 3, 4, 7, 8, 9, RIG1, MDA5) of used inactivated influenza vaccines "Gripol" and "Vaxigrip" in acute monocytic leukemia cell line THP-1.
Methods. The levels of gene expression was eSimated by RT-PCR real time method (CFX-96 "Bio-rad"). Obtained PCR-products were analyzed by gel-electrophoresis and T-melting. The relative gene expression levels (deltaCq) weres eSimated by CFX Manager «Gene expression analysis» program.
Result. Vaccines "Gripol" and "Vaxigrip" in THP-1 cells resulted in the Simulation of group TLR/RLRs immune receptor genes in different degree. Vaccine "Gripol" Simulates transcription of MDA5 gene many times and activates expression of TLR 3, 4, 7, 8, RIG1 genes. Split-vaccine "Vaxigrip" is the beS Simulator of RIG1 gene activities and also TLR 3, 7, 8 genes. Immune characterises of vaccines are dependent on its molecular contents.
Conclusion. Our data show good possibility for inveSigation of inactivated influenza virus vaccines activity using monocytic cell line THP-1.
Keywords: vaccines Gripol, Vaxigrip, THP-1 cells, expression TLR/RLRs genes.
Вакцины «Гриппол» и «Ваксигрип» находятся в арсенале основных медицинских препаратов, применяемых в настоящее время в России для защиты населения от заболеваемости гриппом [1,2,3]. Вакцины приготовлены из актуальных штаммов вируса гриппа, рекомендуемых Всемирной организацией здравоохранения на основании анализа эпидемической ситуации [2]. Информация о развитии протектив-ного иммунного ответа на эти вакцины получена, главным образом, в серологических исследованиях специфического гуморального ответа. В меньшей степени изучены вызываемые вакцинами реакции клеточного иммунитета и генов рецепторов врождённого иммунитета. Для оценки вакцинных препаратов необходимо развивать молекулярно-гене-тические методы и проводить поиск удобных клеточных моделей. Многофакторный иммунный ответ организма осуществляется с участием большой группы TLR/RLRs рецепторов [6, 7]. В представленной работе изучены активности большой группы генов рецепторов врожденного иммунитета (ТLRs 2, 3, 4, 7, 8, 9, RIG1, MDA5). Эти виды рецепторов узнают вирусные структуры и включают передачу сигналов
на гены интерферонов и провоспалительных цитокинов -регуляторов Т- и В-клеточного иммунитета [5]. В работе сравнили действие субъединичной вакцины «Гриппол» со сплит-вакциной «Ваксигрип», приготовленной из разрушенных вирионов.
Клетки ТНР-1 широко используется как чувствительная модель для оценки активности иммунобиологических препаратов [8]. Активированные иммунокомпетентные клетки продуцируют цитокины, и направляют субпопуляции Т-лимфоцитов на распознавание ими вирусных антигенов. Изучения действия гриппозных вакцин на клетках ТНР-1 ранее не проводилось.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Вакцина «Гриппол» (Микроген, Россия) - гриппозная тривалентная полимер-субъединичная вакцина, жидкая [3]. Представляет собой высокоочищенный белковый препарат, содержащий только поверхностные антигены вирусов гриппа (гемагглютинин и нейраминидаза) типов А и В, связанные водорастворимым высокомолекулярным ^оксидированным производным поли-1,4-этиленпиперазина
(иммуномодулятор Полиоксидоний). В одной дозе вакцины содержится по 5 мкг гемагглютининов (ГА) 2-х вирусов типа А (подтипы H1N1 и подтип H2N2) и 11 мкг ГА вируса гриппа типа В, 500 мкг полиоксидония и консервант мертиолят.
Вакцина «Ваксигрип» (Франция) - инактивированная высокоочищенная расщеплённая (сплит) вакцина, применяется в России с 1992 г. [1]. Активный компонент - вирусы гриппа, выращенные в куриных эмбрионах, расщеплённые и инактивированные. В одной дозе (0,5 мл) тривалентной вакцины содержится по 15 мкг ГА вирусов гриппа А/Калифорния/7/2009 NYMC Х-179А (H1N1), А/ Виктория/361/2011 IVR-165 (H3N2) и В/Хубей-Вуджиа-ганг/156/2009 NYMCBX-39, не более 0,05 мкг овальбумина и добавочные соли.
Клетки THP-1 (острый моноцитарный лейкоз, АТСС) получены в РОНЦ им. Н.Н. Блохина. Клетки культивировали в среде RPMI-1640 c 10% эмбриональной сывороткой телят и антибиотиками. Постановку опытов с препаратами осуществляли в суспензионной культуре ТНР-1 с плотностью 2 млн/мл в пробирках с герметичными крышками. Препараты вакцин добавляли к клеткам в объёме 0,2 мл (конечное разведение 1/10 и 1/100). Инкубацию клеток с вакцинами
Стимуляция вакцинами экспрессии генов рец
проводили 24 ч при 37°С в термостате. Осадки клеток ли-зировали в 0,5 мл буфера PURZOL (Bio-rad, США) согласно инструкции, и использовали для выделения РНК.
ОТ-ПЦР в реальном времени. Подробное описание процедуры выделения РНК и обработки препарата ДНК-зой, получения кДНК в реакции обратной транскрипции, структура рассчитанных олигонуклеотидных праймеров и проведения количественного ПЦР-анализа на приборе CFX-96 фирмы Bio-rad (США) приведены в наших публикациях [4, 5]. Праймеры синтезированы фирмой Синтол (Россия). Полученные ПЦР-продукты (кроме TLR2) соответствовали по размерам расчётным (данные электрофореза в 1,5% агарозном геле с бромистым этидием). Относительная оценка экспрессии генов (дельта Cq) сделана в программе CFX Manager «Gene expression analysis».
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Действие препаратов вакцин «Гриппол» и «Ваксигрип» на транскрипцию генов 8-ми видов TLR/RLRs рецепторов в клетках ТНР-1 представлены в таблице 1 и на рисунке 1. Сопоставлены уровни экспрессии (Cq) исследованных генов в контрольных клетках ТНР-1 (без добавления вакцин) и в опытных (после инкубации с вакцинами).
Таблица 1.
торов врождённого иммунитета в клетках ТНР-1
Гены/мРНК -размеры ПЦР-продуктов в п.н. Контроль уровни Cq В А К Ц И Н Ы Cq/дельтaCq
Гриппол Ваксигрип
TLR2 - 224 46* 40/* 55/*
TLR3 - 149 38 36/4 36/4
TLR4- 177 28 25/8 28/1
TLR7 - 150 35 32/8 31/16
TLR8 - 133 36 33/8 33/8
TLR9 - 231 31 31/1 31/1
RIG1- 152 46* 44/4 40/64
MDA5 - 127 50* 41/256 48/4
18S - 151 23 22/2 23/1
*отсутствие специфического продукта; п.н. -пары нуклеотидов. Cq - пороговый цикл амплификации; дельтаCq - уровни стимуляции экспрессии генов относительно контроля клеток, принятого равным 1. 18S рибосомальная РНК.
M TLR2 TLR3 TLR4 TLR7 TLR8 TLR9 RIGl MDA5 18S M
««. m mm m Л m 300 150 50
12 3 12 3 12 3 12 3 12 3 12 3 12 3 12 3 1 2
1 - контроль клеток; 2 - Гриппол; 3 - Ваксигрип; 18S риб. РНК; IV! - ДНК-маркёры п.н.
Рисунок 1. Действие вакцин Гриппол и Ваксигрип на экспрессию генов рецепторов врождённого иммунитета в клетках ТНР-1.
Электрофорез ПЦР-продуктов в 1,5% агарозном геле с бромистым этидием.
Клетки ТНР-1 имеют значительные различия в конститутивных уровнях экспрессии исследованных рецепторных генов (уровни от Cq27 TLR4 до Cq50 MDA5) (таблица 1). Обе вакцины оказывают стимулирующие эффекты на экспрессию нескольких рецепторных генов (TLR3, TLR7,
TLR8, RIG1, MDA5). Не выявлена транскрипция зрелых форм мРНК гена TLR2 и RIG1 в контроле клеток ТНР-1. Выявленные особенности действия вакцин на генном уровне, по-видимому, обусловлены различиями в их составе.
Субъединичная вакцина «Гриппол» содержит очищенные гемагглютинины вирусов гриппа А и В и иммуномоду-лятор «Полиоксидоний», сплит-вакцина «Ваксигрип» - ком-
поненты разрушенных вирионов вирусов гриппа А и B. Ген цитоплазматической хеликазы MDA5 наиболее восприимчив к действию вакцины «Гриппол». Вакцина «Ваксигрип» значительно повышает транскрипционную активность гена цитоплазматической хеликазы RIG1. Общим эффектом вакцин является индукция генов эндосомальных рецепторов TLR7/8 и TLR3. Стимулирующие генные эффекты имеют дозовую зависимость и снижаются в разведении.
На основании данных, полученных в клетках ТНР-1, и сообщённых нами ранее в клетках крови человека [4], можно сделать вывод, что на активируемый спектр генов заметно влияет тип клеток.
Полученные в этой работе результаты показывают возможность использования линии клеток ТНР-1 для определения активности вакцинных препаратов на генном уровне. Входящие в состав субъединичной вакцины «Гриппол» и сплит-вакцины «Ваксигрип» вирусные структуры, выступают в роли агонистов TLR/RLRs рецепторов. Повышая уровни экспрессии генов рецепторов врожденного иммунитета, вакцины делают клетки резистентными к живым вирусным патогенам.
Список литературы:
1. Гендон Ю.З. Инактивированная расщеплённая гриппозная вакцина «Ваксигрип» // Вакцинация. - 2000. - .№11. - С. 3-11.
2. Костинов, М.П. Вакцины нового поколения в профилактике инфекционных заболеваний / М.П.Костинов, Э.Б. Гурвич Э.Б. М. Медицина для всех. 2002: 152 с.
3. Петров, Р.В. Новая отечественная тривалентная поли-мерсубъединичная вакцина Гриппол / Р.В. Петров, Р.М. Хаитов // Вакцинология. - 1999. - № 5.- С. 6-7.
4. Соколова, Т.М. Стимуляция экспрессии генов сигнальных рецепторов и индукция синтеза цитокинов в клетках крови человека при действии препарата «Рибонуклеат натрия» и его комбинаций с гриппозными вакцинами in vitro / Т.М Соколова, А.Н. Шувалов, В.В. Полосков, И.М. Шапо-вал, М.П. Костинов // Молекулярная медицина. - 2015. - № 1. - С.12-17.
5. Соколова, Т. М. Стимуляция генов сигнальной трансдукции препаратами Ридостин, Циклоферон и Инга-вирин / А.Н. Шувалов, В.В.Полосков, Ф. И. Ершов // Цито-кины и воспаления. - 2015. - №2. - С. 26-34.
6. Kawai, T. Toll-like receptor and RIG1-like receptor signaling / T. Kawai , S. Akira // Ann. NY Acad. Sci. - 2008. -V. 1143. - P.1 - 20.
7. McGettrick, A.F. Toll-like receptors: key activators of leucocytes and regulator of hematopoiesis / A.F. McGettrick, L. A. J. O'Neill. // British J. of Haematology. - 2007. - V 139. -P.185-193.
8. Remer, K.A. Human monocytoid cells as a model to Sudy Toll-like receptor- mediated activation / K.A .Remer, M.Brcic, K.S. Sauler, T.W. Jungi // J. Immunol. Methods. - 2006. - V. 313(1-2). P. 1-10
