CC BY
25
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 2 (45)/2009
Вакцина Ультрагривак - основное средство борьбы с возможной пандемией птичьего гриппа
А.В. Катлинский, А.В. Семченко, С.А. Коровкин, А.Н. Миронов, С.Я. Мельников ФГУП «НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России, Москва (info@microgen.ru)
Резюме
Учитывая высокую актуальность защиты населения от надвигающейся пандемии гриппа птиц, ФГУП «НПО«Микроген»была разработана живая гриппозная вакцина Ультрагривак. Для создания ее прототипа был использован вакцинный штамм вируса гриппа А(H5N2), полученный в НИИ экспериментальной медицины РАМН методом классической генетической реассортации донорского штамма А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и вируса утиного гриппа А/Утка/Потсдам/1402-6/86 (H5N2).
Доклинические исследования вакцины Ультрагривак, проведенные с использованием беспородных мышей и приматов, показали высокие протективные свойства препарата в отношении высокопатогенного российского изолята А/Курица/ Курган/Россия/2/2005 (H5N1), а также доказали безопасность для экспериментальных животных.
I фаза клинического исследования проведена на базе военного госпиталя № 1137 Минобороны России с участием 20 добровольцев в возрасте от 18 до 50 лет. Показано, что вакцина Ультрагривак ареактогенна, безвредна, безопасна для окружающих и способна индуцировать местный и гуморальный иммунитет.
Основной задачей II фазы клинического исследования было определение оптимального интервала между вакцинациями - 10 или 21 сутки.
Исследование проведено на двух базах: ВГ № 1137 Минобороны России и ФГУЗ МСЧ № 163 ФМБА РФ. В исследовании приняло участие 200 человек в возрасте от 18 до 60 лет.
В результате исследования показано, что приоритетный интервал введения вакцины - 10 суток, что можно охарактеризовать как преимущество перед инактивированными гриппозными вакцинами, интервал введения которых составляет 28 суток.
Ключевые слова: пандемия гриппа, вакцина
Abstract
Vaccine Ultragrivac - the Main Remedy in Avian Influenza Pandemic Struggle
A.V. Katlinski, A.V. Semchenko, S.A. Korovkin, A.N. Mironov,
S.J. Melnikov
Federal State Company «Research-and-production association «Microgen»(info@microgen.ru)
Considering the high urgency of the population protection of the impendent avian flu pandemic, Microgen has developed live influenza nasal vaccine Ultragrivac. For creation of the pandemic Ultragrivac vaccine prototype an influenza A(H5N2) vaccine strain, obtained in an Experimental Medical Institute of Russian Medical Science Academy by classical genetic reassortation of the donor strain A/Leningrad/134/17/57 (H2N2) and a duck influenza virus A/duck/Potsdam/1402-6/86 (H5N2) was used.
Preclinical studies of the Ultragrivac vaccine using outbred mice and primates has showed high protective properties respective to highly pathogenic Russian isolate A/Chicken/Kurgan/ Russia/2/2005 (H5N1), and demonstrated safety for laboratory animals.
The phase I clinical trials was held in a military hospital № 1137 of the Defense Ministry with participation of 20 volunteers 18 to 50 years old. Areactogenicity, safety for surrounding people and ability to induce local and humoral immunity has been shown. Phase II clinical trials’ main objective was to determine the optimal interval between vaccinations, precisely 10 or 21 days.
The trial was conducted in 2 centres - a military hospital № 1137 of the Defense Ministry and Medical Unit № 163 of a Federal Medical and Biological Agency of the Healthcare Ministry. 200 volunteers aged 18 to 60 years participated.
The trials showed that the optimal interval between vaccine administration is 10 days, that can be characterized as an advantage over inactivated influenza vaccines that has a 28 days vaccination interval.
Key words: influenza pandemic, vaccine
Эпизоотии вируса гриппа птиц серотипа А(Н^1) и случаи заражения им людей, часто заканчивающиеся летальным исходом, привели экспертов Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) к выводу о неизбежности новой пандемии гриппа [6]. Предполагается, что наиболее вероятным этиологическим агентом будущей пандемии будет вирус вышеназванного серотипа - А(Н^1). Предположение основано на том, что в настоящее время именно вирусы этого серотипа вызывают массовые эпизоотии домашней и дикой птицы во многих странах, а также на том, что именно они чаще всего передаются от птиц к человеку.
Гриппозные вакцины были и остаются основным средством специфической профилактики как сезонного, так и пандемического гриппа. Используемые в настоящее время вакцинные штаммы получают методом реассортации актуальных эпидемических штаммов с так называемыми донорскими штаммами, в результате чего образуются реассортанты, имеющие смешанный геном. Гены, кодирующие гемагглютинин (НА) и нейраминидазу ^А), наследуются от актуального эпидемического штамма, а шесть генов внутренних и неструктурных белков - от донорского штамма. Гриппозные вакцины бывают инактивированными и живыми. С точки зрения защиты от будущей пандемии пти-
чьего гриппа эти два типа вакцин имеют разное назначение. Инактивированные вакцины, согласно рекомендациям экспертов ВОЗ, могут применяться в предпандемический период для защиты контингентов риска, прежде всего работников птицеферм, работников здравоохранения, охотников, лесников и всех тех, кто может иметь контакты с домашней и дикой птицей. Поэтому инактивированные вакцины против птичьего гриппа называют предпандемическими.
Живые вакцины против птичьего гриппа рекомендованы экспертами ВОЗ для использования в период непосредственно перед пандемией [10]. Живые гриппозные вакцины имеют следующие преимущества перед инактивированными пред-пандемическими и пандемическими [8]:
1. Для приготовления ста доз живой гриппозной вакцины достаточно всего одного куриного эмбриона, а только для одной дозы инактивированной гриппозной вакцины - от двух до четырех эмбрионов. Это очень важный момент в условиях угрозы пандемии: для приготовления инактивированных вакцин может не хватить куриных эмбрионов.
2. Времени для увеличения производственных мощностей и, соответственно, для наращивания крупномасштабного производства живых гриппозных вакцин требуется значительно меньше, чем для крупномасштабного производства инактивированных гриппозных вакцин.
3. Парентеральное применение инактивированных вакцин не приводит к стимуляции клеточного иммунитета и не вызывает образования секреторных иммуноглобулинов класса А ^^А) в достаточных количествах. Кроме того, кроссреактивность инактивированных вакцин недостаточно высока. В то же время вакцинация живой гриппозной вакциной способна стимулировать различные механизмы иммунного ответа, включая секреторные ^А, а также цитоток-сические Т-лимфоциты. Стимуляция неспецифических факторов иммунитета (интерфероны, NK-клетки) в ответ на введение живого антигена обусловливает формирование защиты уже через несколько дней после прививки.
4. Простота использования живой гриппозной вакцины в виде интраназального аэрозоля дает возможность охвата больших групп населения. Создаваемый при этом высокий уровень коллективного иммунитета может сыграть значительную роль в ограничении возможного распространения пандемии птичьего гриппа.
Поэтому в период непосредственной угрозы пандемии вакцинация живой гриппозной вакциной может оказаться значительно более эффективной для всех возрастных групп, чем применение инактивированной вакцины. На основании этого эксперты ВОЗ считают, что живые гриппозные вакцины являются основным средством
борьбы с возможной пандемией птичьего гриппа [8, 10].
Для создания прототипов живой гриппозной вакцины против птичьего гриппа исследователи разных стран использовали вакцинные штаммы различных серотипов, в том числе A(H5N1), A(H5N2), A(H9N2), A(H7N3) и A(H7N7). Американские исследователи показали, что иммуногенность живых гриппозных вакцин в значительной мере зависит от вакцинного штамма, который использовался для производства вакцины [4]. Допускается, что изменения в «кливейдж»-сайте (сайте расщепления гемагглютинина) вакцинного штамма могут уменьшить репродуктивность вакцинных штаммов вирусов гриппа серотипа A(H5N1), полученных с использованием метода «обратной» генетики [9]. Поэтому для создания прототипа живой гриппозной вакцины против птичьего гриппа Ультрагри-вак, разработанной в ФГУП «НПО «Микроген», был использован вакцинный штамм A(H5N2), полученный без применения технологии «обратной» генетики. Этот штамм был получен в НИИ экспериментальной медицины РАМН методом классической генетической реассортации донорского штамма А/Ленинград/134/17/57 ^N2) и вируса утиного гриппа А/Утка/Потсдам/1402-6/86 ^N2).
В России было проведено доклиническое исследование экспериментальной вакцины Ультрагривак, произведенной НПО «Микроген» с использованием вакцинного штамма А/17/Утка/Потсдам/86/92 ^N2). В этом исследовании была показана высокая протективность вакцины Ультрагривак против высокопатогенного российского изолята А/Курица/Курган/Россия/2/2005 ^N1) в опытах на мышах и приматах, а также показана безвредность вакцины на лабораторных животных. На основании результатов доклинического изучения была проведена I фаза клинического исследования на ограниченном контингенте добровольцев на базе военного госпиталя № 1137 Минобороны России. В результате проведенного исследования показано, что эта вакцина ареактогенна, безвредна, безопасна для окружающих и способна индуцировать гуморальный иммунитет при двукратной иммунизации добровольцев. Все это позволило рекомендовать ее для проведения II фазы клинического исследования.
Целью проведения этого исследования была оценка на двух клинических базах реактогенно-сти, безопасности и иммуногенности вакцины Уль-трагривак при двукратной иммунизации людей в возрасте от 18 до 60 лет. Одной из главных задач II фазы клинического исследования стало определение оптимального интервала между двумя вакцинациями - 10 суток или 21 сутки. Продолжительность этого интервала имеет очень важное эпидемиологическое значение, поскольку вакцина Ультрагривак должна вводиться непосредственно в период угрозы пандемии. Кроме того, необходимо было выяснить влияние величины инфекционного
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 2 (45)/2009
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 2 (45)/2009
титра вакцины на иммуногенность и безвредность при вакцинации добровольцев. Поэтому для вакцинации добровольцев в процессе II фазы клинического исследования была использована вакцина Ультрагривак с более высоким инфекционным вирусным титром (8,3 lg ЭИД 50/0,5 мл вместо 7,5 lg ЭИД 50/0,5 мл в I фазе клинического исследования).
В исследовании участвовали 200 человек в возрасте от 18 до 60 лет.
Одним из основных критериев включения добровольцев в клиническое исследование была величина предвакцинальных титров антител к вирусу птичьего гриппа А/17/Утка/Потсдам/86/92 (H5N2) менее 1:10 в реакции торможения гемагглютина-ции (РТГА). РТГА проводилась с использованием лошадиных эритроцитов и рецепторразрушающего энзима.
После распределения добровольцев по группам в 1-е сутки врачом-исследователем проводились сбор основных данных анамнеза, обследование терапевтом и ЛОР-врачом, термометрия, была взята кровь для проведения общего и биохимического анализа крови, определения сывороточных IgA, IgM, IgG, IgE, гуморального и клеточного иммунитета, кроме того, были взяты носоглоточные смывы для определения секреторного IgA.
Вакцинацию проводили двукратно, с интервалами введения 10 и 21 сутки.
Оценку реактогенности и безопасности проводили в течение 31 дня (интервал иммунизации -10 суток) и 42 дней (интервал иммунизации -21 сутки), ежедневно, по возникновении местных и системных побочных реакций. Наблюдение проводили в первые семь дней после первой и после второй иммунизации. В остальные дни волонтеры заполняли дневники самонаблюдения, где отражали наличие или отсутствие каких-либо побочных реакций. В конце исследования дневники собирали, все данные из них заносили в индивидуальные регистрационные карты и врач-исследователь проводил анализ состояния здоровья волонтеров.
Кроме того, проводилась оценка показателей общего анализа крови (гемоглобин, СОЭ, лейкоциты, эритроциты, формула крови), биохимического (АЛТ, АСТ, щелочная фосфатаза, билирубин, общий белок, мочевина, креатинин, С-реактивный белок), общего анализа мочи и определение в сыворотке крови IgA, IgM, IgG, IgE. Забор материала для лабораторных исследований проводили в 1-е, 10-е и 31-е сутки (интервал иммунизации - 10 суток) и в 1-е, 21-е и 42-е сутки (интервал иммунизации -21 сутки).
Также оценивалась безопасность вакцины для окружающих путем определения вакцинного штамма вируса гриппа в мазках из полости носа. Была изучена репродукция вируса в верхних дыхательных путях. В группе добровольцев, вакцинированных с интервалом введения 10 суток, забор ма-
териала проводился на 3-и, 7-е и 9-е сутки после первой вакцинации и на 3-и, 7-е, 9-е и 14-е - после второй. У добровольцев, вакцинированных с интервалом введения 21 сутки, забор материала проводился на 3-и, 7-е, 9-е и 14-е сутки после каждой вакцинации.
Оценка иммуногенности включала определение местного, клеточного и гуморального иммунитета на 10-е и 31-е сутки (интервал иммунизации -10 суток) и на 21-е и 42-е сутки (интервал иммунизации - 21 сутки). Местный иммунный ответ оценивали по уровню секреторных ^А в носовых смывах методом ИФА. Для оценки специфического клеточного иммунитета было проведено определение специфических цитотоксических Т-лимфоцитов. Гуморальный иммунитет оценивали по данным исследования сывороточных проб в РТГА по следующим показателям: уровню сероконверсии (процент лиц, у которых титр антител после вакцинации увеличился в четыре и более раз по сравнению с исходным), среднему геометрическому титру антител до и после вакцинации, фактору сероконверсии (кратность прироста среднего геометрического титра антител по сравнению с исходным).
В результате проведенного исследования были получены следующие результаты по безопасности вакцины Ультрагривак.
Общее количество местных реакций у вакцинированных составило 27 случаев (33%) - интервал введения - 10 суток и 12 случаев (15%) - с интервалом введения 21 сутки.
В группе добровольцев, двукратно привитых с интервалом 10 суток, местные реакции наблюдались только после первой вакцинации и были представлены в 13,8% случаев гиперемией слизистой задней стенки глотки, в 7,5% - отечностью задней стенки глотки, в 1,2% - гиперемией небных дужек, в 6,2% - гиперемией слизистой носа и в 5% - отечностью слизистой носа (табл. 1).
У добровольцев, привитых вакциной двукратно с интервалом 21 сутки, местные реакции наблюдались также только после первой вакцинации и были представлены гиперемией слизистой задней стенки глотки в 12,5% случаев и гиперемией небных дужек у 2,5% добровольцев.
Все катаральные явления в носоглотке были слабой степени выраженности, появлялись на
4 - 5-й день после вакцинации, носили транзи-торный характер и исчезали на 6 - 7-й день после введения вакцины. Других местных реакций отмечено не было.
Системных реакций (повышение температуры и др.) после первой и второй вакцинации - независимо от интервала введения - отмечено не было.
У добровольцев из группы плацебо местных и системных реакций не наблюдалось.
При оценке иммунологической безопасности также не выявлено существенного влияния на исследуемые показатели иммунного статуса по уровням сывороточных иммуноглобулинов. Даже в тех
Таблица 1.
Оценка местных реакций у добровольцев, двукратно привитых вакциной с интервалом введения 10 и 21 сутки (п = 80; ДИ 95%)
Нежелательные явления Катаральные явления в носоглотке Интервал введения 10 суток Интервал введения 21 сутки
Слизистая задней стенки глотки Гиперемия 13,8 (7,8 - 23) 12,5 (6,9 - 21,5)
Отечность 7,5 (3,5 - 15,4) -
Небные дужки Гиперемия 1,2 (0,2 - 6,8) 2,5 (0,7 - 8,7)
Слизистая носа Гиперемия 6,3 (2,7 - 13,8) -
Отечность 5 (2 - 12,2) -
случаях, когда их фоновые значения были достаточно высоки, величины оставались после вакцинации на прежнем уровне.
У вакцинированных волонтеров были получены мазки из носа в разные сроки после первичной иммунизации и ревакцинации. Всего было получено 111 реизолятов, все реизоляты были выделены после двух-трех пассажей в культуре клеток MDCK в присутствии 2 мкг/мл трипсина TPCK. Частота выделяемости реизолятов после первичной вакцинации и ревакцинации была примерно одинаковой в обеих группах вакцинированных. Анализ гена гемагглютинина для всех выделенных реизолятов с использованием набора «АмплиСенс Influenza virus H5» для выявления РНК вируса гриппа А и идентификации субтипа H5N1 методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флюоресцентной детекцией по «конечной точке» показал его принадлежность к се-ротипу H5. Регистрацию флюоресценции проводили на приборе ПЦР-детектор «Джин» («ДНК-Технология», Россия). Сигнал по каналу FAM свидетельствует о выявлении гена белка серотипа Н5 во всех исследованных образцах. В то же время ген нейрамини-дазы для серотипа N1 в исследованных образцах не обнаружен.
Нами было проведено изучение генотипической стабильности выделенных реизолятов. Анализ ну-
клеотидных последовательностей генов РВ1, РВ2, РА, М и NS получали методом ПЦР с использованием специфичных праймеров на гены РВ1, РВ2, РА, М и NS для серотипа H5N2 вируса гриппа. Оказалось, что реизоляты, полученные в разные сроки после прививки от одних и тех же волонтеров, сохраняли как характерные для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) биологические свойства, так и характерные изменения в генах внутренних и неструктурных белков.
Для оценки местного иммунитета было проведено определение уровня секреторного ^А ^^А) в смывах из носа. Определение концентрации секреторного ^А в назальных смывах проводили методом ИФА. Данные представлены в таблицах 2 и 3. Из них следует, что вне зависимости от интервала между вакцинациями у привитых добровольцев индуцируется sIgA как после первой, так и после второй вакцинации. Уровень sIgA в группах привитых достоверно отличается от уровня sIgA в группах плацебо.
Следует отметить, что индукция секреторных ^А у вакцинированных добровольцев является большим преимуществом вакцины Ультрагривак по сравнению с инактивированными гриппозными вакцинами, потому что sIgA образуются в так называемых «входных воротах» инфекции (носоглотка), а также потому, что sIgA обладают более высокой
Таблица 2.
Концентрация секреторного иммуноглобулина А ^1дА) в смывах из носа у добровольцев (интервал введения препаратов - 10 суток)
Препарат Концентрация sIgA в мг/мл (M ± m)
0-е сутки 10-е сутки 31-е сутки
Вакцина (n = 40) 16,96 ± 2,39 23,79 ± 3,36 31,81 ± 4,43
Плацебо (n = 10) 15,47 ± 5,31 10,28 ± 1,47 18,62 ± 5,71
Таблица 3.
Концентрация секреторного иммуноглобулина А ^1дА) в смывах из носа у добровольцев (интервал введения препаратов - 21 сутки)
Препарат Концентрация sIgA в мг/мл (M ± m)
0-е сутки 21-е сутки 42-е сутки
Вакцина(n = 40) 18,03 ± 2,39 29,17 ± 4,25 38,57 ± 6,40
Плацебо (n = 10) 19,87 ± 4,86 10,40 ± 1,87 11,95 ± 4,19
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 2 (45)/2009
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 2 (45)/2009
кросс-реактивностью по сравнению с антителами класса ^ [3]. Таким образом, за счет индукции sIgA вакцина Ультрагривак обеспечивает лучшую защиту в месте инфекции и эта защита более кросс-реактивна, чем у вакцинированных добровольцев.
В обеих группах добровольцев, иммунизированных вакциной, и в соответствующих контрольных группах выборочно была произведена оценка активности специфических цитотоксических лимфоцитов (ЦТЛ). Определение ЦТЛ проводилось в реакции ELISPOT ИФН-гамма по традиционному методу. Количество ЦТЛ вычисляли как разницу между средними значениями количества ИФН-гамма-продуцирующих клеток (количества спотов) в лунках со стимуляцией пулом пептидов и количеством ИФН-гамма-продуцирующих клеток в лунках без стимуляции. Из полученных данных вычисляли количество ЦТЛ в 1 млн лимфоцитов. Наличие формирования Т-клеточного иммунного ответа регистрировали в том случае, если количество ИФН-гамма-продуцирующих клеток, вызванное стимуляцией пулом пептидов, превышало среднее значение данной величины в контрольной группе и значение до вакцинации не менее чем в три раза. На основании полученных данных можно утверждать, что в группах добровольцев, привитых вакциной двукратно с интервалом введения 10 суток и 21 сутки, были индуцированы специфические ЦТЛ. Индукция ЦТЛ проходила как после первой вакцинации, так и после второй. В группе плацебо специфические ЦТЛ не индуцировались. Индукция специфических ЦТЛ является очень важной линией защиты от гриппозной инфекции, и, согласно литературным данным, наиболее перспективны гриппозные вакцины, которые способны индуцировать максимально разнообразный спектр специфических ЦТЛ (как CD4+, так и CD8+ типов) [2]. Показано также, что клеточный иммунитет лучше коррелирует с протекцией от гриппа по сравнению с гуморальным иммунитетом [7].
Оценку гуморального иммунитета проводили по данным исследования сывороточных проб, взятых у добровольцев на 0-е, 10-е и 31-е сутки после вакцинации (интервал введения - 10 суток) и на 0-е, 21-е и 42-е сутки (интервал введения - 21 сутки). Иммуногенные свойства вакцины оценивали по следующим критериям:
• уровень сероконверсии (процент лиц с четырехкратным и более увеличением уровня титров антител по сравнению с исходным);
• среднее геометрическое титров антител;
• фактор сероконверсии (кратность прироста среднего геометрического титров антител (СГТ) по сравнению с исходным значением СГТ).
Для оценки иммуногенности вакцины в РТГА использовали гомологичный штамм А/17/Утка/ Потсдам/86/92 ^N2).
Для оценки кросс-реактивности вакцины в РТГА применяли три гетерологичных штамма вируса гриппа птиц серотипа А(H5N1): А^е1:пат/1194/2004, А/Indonesia/5/2005 ^N1) и А/Chicken/Suzdalka/ Nov-11/2005. Сравнительная оценка иммуногенности вакцины Ультрагривак против гомологичного штамма А/17/Утка/Потсдам/86/92 ^N2) и гетерологичного высокопатогенного российского эпидемического штамма А/Chicken/Suzdalka/Nov-11/2005 проводилась на базе ФГУН «ГНЦ ВБ «Вектор» в условиях BSL-2 (2-й класс биологической защиты).
В группах лиц, привитых плацебо, сероконвер-сии не наблюдались, среднее геометрическое до вакцинации и после вакцинации оставалось на одном уровне при введении вакцины с интервалом как в 10 суток, так и в 21 сутки.
Кроме изучения кросс-реактивности вакцины Ультрагривак со штаммами А^е1:пат/1194/2004 ^N1) и А/Indonesia/5/2005 ^N1), которые являются непатогенными реассортантами, был проведен сравнительный анализ ее кросс-реактивности
Таблица 4.
Сравнительная оценка иммуногенных свойств вакцины Ультрагривак в РТГА
со штаммами А/17/Утка/Потсдам/86/92 (H5N2), А^їетат/1194/2004 (Н5^) и А/Шопе^а/5/2005 ^N1)
Штамм, используемый для постановки РТГА Показатели Интервал введения 10 дней Интервал введения 21 день
10-е сутки 31-е сутки 21-е сутки 42-е сутки
А/17/Утка/Потсдам/86/92 ^N2) Уровень сероконверсии 58,9 74,3 52,4 71,9
СГТ 19,0 29,6 16,0 28,7
Фактор сероконверсии 3,1 4,9 2,9 5,2
А/Ме№ат/1194/2004 (Н5Ш) Уровень сероконверсии 51,3 74,4 30,5 51,2
СГТ 15,5 25,9 10,6 15,8
Фактор сероконверсии 2,8 4,7 2,0 2,9
А/Indonesia/5/2005 (Н5Ш) Уровень сероконверсии 64,1 71,8 42,7 59,8
СГТ 17,0 24,0 12,8 18,7
Фактор сероконверсии 3,1 4,4 2,9 3,5
с высокопатогенным российским изолятом А/Chicken/Suzdalka/Nov-11/2005. Данные анализа представлены в таблицах 4 и 5.
В группах лиц, привитых плацебо, сероконвер-сии не наблюдались, фактор сероконверсии равнялся нулю, среднегеометрическое значение титров антител оставалось на одном уровне.
Анализируя полученные данные по изучению гуморального иммунитета, можно сделать вывод, что вакцина Ультрагривак, приготовленная на основе штамма А/17/Утка/Потсдам/86/92 ^N2), способна индуцировать у вакцинированных добровольцев высокий уровень гуморального иммунитета как против гомологичного штамма А/17/Утка/Потсдам/86/92 ^N2), так и против гетерологичных штаммов птичьего гриппа различных клайдов и субклайдов серотипа А(H5N1), а именно А^е1:пат/1194/2004 (клайд 1), А/ Indonesia/5/2005 (субклайд 2-1) и А/СЫскеп/ Suzdalka/Nov-11/2005 (субклайд 2-2). Сравнивая приведенные результаты с результатами, полученными американскими специалистами в ходе клинических исследований, можно сделать вывод, что вакцина Ультрагривак способна индуцировать более высокий уровень гуморального иммунитета против серотипов А(H5N1) и А(H5N2), чем прототипы живых гриппозных вакцин, произведенных американской фирмой Medimmune [4, 5]. Особенное значение имеет то, что вакцина Ультра-гривак, приготовленная с использованием штамма А/17/Утка/Потсдам/86/92 ^N2), проявила высокую степень кросс-реактивности в отношении российского эпидемического изолята А/СМскеп/ Suzdalka/Nov-11/2005, который относится к суб-клайду 2-2. Дело в том, что на территории Российской Федерации эпизоотии домашней и дикой птицы вызываются, как правило, вирусами птичьего гриппа именно этого субклайда. Поэтому можно утверждать, что вакцина Ультрагривак, приготовленная с использованием штамма А/17/Утка/ Потсдам/86/92 ^N2), способна защитить население России от возможной пандемии, вызванной вирусами серотипа H5N1. Следует отметить, что очень высокий (почти 100%-ный) уровень кросс-
реактивности штамма А/17/Утка/Потсдам/86/92 ^N2) со штаммами А^е1:пат/1194/2004 (клайд 1) и А/Indonesia/5/2005 (субклайд 2-1) в составе вакцины Ультрагривак существенно отличается от такового в составе инактивированной гриппозной вакцины АвиФлю (данные в печати). Полученные результаты согласуются с литературными данными о гетеросубтипической иммуноген-ности живых гриппозных вакцин [1]. Возможно, это связано с тем, что в процессе вакцинации живыми гриппозными вакцинами механизм индукции про-тективного иммунитета принципиально другой, чем при вакцинации инактивированными гриппозными вакцинами.
В результате проведенных экспериментов было убедительно показано, что 10-дневный интервал между вакцинациями вполне достаточен для образования протективного иммунитета у вакцинированных добровольцев. Для инактивированных вакцин интервал между двумя иммунизациями составляет 28 суток, поэтому интервал между иммунизациями 10 суток является большим преимуществом вакцины Ультрагривак.
На основании проведенных исследований можно сделать следующие выводы:
1. Местные реакции у вакцинированных добровольцев были представлены катаральными явлениями в носоглотке, носили слабовыра-женный транзиторный характер и исчезали через 1 - 2 суток, а системные реакции отсутствовали.
2. Результаты клинического и биохимического анализа крови и общего анализа мочи в процессе наблюдения и обследования не претерпели существенных изменений относительно нормальных значений. Уровни сывороточных иммуноглобулинов классов А, G, М и Е сохранялись в пределах исходных значений у всех добровольцев в течение всего периода исследования.
3. Получены положительные данные о выделяемо-сти вируса из носовых ходов привитых, что свидетельствует о хорошей приживаемости вакцины. Общее количество полученных реизолятов соста-
Таблица 5.
Сравнительная оценка иммуногенных свойств вакцины в РТГА
со штаммами А/17/Утка/Потсдам/86/92 (H5N2) и А/Chicken/Suzdalka/Nov-11/2005
Показатели Штамм, используемый Интервал введения 10 дней Интервал введения 21 день
для постановки РТГА 10-е сутки 31-е сутки 21-е сутки 42-е сутки
Уровень сероконверсии 62,5 85,0 52,4 71,9
СГТ А/17/Утка/Потсдам/86/92 ^N2) 23,4 44,4 13,4 30,3
Фактор сероконверсии 3,9 7,4 2,5 5,7
Уровень сероконверсии 27,5 57,5 27,5 42,5
СГТ А/Chicken/Suzdalka/ Nov-11/2005 10,3 15,5 6,4 12,1
Фактор сероконверсии 2,4 3,8 2,4 4,4
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 2 (45)/2009
Эпидемиология и Вакцинопрофилактика № 2 (45)/2009
вило 111 из носовой полости 80 добровольцев, двукратно вакцинированных с интервалом 10 или 21 сутки. Для выделения вакцинного вируса потребовалось два-три пассажа на чувствительных культурах клеток, что говорит о крайне незначительном содержании вируса в мазках из полости носа привитых и может свидетельствовать о безопасности вакцины для окружающих.
4. Генетическая стабильность реизолятов вакцинного вируса, полученного на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 ^N2) с использованием апатогенного вируса гриппа птиц H5N2, продемонстрирована молекулярнобиологическими методами, что является существенной гарантией безопасности применения вакцинного штамма А/17/Утка/Потсдам/86 /92 ^N2) на людях.
5. Таким образом, изучение безвредности вакцины на добровольцах независимо от интервала введения (10 или 21 сутки) показало, что вакцина обладает хорошей переносимостью, низкой реактогенностью, генетической стабильностью и безопасностью для окружающих.
6. Местный иммунный ответ, судя по повышенному уровню секреторного ^А в назальных смывах вакцинированных волонтеров, индуцировался как после первой, так и после второй вакцинации добровольцев в обеих группах (интервал введения - 10 и 21 сутки).
7. При изучении специфического клеточного иммунитета показано, что у большинства вакцинированных добровольцев происходило образование специфических цитотоксических Т-лимфоцитов, вне зависимости от интервалов ревакцинации (10 или 21 сутки).
8. На основании результатов изучения гуморального иммунитета можно утверждать, что вак-
цина Ультрагривак, приготовленная с использованием штамма А/17/Утка/Потсдам/86/92 (H5N2), способна индуцировать высокий уровень гуморального иммунитета не только в отношении гомологичного вакцинного штамма, но и в отношении других, гетерологич-ных штаммов вируса гриппа птиц серотипа А(H5N1), в частности А^еШат/1194/2004 (клайд 1), А/Indonesia/5/2005 (субклайд 2-1) и А/Chicken/Suzdalka/Nov-11/2005 (суб-клайд 2-2).
9. Вакцина Ультрагривак способна индуцировать у вакцинированных людей сразу три уровня протективного иммунитета, а именно секреторный местный, специфический клеточный (ЦТЛ) и гуморальный. Инактивированные предпан-демические вакцины способны индуцировать у иммунизированных добровольцев только гуморальный иммунитет. Поэтому вакцина Ультра-гривак в этом отношении имеет большое преимущество перед инактивированными предпан-демическими вакцинами.
10. На основании анализа результатов изучения местного, специфического клеточного и гуморального типов иммунитета можно уверенно утверждать, что интервал между вакцинациями 10 суток уже вполне достаточен для обеспечения высокого уровня протективного иммунитета.
11. Высокая иммуногенность вакцины Ультрагри-
вак, произведенной с использованием вакцинного штамма А/17/Утка/Потсдам/86/92 ^N2), позволяет утверждать, что в настоящее время это единственная в мире живая гриппозная вакцина, способная обеспечить протек-тивный иммунитет против различных вирусов гриппа птиц серотипа А(H5N1). ■
Литература
1. Dutton R.W., Swain S.L., Woodland D.L. Vaccines against pandemic influenza // Viral Immunology. 2007; 20: 326, 327.
2. He X.S., Holmes T.H., Mahmood K. et al. Phenotytic changes In influenza-specific CD8+ T-cells after immunization of children and adults with influenza vaccines // J. Infect Dis. 2008; 197: 803 - 811.
3. Ichinohe T., Iwasaki A., Hasegawa H. Innate sensors of influenza virus: clues to developing better intranasal vaccines // Expert Rev. Vaccines. 2008; 7: 1435 - 1445.
4. Karron R., Callahan K., Luke C., Thumar B. et al. Phase I evaluation of live attenuated H9N2 and H5N1 reassortant vaccines in healthy adults. - 3rd WHO meeting 2007. http://www.who.int/vaccine_research/diseases/ influenza/160207_Karron.pdf
5. Karron R. Clinical evaluation of life attenuated pandemic influenza virus vaccines. - 4th WHO meeting 2008. http://www.who.int/vaccine_re-search/diseases/influenza/Karron_infleunza_meeting_140208.pdf
6. Kieny M.P., Costa A., Hombach J. et al. A global pandemic influenza vaccine action plan // Vaccine. 2006; 24: 6367 - 6370.
7. McElhaney J.E., Xie D., Hager W.D. et al. T-cell responses are better correlates of vaccine protection in the elderly // J. Immunol. 2006; 176: 6333 - 6339.
8. Palkonyay L. Live attenuated influenza vaccines (LAIV) and the Global Challenge of Pandemic influenza: a Call for Review. - WHO meeting 2007. http://www.who.int/vaccine_research/diseases/influenza/meet-ing_intro.pdf
9. Stephenson I. H5N1 vaccines: how prepared are we for a Pandemic? // Lancet. 2006; 368: 965, 966.
10. WHO meeting 12 - 13 June 2007 Summary and meeting documents.
11. http://www.who.int/vaccine_research/deseases/influenza/ meeting_120707/en/index.html
