CC BY
9
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
В ПРОЦЕССЕ РЕПРОГРАММИРОВАНИЯ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ
ФИБРОБЛАСТОВ МЫШИ В ИНДУЦИРОВАННЫЕ ПЛЮРИПОТЕНТНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ НАБЛЮДАЕТСЯ ЭСКПРЕССИЯ СУБЪЕДИНИЦ ИММУНОПРОТЕАСОМЫ
Цимоха А.С.
Цимоха Анна Сергеевна - кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник, Институт цитологии РАН, г. Санкт-Петербург
Аннотация: эмбриональные стволовые клетки и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК) представляют собой не только интересные объекты фундаментальных исследований, но также крайне перспективны для различных прикладных областей медицины, в первую очередь, регенеративной медицины. Несмотря на большой интерес к плюрипотентным клеткам, механизмы поддержания в них белкового гомеостаза с помощью убиквитин-протеасомной системы изучены крайне слабо. Протеасома состоит из коровой 20S и одной или двух регуляторных 19S частиц. При определенных условиях конститутивные каталитические субъединицы 20S коровой частицы betal, beta2 и beta5 могут замещаться на особые субъединицы - beta1i(LMP2), beta2i(MECL-1) и beta5i(LMP7). Репрограммирование мышиных эмбриональных фибробластов в иПСК проводилось с помощью активации конструкции OSKM (закодированная в лентивирус полицистронная последовательность факторов Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc) доксициклином. Мы показали, что с 3 дня соматического репрограммирования наблюдается экспрессия субъединиц иммунопротеасом LMP2 и LMP7, которая постепенно сходит на нет к моменту формирования колоний иПСК, что свидетельствует об участии иммунопротеасом в критически важных для репрограммирования ранних этапах образовании иПСК.
Ключевые слова: иммунопротеасома, плюрипотентные стволовые клетки, протеолиз, LMP7.
EXPRESSION OF IMMUNOPROTEASOME SUBUNITS IS OBSERVED IN MOUSE FIBROBLAST REPROGRAMMING TO INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS Tsimokha A.S.
Tsimokha Anna Sergeevna - PhD in Biology, Leading Researcher, INSTITUTE OF CYTOLOGY RAS, SAINT-PETERSBURG
Abstract: етЬгуотс stem cells and induced pluripotent stem cells (iPSCs) are not only interesting objects of fundamental research, but also extremely promising for various applied fields of medicine, primarily, regenerative medicine. Despite the great interest in pluripotent cells, the mechanisms of maintaining protein homeostasis in them using the ubiquitin-proteasome system are extremely poorly understood. The proteasome consists of a 20S core and one or two 19S regulatory particles. Under certain conditions, the constitutive catalytic subunits of the 20S core particle betal, beta2, and beta5 can be replaced by special subunits - betali (LMP2), beta2i (MECL-1), and beta5i (LMP7). Reprogramming of mouse embryonic fibroblasts into iPSCs was carried out using the activation of the OSKM construct (lentivirus encodedpolycistronic sequence of factors Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc) with doxycycline. The expression of immunoproteasome subunits LMP2 and LMP7 starts
from 3 day of somatic reprogramming and then gradually stops by the time of the formation of iPSC colonies, which indicates the role of immunoproteasomes in the early stages of reprogramming that are critical for iPSC formation. Keywords: immunoproteasome; LMP7; pluripotent stem cells; proteolysis.
УДК 576.53
Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) - плюрипотентные культивируемые клетки, получаемые из клеток эпибласта на этапе преимплантационной бластоцисты млекопитающих [1]. ЭСК обладают неограниченным пролиферативным потенциалом, могут поддерживаться в клеточной культуре длительное время, сохраняя свое недифференцированное состояние, и обладают способностью дифференцироваться во все клеточные типы взрослого организма, в том числе в половые клетки. Помимо этого, ЭСК обладают повышенной устойчивостью к повреждениям генома, а также усиленной антиоксидантной защитой, способствующей пониженному образованию активных форм кислорода по сравнению с дифференцированными клетками [2]. ЭСК получили широкое применение в исследованиях ранних этапов эмбриогенеза и при получении химерных животных, а также используются при моделировании заболеваний, в фундаментальных исследованиях функций генов человека и в клеточной терапии заболеваний человека. Однако существует много практических проблем, которые ограничивают использование ЭСК в клеточной терапии человека, главная из которых связана с этическими вопросами использования человеческих эмбрионов для получения ЭСК и иммунным отторжением аллогенных ЭСК при трансплантации в поврежденную ткань пациента. На данный момент, одной из наиболее перспективной области применения плюрипотентных стволовых клеток в клеточной терапии является использование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК). При помощи форсированной экспрессии таких ключевых транскрипционных факторов, как Oct3/4, Sox2, Klf4 и c-Myc стало возможно получение ЭСК-подобных клеток из соматических клеток млекопитающих, в том числе и человека [3]. иПСК схожи с ЭСК во многих аспектах, включая морфологию, способность к активной пролиферации и культивированию, иПСК имеют схожие с ЭСК маркеры плюрипотентности, профиль экспрессии генов, эпигенетический статус, а также иПСК обладают способностью дифференцироваться во все клеточные типы взрослого организма. Получение иПСКв ходе генетического репрограммирования, однако, чревато возникновением генетических и эпигенетических ошибок с последующим злокачественным преобразованием этих клеток [4]. Понимание молекулярных механизмов, задействованных в процессах клеточного репрограммирования, позволит управлять процессами получения иПСК, исключая вероятность образования опухолей.
Поддержание белкового гомеостаза играет одну из ведущих ролей в ПСК, основным способом поддержания которого является работа убиквитин-протеасомной системы (УПС) [5]. Важным компонентом УПС является мультисубъединичный протеолитический комплекс - протеасома . Коровая 20S протеасома содержит 3 конститутивных каталитических субъединицы (ßl (PSMB6), ß2 (PSMB7) и ß5 (PSMB5)), которые обладают каспазоподобной, трипсин-подобной и химотрипсин-подобной активностями и осуществляют разрезание белков по определенным сайтам. При воздействии на клетку медиаторов воспаления, таких как, провоспалительные цитокины или нахождение клетки в окислительном стрессе приводит к замене конститутивных каталитических субъединиц 20S протеасомы (ßl (PSMB6), ß2 (PSMB7) и ß5 (PSMB5)) на индуцибельные каталитические субъединицы: LMP2/ß1i (PSMB9), MECL-1/ß2i (PSMB10) и LMP7/ß5i (PSMB8) и формированию иммунопротеасомы (ИП). Считается, что основная функция ИП заключается в презентации чужеродных антигенов на поверхности клетки в составе главного комплекса гистосовместимости I класса (MHC I). Однако появляется все больше
данных об альтернативных функциях ИП в ПСК [6, 7]. Показано, что в ЭСК человека наблюдается повышенная экспрессия генов ИП по сравнению с дифференцированными клетками, тогда как в ЭСК мыши повышенная экспрессия генов ИП не наблюдается, но она усиливается в начале процесса дифференцировки. Данные результаты указывают на важную роль иммунопротеасом в процессах самообновления и дифференцировки ЭСК. Однако изменение активности и роль субъединиц иммунопротеасом в процессе клеточного репрограммирования остается не изученным.
Для анализа содержания иммуносубъединицы LMP7/p5i в процессе репрограммирования МЭФ была использована первичная система получения иПСК, основанная на применении полицистронной доксициклин-активируемой лентивирусной конструкции О^М, несущей последовательности кДНК четырех транскрипционных факторов, которые способны индуцировать состояние плюрипотентности: Ой4, КН4, Sox2 и с-Мус. В течение репрограммирования МЭФ на 1, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 дни после вирусной трансдукции и добавления доксициклина готовили клеточные экстракты. Также были приготовлены экстракты клеток, которые были подвержены трансдукции репрограммирующей конструкции, но еще не были обработаны доксициклином (0 день). Далее полученные клеточные экстракты оценивались на содержание белков субъединицы иммунопротеасомы LMP7/p5i при помощи вестерн-блот анализа. В качестве положительного контроля был использован экстракт МЭФ, в котором экспрессия синтеза LMP7/p5i индуцировалась добавлением интерферона-гамма (МЭФ/№№). Отрицательным контролем являлись МЭФ без добавления интерферона-гамма (МЭФЛБ^). Для положительного контроля на содержание белка Nanog (одного из фактора плюрипотентности) использовался экстракт, приготовленный из ЭСК мыши. Высокий уровень содержания иммуносубъединицы LMP7/p5i наблюдался на 5 день после вирусной трансдукции и добавления доксициклина, относительно МЭФ без индукции активности иммунопротеасом. В последующие дни репрограммирования уровень содержания белка LMP7/p5i р значительно снижался (Рис. 1). Вестерн-блот анализ выявил содержание белка на поздних стадиях репрограммирования МЭФ.
ШР7
[.оасЛпй Кумасси
Рис. 1. Содержание белков LMP7/в5i и Nanog в процессе репрограммирования МЭФ
Также по окончании репрограммирования МЭФ было произведено иммуноцитохимическое окрашивание полученных клонов иПСК на маркер плюрипотентности Nanog. Иммуноцитохимический анализ также подтвердил
МЭФ МЭФ
ЯРН+ЛРК* 0 1 5 7 9 П 13 »5 17 ЭСК
I
ш
содержание белка Nanog в полученных после репрограммирования клеток, что подтверждает их плюрипотентный статус (Рис. 2).
Рис. 2. Флуоресцентная микрофотография иПСК. 17 день репрограммирования МЭФ, иммуноцитохимическое окрашивание антителами на Nanog. Масштабная линейка - 400
Таким образом, в данной работе мы показали изменение содержания субъединицы
LMP7/p5i в течение процесса репрограммирования МЭФ, что может указывать на
возможную роль ИП в критически важных для репрограммирования ранних этапах
образования иПСК.
Список литературы /References
1. Thomson J.A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S.S., Waknitz M.A., Swiergiel J.J., Marshall V.S., Jones J.M.J. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts // Science, 1998. V. 282. № 5391. P. 1145-1147.
2. Vilchez D., Simic M.S., Dillin A.J. Proteostasis and aging of stem cells// Trends in Cell Biology, 2014. V. 24. № 3. P. 161-170.
3. Takahashi K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors // Cell, 2006. V. 126. № 4. P. 663-676.
4. Yamanaka S. Pluripotent stem cell-based cell therapy—promise and challenges // Cell Stem Cell, 2020. V. 27. № 4. P. 523-531.
5. Choi J., Baek K.-H. Cellular functions of stem cell factors mediated by the ubiquitin-proteasome system // Cellular and Molecular Life Sciences, 2018. V. 75. № 11. P. 19471957.
6. Atkinson S.P., Collin J., Irina N., Anyfantis G., Kyung B.K., Lako M., Armstrong L. A putative role for the immunoproteasome in the maintenance of pluripotency in human embryonic stem cells // Stem Cells, 2012. V. 30. № 7. P. 1373-1384.
7. Hernebring M., Fredriksson A., Liljevald M., Cvijovic M., Norrman K., Wiseman J., Semb H., Nystrom T. Removal of damaged proteins during ES cell fate specification requires the proteasome activator PA28 // Scientific Reports, 2013. V. 3. № P. 1381.
