CC BY
18Морфология. Патология
УДК577.218, 616-08-039.78
УВЕЛИЧЕНИЕ СИНТЕЗА КОЛЛАГЕНА II ТИПА ПРИ ОБЛУЧЕНИИ КУЛЬТУРЫ
МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК НИЗКОИНТЕНСИВНЫМ ЛАЗЕРНЫМ ИЗЛУЧЕНИЕМ ДЛИНОЙ ВОЛНЫ 633 НМ
© 2019 Е.М. Литвинов1, Д.Б. Вчерашний1, К.Н. Жилкин2, П.Н. Румянцев2, А.Г. Пахомов3, С.В. Новосельцев4, И.В. Архипов2, В.Н. Круглов5
1 Физико-технический институт имени А.Ф. Иоффе РАН, Санкт-Петербург 2СПБ ГБУЗ «Городская поликлиника № 107», Санкт-Петербург 3Клиника лазерной хирургии, Санкт-Петербург 4Частная АНО ДПО «Северо-Западная академия остеопатии и медицинской психологии», Санкт-Петербург 5Частное учреждение образовательная организация высшего образования «Медицинский университет «Реавиз», Самара
В данной работе представлены результаты лабороторных экспериментов, в ходе которых было выявлено и проанализировано увеличение экспрессии генов col2a1 в мезенхимальных мультипотентных стромальных клетках (ММСК) костного мозга половозрелой крысы in vitro под воздействием излучения лазера длиной волны 633 нм и мощностью порядка 1,6-1,8 мВт. Это свидетельствует о возможности клинического применения данного типа лазерного излучения для активации процесса регенерации поврежденного слоя гиалинового хряща при заболеваниях различного генеза.
Ключевые слова: лазерное излучение, терапевтический лазер, локальное облучение, хондрогенез, col2a1, ММСК.
Введение. В последние десятилетия отмечается рост заболеваний, обусловленных дегенеративно-деструктивными изменениями гиалинового хряща [1]. Данное явление происходит из-за патологических процессов, приводящих к повреждениям фиброзного кольца, состоящего из фиброзно-хрящевой ткани, либо суставной поверхности в случае суставов конечностей. Причин данного явления много. Среди них имеются как генетические эндогенные факторы, так и крайне низкая способность хрящевой ткани к регенерации [1].
Из-за низкой способности гиалинового хряща к регенерации происходит дальнейшая деградация повреждённого слоя, что в конечном итоге приводит к необходимости высокоинва-зивных лечебных процедур с длительными сроками восстановления [2]. В настоящее время идет разработка новых методов восстановления структуры как хрящевой ткани в целом [3], так и фиброзного кольца [4].
Одним из таких способов является воздействие низкоинтенсивным лазерным излучением на повреждённый участок хрящевой ткани [5]. В травматологии и ортопедии известны малоинвазивные методы воздействия на поверхность суставов при различных заболеваниях [6], целью которых является восстановление поврежденного слоя хрящевой ткани. В работе
[5] описан малоинвазивный метод купирования болевого синдрома при грыжах дисков пояс-нично-крестцового отдела позвоночника воздействием низкоинтенсивного лазерного излучения длиной волны 630 нм и мощностью 3 мВт на область локализации межпозвоночной грыжи без катетеризации эпидурального пространства. Однако, несмотря на имеющиеся положительные лабораторные и клинические результаты, механизмы воздействия, лежащие в основе терапевтического эффекта, до сих пор детально не изучены [7].
Данная работа выполнена в контексте изучения влияния лазерного излучения на молекулярные механизмы, лежащие в основе регенерации хрящевой ткани на примере клеточной модели. Было выявлено и проанализировано увеличение экспрессии гена col2a1 в результате облучения культуры мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток низкоинтенсивным лазерным излучением длиной волны 633 нм.
Материалы и методы исследования. Для лабораторных экспериментов использовалась клеточная модель на основе культуры МСК, выделенная из половозрелых крыс третьего пассажа. Работа с экспериментальными крысами полностью соответствовала всем этическим нормам. Мезенхимальные стволовые клетки выделялись из костного мозга бедренной кости в стерильных условиях и культивировались до 3 пассажа в условиях in vitro (37 °C 5%CO2) на адгезивном пластике (Nunc, USA). После достижения требуемого пассажа, культура высевалась на четыре адгезивные чашки Петри.
В качестве источника излучения использован лазер длиной волны 633 ± 1 нм и мощностью излучения порядка 1,7 ± 1 мВт. Перед началом эксперимента длина волны источника излучения контролировалась на оптическом монохроматоре с точностью до 1 нм. Схема установки облучения клеток представлена ниже на рис. 1.
Рис. 1. Схема установки: 1 - источник излучения, 2 - устройство ввода излучения, 3 - световод, 4 - выход излучения, 5 - чашка Петри, 6 - СО2-инкубатор, 7 - полка инкубатора
Излучение лазера проходит через устройство ввода, в фокусе которого установлен входной торец оптоволокна. На выходе оптоволокна была выставлена мощность излучения порядка 0,8 мВт. По оптоволокну лазерное излучение, через герметичный шлюз, вводится в СО2-инкубатор и направляется на чашки Петри с опытной культурой ММСК. Выход волокна располагался на таком расстоянии от полки инкубатора, чтобы в световое пятно одновременно попадали две чашки Петри с культурой клеток. Облучение выполнялось интервалами по 15 мин в час в течение 7-ми суток.
В ходе эксперимента, две из четырех чашек Петри с культурой клеток подвергались лазерному облучению по указанной выше схеме, а другие две чашки содержались в аналогичных условиях, но без облучения. Таким образом, были сформированы основная и контрольная группы наблюдений. По прошествии семи суток наблюдение прекращалось, а образцы помещались при температуре -80 оС. После чего из клеточной культуры выделялась РНК и ставилась RT-PCR для определения увеличения экспрессии гена со12а1, путём измерения разности циклов выхода по сравнению с геном «домашнего хозяйства» в каждой группе. В каждой группе наблюдения было два независимых образца, результаты в которых усреднялись.
Результаты и их обсуждение. Как в контрольной, так и в опытной группе, по окончании семи суток была выделена РНК, поставлена реакция обратной транскрипции с выделением кДНК, а также успешно проведена процедура RT-PCR. По результатам оценки относительного увеличения экспрессии гена со12а1 по сравнению с геном «домашнего хозяйства» был зафиксирован рост экспрессии данного гена более чем в 6 раз по сравнению с контрольной группой.
Полученный результат свидетельствует о том, что низкоинтенсивное лазерное излучение оказывает воздействие на клеточную регуляцию и приводит к увеличению экспрессии гена со12а1. По видимому, данный факт приводит к увеличению синтеза белков внеклеточного матрикса, среди которых коллаген II типа играет одну из важнейших ролей. Однако конкретные молекулярные механизмы, ответственные за данный факт, пока остаются неизвестными.
С точки зрения практического применения, результат данного лабораторного эксперимента согласуется с клиническим опытом воздействия данного типа излучения на область дегенеративных изменений межпозвоночного диска. У опытной группы пациентов [5] было отмечено купирование локального болевого синдрома в пояснично-крестцовой области, исчезновение симптома Ласега, восстановление чувствительности в сегментах. Отрицательная динамика грыжеобразования в течение пяти лет не зафиксирована (р < 0,05). Увеличение экспрессии гена со12а1 и наличие положительного клинического эффекта в среднесрочной перспективе свидетельствует, на наш взгляд, об увеличении трансляции, то есть, синтеза белка со12а1, а также, возможно, и других белков внеклеточного матрикса. Известны случаи использования лазерного излучения при лечении повреждений поверхностного слоя гиалинового хряща суставов конечностей [8].
На основании всего вышесказанного целесообразным представляется дальнейшее, более глубокое изучение данного вопроса с целью разработки перспективных малоинвазивных методик лечения.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1 Божокин М.С., Божкова С.А., Нетылько Г.И. Возможности современных клеточных технологий для восстановления поврежденого суставного хряща (аналитический обзор литературы) // Травматология и ортопедия России. - 2016. - Т. 22. - № 3. - С. 122-134.
2 Божокин М.С., Божкова С.А., Нетылько Г.И. и др. Морфофункциональная характеристика хондрорегенера-торного процесса в экспериментальном локальном дефекте поверхности суставного хряща // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - 2017. - № 8-2. - С. 302-306.
3 Божокин М.С., Божкова С.А., Нетылько Г.И. и др. Результаты замещения поверхностного дефекта гиалинового хряща крысы клеточно-инженерной конструкцией в эксперименте // Труды Карельского научного центра Российской академии наук. - 2018. - № 4. - С. 13-22.
4 Новосельцев С.В., Малиновский Е.Л. Основы консервативного лечения пациентов с грыжами поясничных межпозвонковых дисков. - СПб.: ООО Изд-во «Фолиант», 2011. - 272с.
5 Пахомов А.Г., Вчерашний Д.Б., Новосельцев С.В., Круглов В.Н. Низкоинтенсивное лазерное излучение в терапии болевого синдрома при грыжах дисков пояснично-крестцового отдела позвоночника // Вестник медицинского института «РЕАВИЗ»: реабилитация, врач и здоровье. - 2018. - № 3 (33). - С. 26—31.
6 Берглезов М.А., Вялько В.В., Угнивенко В.И. Методы инвазивной лазеротерапии в травматологии и ортопедии: метод. рекомендации. - М.: Медицина, 1994. - 21 с.
7 Кузьмичев В.Е., Каплан М.А., Чернова Г.В. Биологические эффекты низкоэнергетического лазерного излучения и нелинейное возбуждение биомолекул // Физическая медицина. - 1996. - Т. 5. - № 1-2. - С. 65-69.
8 Москвин С.В., Буйлин В.А. Основы лазерной терапии. - М. - Тверь: Триада, 2006. - 256 с.
Рукопись получена: 8 июля 2019 г. Принята к публикации: 17 июля 2019 г.
