CC BY
26
УДК 630.232+631.527+ 631.523+582.47
УТОЧНЕНИЕ СХЕМ ПОСАДКИ АРХИВОВ КЛОНОВ ХВОЙНЫХ ВИДОВ КРАСНОЯРСКОГО КРАЯ И РЕСПУБЛИКИ ХАКАСИИ RAPD-МЕТОДОМ
АНАЛИЗА ДНК
И.В. Чубугина12, А.А. Ибе1, К.О. Дейч1,3, Е.А. Шилкина 1
1 Филиал ФБУ «Рослесозащита» Центр зашиты леса Красноярского края 660036 Красноярск, Академгородок, 50 2 Сибирский федеральный университет, Красноярск 3 Институт леса им. В.Н. Сукачева СО РАН, Красноярск
В работе рассматривается применение генетических методов анализа для уточнения схем плантаций архивов клонов сосны кедровой сибирской (Pinus sibirica Du Tour.) и лиственницы сибирской (Larix sibirica L.). Генетическая идентификация клонов с соответствующими плюсовыми деревьями осуществлялась RAPD-методом анализа ДНК. Выявлено, что на первом блоке архивно-маточной плантации сосны кедровой сибирской Западно-Саянского опытно-лесного хозяйства согласно схеме посадки расположено 97,7 % клонов, на втором и третьем блоках - 87,9 % и 67,2 % соответственно. Уточнение схем по блокам 4 и 5, а также архив сосны кедровой сибирской в Абазинском лесничестве и лиственницы сибирской в Усть-Бюрском лесничестве требуют более точного анализа с применением SSR-маркеров.
Ключевые слова: сосна кедровая сибирская, лиственница сибирская, архив клонов, генетическая идентификация клонов, RAPD-анализ
The clarification of Pinus sibirica and Larix sibirica clones archive’s scheme in Krasnoyarskiy region and Khakassia Republic were carried out. The genetic identification of clones with there plus trees were made by RAPD-method of DNA analyse. It was observed that in first part of cedar clones archive plantation in Ermakovskiy region there are 97,7 percent of clones match to scheme, in second and third parts of plantations - 87,9 % u 67,2 % accordingly. The match of other plantations schemes requires the more exact DNA analyze of clones with SSR-markers.
Key words: Cedar, Siberian larch, clones archive, genetic identification of clones, RAPD-analyze
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время с целью осуществления плюсовой селекции на повышение продуктивности, качества и устойчивости создаваемых лесов (Указания по лесному..., 2000), во всех регионах России по основным лесообразующим видам древесных растений создано множество объектов единого генетикоселекционного комплекса (ЕГСК). В том числе выделены плюсовые деревья по комплексу хозяйственно важных признаков и созданы архивы клонов - насаждения, создаваемые клонами (вегетативным потомством) плюсовых деревьев в целях сохранения их генотипов, изучения и оценки наследственных свойств по общей и специфической комбинационным способностям сохранять в семенном потомстве ценные селектируемые признаки.
Кедр сибирский и лиственница сибирская являются наиболее ценными лесообразующими древесными породами таежной зоны и занимают особое место в экосистемах Сибири. Генофонд этих ценных хвойных видов, как совокупность наследственного материала, обеспечивающего адаптацию к широкому спектру климатических условий и продуктивность насаждений, является ценным генетическим ресурсом (Петрова, Горошкевич, 2008; Биоразнообразие лиственниц., 2010). В Красноярском крае и Республике
Исследования были проведены в рамках выполнения научно-исследовательской работы «Генетические исследования лиственницы сибирской» по тематическому плану Сибирского федерального университета
Хакасии с 1989 г. ведутся работы по созданию архивов клонов плюсовых деревьев сосны кедровой сибирской и лиственницы сибирской (табл. 1).
Однако в производственных условиях добиться соответствия фактического расположения прививок составленной схеме крайне затруднительно. Проверка схем закладки плантаций на соответствие заявленным генотипам плюсовых деревьев можно проводить по фенотипическим признакам (Федорков, 2004; Каль-ченко, Тараканов, 2010). Однако такой метод неточен, и однозначный ответ может дать только генетический анализ.
Целью данной работы было проведение уточнения схем фактического размещения клонов в архивах сосны кедровой сибирской и лиственницы сибирской, представленных на территории Красноярского края и республики Хакасии путем генетической идентификации и сравнения прививок с соответствующими плюсовыми деревьями.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В течение 2010-2011 гг. сотрудниками отдела генетики и селекции ЦЗЛ Красноярского края были отобраны образцы хвои и древесины плюсовых деревьев и их клоновых прививок с трех аттестованных архивов клонов Красноярского края и республики Хакасии (см. табл. 1).
Некоторые характеристики плюсовых деревьев, представленных в архиве клонов сосны кедровой сибирской Ермаковского лесничества в ЗападноСаянском опытно-лесном хозяйстве, приведены в табл. 2.
Таблица 1 - Архивы клонов сосны кедровой сибирской и лиственницы сибирской, представленных на территории Красноярского края и республики Хакасии (по данным филиала ФГУ «Рослесозащита» ЦЗЛ Красноярского края)______________________________________________________________________________________________________
Вид Местоположение архива, лесничество Площадь архива, га Год закладки Количество клонов
Сосна кедровая сибирская Красноярский край, Ермаковское лесничество 12,73 1995 173
Сосна кедровая сибирская Республика Хакасия, Абазинское лесничество 3 1989 25
Лиственница сибирская Республика Хакасия, Усть-Бюрское лесничество Q,5 1997 2б
Таблица 2 - Характеристики плюсовых деревьев сосны Красноярского края и республики Хакасии кедровой сибир ской, представленных на архивах клонов
Лесничество / участковое лесничество Число плюсовых деревьев Средний возраст, лет Средняя высота, м Средний диаметр, см Средняя протяженность бессучковой зоны, % от высоты ствола
Красноярский край: Ермаковское / Большереченское 32 228,4±33,7 3Q,2±3,9 бб,2±13,7 3Q,4±4,2
Ермаковское / 5 117,5±5,Q 24,Q±2,2 57,5±9,Q 24,Q±1,9
Щетинкинское
Ермаковское / 1б 2QQ,9±34,4 32,9±1,5 74,2±8,9 31,2±2,б
Щетинкинское
Саяно-Шушенское / 24 96,Q±34,3 25,9±1,4 54,Q±7,5 24,3±3,3
Субботинское
Усинское / Араданское 42 243,Q±12,7 29,5±2,1 49,8±б,1 29,1±4,7
Республика Хакасия: Абазинское / Абазинское 18 148,9±28,9 22,6±3,Q 41,Q±9,2 2б,3±б,б
Абазинское / Анзаское 2Q 151,1±2Q,6 24,7±3,1 45,9±7,5 25,б±3,б
Абазинское / Онинское 4 18Q,Q±Q,Q 31,3±1,1 4Q,Q±Q,Q 31,5±1,2
Копьевское / Хуторское 3 1б3,3±5,7 23,Q±8,7 46,Q±1Q,4 32,1±5,1
Таштыпское / Верхне-Таштыпское 1 141 3Q,5 б2 3Q,Q
Итого/среднее 1б5 1б7^±4б,7 27,5±3,8 53,7±11,3 28,5±3,1
Образцы хвои прививок и соответствующих плюсовых деревьев собирали с мутовок текущего вегетационного года с каждого архива клонов в бумажные пакеты. Всего было собрано 2400 образцов хвои с прививок архива клонов сосны кедровой сибирской Западно-Саянского ОЛХ, 470 - с архива клонов сосны кедровой сибирской Абазинского лесничества и 181 - с архива клонов лиственницы сибирской Усть-Бюрского лесничества.
Таблица 3 - КАРБ-праймеры, подобранные для генетической идентификации клонов сосны кедровой сибирской и лиственницы сибирской _______
Вид Обозна- че-ние праймера Последова- тельность нуклеотидов tQ С плавления праймера
Сосна 4 caa-acg-gca-c 3б,5
кедровая 12 cfc-aac-ggg-t 34,5
сибирская 1б gcc-cct-cgt-c 42,3
18 caa-tcg-ccg-t 4Q,8
3Q aac-gcg-caa-c 41,4
Лиственница 1б gcc-cct-cgt-c 42,3
сибирская 18 caa-tcg-ccg-t 4Q,8
3Q aac-gcg-caa-c 41,4
91 ccg-aac-ggg-t 4Q,Q
94 gga-cgg-gtg-c 4Q,Q
Собранные образцы хвои в пакетах высушивались в лаборатории до воздушно-сухого состояния при 400С в сухожаровом шкафу. Для вы-
деления ДНК 50 мг хвои каждого образца помещали в пробирки типа Eppendorf. К образцу добавляли 500 мкл буфера СТАВ, прогревали 15 мин при температуре 60°С, растирали стеклянной палочкой в течение 5 мин., добавляли 700 мкл буфера СТАВ. Далее выделение ДНК проводили укороченным CTAB-методом (Падутов, 2007). Чистота выделенной ДНК (А260/А280) составляла в среднем 1,84±0,05. Измерения проводили на спектрофотометре BioRad Smartspec Plus.
Основным недостатком RAPD-анализа является его нестабильная воспроизводимость (Гос-тимкий и др., 1999; Гречко, 2002), поэтому соблюдались определенные требования к подготовке материала и проведению лабораторных анализов исследуемых образцов, позволяющие проводить их сравнение (Kutsev, 2008):
1. Использование материала, собранного в один период;
2. Процесс выделения ДНК максимально стандартизирован для всех исследуемых образцов;
3. Одинаковая концентрация ДНК в амплифи-кационной реакции;
4. ПЦР-реакции проводились в одном амплифи-каторе, для каждого исследуемого клона одновременно ставилась ПЦР-реакция по каждому из пяти подобранных праймеров (с ис-
пользованием одного разведения ПЦР-
смеси), где первым образцом являлось плюсовое дерево, остальные в ряду - его вегетативные прививки, согласно заявленной схеме;
5. Горизонтальный гель-электрофорез проводился также для пяти праймеров по каждому клону одновременно в одинаковых условиях.
1 2 3 4 5 "иНгп "ПпИ ' г * рИ 6 7 8 М 9 10 11 12 13 а трщ„щнттт П П н £ Г1 ‘ Г ■'1 ‘
ЯЯЙВІ -ВЦМЙ вв=||рввв б
н м н
»* и
Г* н М М Н
МИІІ
И п
Ей
ШНЧШ
I ■ и
д
1 2 3 4 5 6 7 8 М 9 10 11 12 13
Рисунок 1 - КАРБ-спектры плюсового дерева сосны кедровой сибирской №181 (1) и его прививок (2-13), заложенных на архиве клонов Западно-Саянского ОЛХ, М- маркер молекулярного веса ДНК, по пяти праймерам: а - №4, б - №12, в - №16, г - №18, д - №30
Для анализа ДНК ЯЛРБ-методом были подобраны следующие наиболее информативные неспецифические праймеры для обеих исследуемых пород (табл. 3).
Амплификация проводилась в 25 мкл смеси (14,6 мкл Н2О; 2 мкл ДНК; 2,5 мкл 10х буфера; 2,5 мкл 25 мМ MgCl2; 2 мкл 10 мМ праймера;
1,2 мкл 20 мМ dNTPs; 0,2 мкл 25 Taq-полимеразы) на термальном циклере Mastercycler (ЕрреМой}. После проведения реакции амплификации образцы окрашивались бромфениловым синим, разделение ампликонов проводили методом горизонтального электрофореза в 1,5 % агарозном геле. После прохождения электрофореза гели окрашивали бромистым этидием, затем помещали на трансиллюминатор и фотографировали с помощью монохромной видеокамеры в проходящем УФ - свете.
Каждый образец амплифицировалиГ по пяти отобранным праймерам, затем полученные фотографии электрофореграмм обрабатывались в программе «Генетическая паспортизация лесосеменных объектов России», разработанной специалистами ФБУ «Рослесозащита», позволяющей проводить сравнение полученных данных.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Исследование архива клонов сосны сибирской кедровой Западно-Саянского ОЛХ показало, что наилучшим по соответствию заявленным генотипам плюсовых деревьев является клоновая плантация первого блока архива.
Для примера на рис. 1 приведены фотографии электрофореграмм двенадцати прививок плюсового дерева №181 (по Госреестру плюсовых деревьев Красноярского края), заложенных в первом блоке плантации. Как видно из приведенных КЛРБ-спектров, в ряду все клоновые прививки соответствуют плюсовому дереву .В программе обработки полученных данных для каждого исследуемого дерева был получен индивидуальный шифр (наличие или отсутствие полосы определенной молекулярной массы), который позволяет проводить сравнение с другими деревьями с точностью до 95 %, при условиях проведения ПЦР-реакции и гель-электрофореза, описанных в экспериментальной части. Таким образом, на плантациях с относительно низким содержанием ошибок сравнение клоновых прививок с соответствующими плюсовыми деревьями в производственных условиях возможно проводить при помощи ЯЛРБ-метода анализа ДНК с высокой достоверностью при относительной простоте и дешевизне метода.
В ходе обработки полученных данных по архиву клонов сосны кедровой сибирской Западно-Саянского ОЛХ нами было обработано первые три блока (табл. 4), произведено уточнение схем этих плантаций с пояснениями и рекомендациями по исправлению ошибок.
г
Таблица 4 - Результаты инвентаризации и генетической идентификации клоновой плантации сосны кедровой сибирской Западно-Саянского ОЛХ___________________________________________________________________________
Показатели № блока(поля)
1 2 3 4 5
Год закладки 1995 1996 -1997 1998-1999 1999 2000
Площадь блока, га 4,25 3,03 1,33 1,8 2,32
Количество клонов 56 42 12 17 46
Количество привитых растений каждого клона, шт. 841 631 277 271 754
Сохранность, % 87,6 85,7 89,9 69,0 89,4
Расположены согласно схемы посадки, % 97,7 87,9 67,2 - -
Как видно из таблицы 4, процент ошибок в архиве значительно возрастает от первого к третьему блоку. На первом блоке из 841 привитого растения нами было обнаружено всего 18 рамет клонов, не соответствующих плюсовому дереву, что составляет 2,3 %. На втором блоке подвоя в десять раз больше: из 631 привитых деревьев - 76 не соответствуют заявленному генотипу плюсового дерева -12,1 % ошибок. На третьем блоке процент ошибки больше уже в пятнадцать раз - из 277 деревьев не
соответствуют схеме 186, и это уже треть плантации - 32,8 %.
При обработке данных 4 и 5 блока архива клонов Западно-Саянского ОЛХ, а также архивов клонов республики Хакасии (сосны кедровой сибирской в Абазинском лесничестве и лиственницы сибирской в Усть-Бюрском лесничестве), обнаружено, что соответствия заявленным генотипам плюсовых деревьев меньше 50 %. В некоторых случаях заявленных клонов не обнаруживается и вовсе.
а
1 2 3 4 5 6 7 8 М 9 10 11 12 13 14 15 16
б
1 2 3 4 5 6 7 8 М 9 10 11 12 13 14 15 16
Рисунок 2 - КАРБ-спектры двух плюсовых деревьев сосны кедровой сибирской и их клонов на пятом блоке архива клонов Западно-Саянского ОЛХ по двум праймерам: а - №4, б - №18; 1 - плюсовое дерево №425, 2-6 - прививки дерева №425, 7 - плюсовое дерево №429, 8-16 - прививки дерева №429, М - маркер молекулярного веса ДНК
Так, на представленных снимках электрофо-реграмм плюсового дерева сосны кедровой сибирской №389 и его вегетативных прививок, представленных на 5 блоке архива клонов Западно-Саянского ОЛХ (рис. 2), видно, что все исследуемые образцы не соответствуют генотипам плюсовых деревьев и между собой также не схожи.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Для решения возникающих спорных моментов при обработке ЯЛРБ-спектров, поскольку, несмотря на высокую разрешающую способность ЯЛРБ-метода, мы не можем сравнивать данные, полученные при проведении разных ПЦР и гель-электрофорезов для поиска возможных клонов на архивах, на лесосеменных плантациях и в случаях, где требуется восстановление утерянных схем плантаций, требуется использование более точного метода анализа ДНК с использованием мик-росателлитных маркеров (88Я).
Метод имеет ряд преимуществ, поскольку помимо его надежности и однозначной трактовки полученных данных, результаты его полностью воспроизводимы при проведении параллельных исследований в различных лабораториях вне зависимости от оборудования, используемых реактивов и условий окружающей среды (Сулимова, 2004; Зеленина и др.. 2006). Кроме того, создание базы данных генотипов плюсовых деревьев по микросателлитным локусам позволит с высокой степенью точности решать не только задачи уточнения схем архивно-маточных плантаций, но и получать уникальные данные о молекулярногенетической структуре выборок плюсовых деревьев, представленных на территории Красноярского края и республики Хакасии.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
Биоразнообразие лиственниц Азиатской России /Отв. ред. С.П. Ефремов, Л.И. Милютин.- Новосибирск: Академ. изд-во «Гео», 2010.- 159 с.
Гостимский, С.А. Использование молекулярных маркеров для анализа генома растений /С .А. Гостимский, З.Г. Ко-каева, В.К. Боброва // Генетика.- 1999.- №11.- С. 1538-1549.
Гречко, В.В. Молекулярные маркеры ДНК в изучении филогении и систематики /В.В. Гречко// Генетика.- 2002.- № 8.- С. 1013-1033.
Зеленина, Д.А. Сравнительное исследование популяционной структуры и определение популяционной принадлежности нерки (Oncorhynchus nerka) Западной Камчатки с помощью RAPD-PCR и анализа полиморфизма микро-сателлитных локусов /ДА. Зеленина, А.М. Хрусталева, А.А. Волкова //Генетика.- 2006.- Т. 42.- № 5.- С. 693-704.
Кальченко, Л.И. Поэтапная паспортизация деревьев на кло-новых плантациях сосны обыкновенной: использование методов фенетики / Л.И. Кальченко, В.В. Тараканов // Хвойные бореальной зоны.- 2010.- № 1-2.- С. 87-90.
Падутов, В.Е. Методы молекулярно-генетического анализа /В.Е. Падутов, О.Ю. Баранов, Е.В. Воропаев. - Минск: Юнипол, 2007.- 176 с.
Петрова, Е.А. Генетические ресурсы 5-хвойных сосен России: комплексное исследование, резервация и использование для целей селекции /Е.А. Петрова, С.Н. Го-рошкевич // Лесохозяйственная информация.- 2008.- № 3-4.- С. 58-60.
Сулимова, Г.Е. ДНК-маркеры в генетических исследованиях: типы маркеров, их свойства и области применения /Г.Е. Сулимова //Успехи современной биологии.- 2004.-№ 3.- С. 260-271.
Указания по лесному семеноводству в Российской Федерации: утв. Федер. службой лесного хозяйства России
11.01.2000. - М., 2000. - 197 с.
Федорков, А. Л. Идентификация клонов плюсовых деревьев сосны на лесосеменной плантации /А.Л. Федорков // Лесное хозяйство. - 2004. - № 1. - С. 38.
Kutsev, M. Population variety of Achnatherum splendens (Trin.) Nevski revealed with use of RAPD-markers / M. Kutsev // Turchaninowia.- 2008.- № 11(4).- P. 86-94.
Поступила в редакцию 27 января 2012 г. Принята к печати 01 марта 2012 г.
