CC BY
76
58
ВЕСТНИК УДМУРТСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
Физиологические исследования
УДК 612.017.1:612-092
Л.В. Бедулева, Н.Н. Абишева, Т.В. Храмова, И.В. Меньшиков
УСТОЙЧИВОСТЬ К РАЗВИТИЮ АУТОИММУННОЙ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ АНЕМИИ У МЫШЕЙ, ВЫЗВАННАЯ ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫМ ВВЕДЕНИЕМ ЭРИТРОЦИТОВ КРЫС И ЦИКЛОСПОРИНА А
Целью работы было исследование эффективности предотвращения развития аутоиммунной гемолитической анемии (АГА) у мышей, вызываемой иммунизацией эритроцитами крыс (ЭК), предварительным введением ЭК в сочетании с циклоспорином А. Обнаружено, что предварительное введение ЭК и циклоспорина А предотвращает развитие аутоиммунной гемолитической анемии у мышей и обеспечивает устойчивость к ней при повторной иммунизации эритроцитами крыс. Обнаружено, что введение циклоспорина А в дозе 75 мг/кг в день в течение 7 дней после иммунизации ЭК формирует толерантность к эритроцитам крыс (неотвечаемость на повторное предъявление), которая сохраняется как минимум 55 дней. Предъявление циклоспорина А в дозе 25 мг/кг в день в течение 5 дней не позволяет сформировать толерантность к эритроцитам крыс, но «нормализует» иммунный ответ против ЭК. Таким образом, для сохранения толерантности к аутоэритроцитам при иммунизации ЭК в модели АГА у мышей требуется либо подавление иммунного ответа против ЭК, либо его развитие по типу «нормального» иммунного ответа.
Ключевые слова: аутоиммунная гемолитическая анемия, циклоспорин А, индуцированная толерантность, ревматоидный фактор.
Одной из ключевых проблем прикладной иммунологии является разработка способов формирования толерантности к чужеродным антигенам и восстановления толерантности к аутоантигенам. В некоторых случаях толерантность к антигенам организма (аутоантигенам) тесно связана с толерантностью к чужеродному антигену. В частности, иммунный ответ против определенных детерминант чужеродных антигенов может вести к потере естественной толерантности и развитию агрессивных аутоиммунных реакций [1]. Толерантность к данным детерминантам чужеродного антигена может предотвратить развитие аутоиммунного заболевания. Мы предполагаем, что иммунодепрессант циклоспорин А (ЦсА), отличительной особенностью которого является способность специфически су-прессировать иммунный ответ и при определенных условиях формировать толерантность [2; 3], может быть использован для индукции толерантности к антигенам-индукторам аутоиммунных заболеваний и предотвращения развития вызываемых ими аутоиммунных заболеваний. Удобной моделью для исследования является аутоиммунная гемолитическая анемия у мышей, вызываемая иммунизацией эритроцитами крыс. Механизм развития аутоиммунной реакции в данной модели подобен механизму развития аутоиммунных реакций при ВИЧ-инфекции [1] и других аутоиммунных заболеваниях. Целью работы было исследование эффективности циклоспорина А для формирования специфической толерантности к ЭК и предотвращения развития аутоиммунных реакций в модели аутоиммунной гемолитической анемии у мышей.
Материалы и методика исследований
Было проведено две серии экспериментов. В первой серии мыши СВА массой 20-25 г были поделены на две группы. Группа 1, n=44, была иммунизирована эритроцитами крысы (ЭК) и получала инъекции циклоспорина А (Сандиммун-Неорал, Новартис). Группа 2, n=44, была иммунизирована эритроцитами крысы. ЭК вводили однократно внутрибрюшинно в дозе 2,9*108 клеток. Циклоспорин А вводили в дозе 75 мг/кг подкожно ежедневно в течение 7 дней (схема I), включая день иммунизации ЭК. Через 55 дней после начала эксперимента мышей обеих групп иммунизировали ЭК повторно в той же дозе. Во второй серии белые беспородные мыши массой 20-25 г также были поделены на две группы. Группа 3, n=44, была иммунизирована ЭК и получала инъекции циклоспорина А. Группа 4, n=48, была иммунизирована эритроцитами крысы. ЭК вводили внутрибрюшинно в дозе 2,5*108 клеток. Циклоспорин А вводили в дозе 25 мг/кг подкожно ежедневно в течение 5 дней (схема II), включая день иммуни-
зации ЭК. Через 45 дней после начала эксперимента мышей повторно иммунизировали ЭК. Кровь забирали методом декапитации каждые 5 дней. Определяли количество эритроцитов в крови. В плазме крови определяли уровень антител к ЭК, аутоантител к эритроцитам мыши, РФ. Антитела к ЭК определяли в реакции прямой гемагглютинации, аутоантитела к эритроцитам мыши - непрямым методом Кумбса. РФ определяли методом агглютинации танизированных нагруженных IgG мыши эритроцитов. Для оценки достоверности различий был использован критерий Манна-Уитни.
Результаты и их обсуждение
Иммунный ответ против ЭК у мышей, иммунизированных ЭК и получивших вместе с иммунизацией циклоспорин А. На рис. 1 видно, что ЦсА, предъявляемый вместе с антигеном, супрес-сирует первичный иммунный ответ против ЭК, при этом ЦсА, применяемый по схеме I (75 мг/кг ежедневно в течение 7 дней), более эффективно подавляет развитие иммунного ответа против ЭК, чем по схеме II (25 мг/кг ежедневно в течение 5 дней). В обеих сериях экспериментов иммунный ответ против ЭК у мышей, получавших ЦсА (группа 1 и 3), завершается, тогда как у мышей, иммунизированных ЭК (группа 2 и 4), уровень антител против ЭК остается на высоком уровне даже через 45-55 дней после иммунизации.
Рис. 1. Кинетика антител против ЭК у мышей, иммунизированных ЭК и получивших вместе с иммунизацией циклоспорин А. Каждая точка представлена средним от 4 животных ±SE
После повторной иммунизации эритроцитами крыс у мышей, получивших при первичной иммунизации ЦсА по схеме I (группа 1), антитела к ЭК не обнаруживаются. У контрольных животных в этой серии экспериментов после повторной иммунизации ЭК (группа 2) уровень антител к ЭК снижается. Так как на фоне снижения уровня антител к ЭК происходит падение количества эритроцитов крови (рис. 2), можно предполагать, что снижение уровня антител к ЭК вызвано повышением связанных с ними в идиотипических взаимодействиях аутоантител к эритроцитам. Неожиданным оказалось то, что у мышей, предварительно получивших ЦсА по схеме II (группа 3), наблюдается сильный вторичный иммунный ответ против ЭК. Уровень антител к ЭК у этих мышей в ходе вторичного иммунного ответа выше, чем у контрольных (группа 4), у которых вторичная иммунизация эритроцитами крыс не вызвала изменения уровня антител к ним, оставшегося на высоком уровне после первичного иммунного ответа. Таким образом, предъявление циклоспорина А в период индукции иммунного ответа против ЭК супрессирует продукцию антител против ЭК в ходе первичного иммунного ответа. Отсутствие вторичного иммунного ответа при реиммунизации эритроцитами крыс у мышей, получивших циклоспорин А по схеме 75 мг/кг в день в течение 7 дней, указывает на то, что ЦсА не только
супрессирует продукцию антител к ЭК, а индуцирует толерантность к данному антигену, которая сохраняется как минимум 55 дней. Применение циклоспорина А по схеме 25 мг/кг в день в течение 5 дней супрессирует продукцию антител к ЭК, но не позволяет сформировать толерантность к ним.
Аутоиммунная реакция против эритроцитов у мышей, иммунизированных эритроцитами крыс и получивших вместе с иммунизацией циклоспорин А. Результаты определения количества эритроцитов в крови мышей представлены на рис. 2. У мышей, получивших вместе с иммунизацией эритроцитами крыс ЦсА по схеме I (группа 1), анемии при первичном иммунном ответе не выявлено. У мышей, получивших ЦсА по схеме II (группа 3), наблюдается снижение количества эритроцитов в крови, однако менее длительное и глубокое, чем у контрольных животных, развивших анемию в ответ на иммунизацию ЭК (группа 4). Повторная иммунизация ЭК мышей, получивших при первой иммунизации ЦсА как по схеме II, так и по схеме I, не вызывает анемию (рис. 2), тогда как повторная иммунизация ЭК мышей контрольных групп (группы 2 и 4) приводит к глубокому снижению количества эритроцитов в крови. Таким образом, введение ЦсА в ходе индукции иммунного ответа, вызванного иммунизацией эритроцитами крыс, предотвращает развитие аутоиммунной гемолитической анемии не только непосредственно после введения ЦсА, но и обеспечивает устойчивость к развитию АГА при повторном предъявлении ЭК. Применение ЦсА в дозе 75 мг/кг в день в течение 7 дней более эффективно формирует устойчивость к АГА.
Рис. 2. Количество эритроцитов в крови мышей, иммунизированных ЭК и получивших вместе с иммунизацией циклоспорин А. Каждая точка представлена средним от 4 животных ±SE
Как видно на рис. 1 и 2, отсутствие анемии при реиммунизации ЭК наблюдается как в случае сильного вторичного иммунного ответа против ЭК (группа 3, получавшая ЦсА по схеме II), так и при его отсутствии (группа 1, получавшая ЦсА по схеме I). Почему сильный вторичный иммунный ответ против ЭК в данных экспериментальных условиях не является патологическим - не вызывает развитие анемии? Анализируя кинетику иммунного ответа против ЭК (рис. 1) у мышей, получивших ЦсА по схеме II, можно видеть, что продукция антител против ЭК носит характер «нормального» иммунного ответа против чужеродного антигена, когда первичный иммунный ответ слабый и завершающийся, а вторичный более быстрый и интенсивный. У контрольных животных (группа 4) иммунный ответ против ЭК, сопровождающийся анемией, принципиально отличен. Первичный иммунный ответ против ЭК не завершается, и уровень антител к ЭК не меняется при повторном предъявлении антигена (рис. 1). Таким образом, ЦсА, применяемый по схеме 25мг/кг в день в течение 5 дней, «нормали-
зует» иммунный ответ против ЭК. Для сохранения толерантности к аутоэритроцитам в ответ на иммунизацию ЭК в модели АГА у мышей требуется либо подавление иммунного ответа против ЭК, либо его развитие по типу «нормального» иммунного ответа.
Уровень аутоантител у мышей, получивших ЦсА по схеме II (группа 3), при первичном иммунном ответе ниже, чем у контрольных животных (группа 4) (рис. 3).
Рис. 3. Кинетика аутоантител против эритроцитов у мышей, иммунизированных ЭК и получивших вместе с иммунизацией циклоспорин А. Каждая точка представлена средним от 4 животных ±SE
У мышей, получивших ЦсА по схеме I (группа 1), аутоантитела к эритроцитам не обнаруживаются, что согласуется с отсутствием анемии. Вторичная иммунизация ЭК не вызывает повышения уровня аутоантител у мышей, которым при первичной иммунизации вводили ЦсА как по схеме I, так и по схеме II (рис. 3). У мышей контрольной группы 2 в ходе вторичного иммунного ответа и контрольной группы 4 как в ходе первичного, так и вторичного иммунного ответа, не выявлено аутоан-тител против эритроцитов, несмотря на яркую анемию (рис. 3). Несовпадение между анемией и уровнем аутоантител к эритроцитам, определяемых методом Кумбса, - известный феномен [4]. Поэтому уровень аутоантител к эритроцитам, определяемый непрямым методом Кумбса, не может являться объективным критерием при оценке эффективности подавления аутоиммунной реакции в модели АГА у мышей.
Роль ревматоидного фактора в супрессии иммунного ответа, вызванного циклоспорином А, в модели АГА у мышей. Результаты определения уровня ревматоидного фактора (РФ) в плазме мышей показаны на рис. 4.
В эксперименте 1 (группа 1 и группа 2) у всех мышей обнаруживается исходно высокий уровень РФ, который в ходе иммунного ответа у контрольных и опытных животных остается на высоком уровне. Известно, что РФ может мешать определению аутоантител [5]. Поэтому отсутствие аутоантител к эритроцитам у контрольных животных (рис. 3) при наличии у них анемии (рис. 2) может быть связано с недоопределением аутоантител на фоне высокого уровня РФ в крови.
В отличие от мышей, использованных в эксперименте 1, у мышей в эксперименте 2 уровень РФ до иммунизации низкий или не определяется. В ответ на иммунизацию ЭК повышение РФ выявлено только у мышей, получивших ЦсА при иммунизации эритроцитами крыс (группа 3), у мышей контрольной группы (группа 4) иммунизация ЭК не вызвала повышения уровня РФ.
Ранее нами была показана роль РФ в идиотипической регуляции АГА у мышей [6]. Кроме того, в исследованиях на модели коллаген-индуцированного артрита у крыс было выявлено, что толерантность к антигену индуктору аутоиммунного заболевания, формируемая ЦсА, опосредована РФ [7]. Менее
глубокое и длительное снижение количества эритроцитов в крови у мышей, получивших циклоспорин А (группа 3), по сравнению с контрольными животными во 2-й серии экспериментов (рис. 2) также может быть связано с продукцией РФ. На первый взгляд данному предположению противоречит факт -развитие анемии на фоне высокого РФ в крови у мышей контрольной группы (группа 2) в серии экспериментов 1 (рис. 4). В то же время видно, что у данных мышей высокий уровень РФ в ходе иммунного ответа обнаруживается также и до введения антигена и не является результатом иммунизации, тогда как у мышей опытной группы (группа 3) во второй серии экспериментов РФ появляется в ответ на иммунизацию.
первичная иммунизация (группа 3 и 4) (группа 1 и 2)
вторичная иммунизация
+ ЭК+ЦсА 75 мг/кг, 7 дней (группа 1, п=44) — ЭК+ЦсА 25 мг/кг, 5 дней (группа 3, п=48) - * ЭК (группа 2, п=44) (группа 4, п=48)
Рис. 4. Кинетика РФ у мышей, иммунизированных ЭК и получивших вместе с иммунизацией циклоспорин А. Каждая точка представлена средним от 4 животных ±SE
Возможно, что пул РФ у мышей в первой серии экспериментов и второй серии различен. РФ, присутствующий в сыворотке животных до иммунизации, может быть разнообразен по специфичности, тогда как РФ, индуцируемый в ходе иммунизации эритроцитами крыс, специфичен к идиотипам антител и лимфоцитов против ЭК. Поэтому в первом случае (группа 1 и 2) ревматоидный фактор не принимает участие в регуляции аутоиммунной реакции к эритроцитам, во втором (группа 3) - су-прессирует ее.
Выводы
Введение циклоспорина А в дозе 75 мг/кг в день в течение 7 дней после иммунизации ЭК формирует толерантность к эритроцитам крыс (неотвечаемость на повторное предъявление), которая сохраняется как минимум 55 дней. Предъявление циклоспорина А в дозе 25 мг/кг в день в течение 5 дней «нормализует» иммунный ответ против ЭК. Предварительное введение ЭК и циклоспорина А обеспечивает устойчивость к развитию аутоиммунной гемолитической анемии у мышей при повторной иммунизации эритроцитами крыс. Для сохранения толерантности к аутоэритроцитам в ответ на иммунизацию ЭК в модели АГА у мышей требуется либо подавление иммунного ответа против ЭК, либо его развитие по типу «нормального» иммунного ответа.
Благодарности
Работа поддержана грантами Министерства образования и науки РФ: грант № 14.124.13.1159-МД; № 14.B37.21.0211; № 14.B37.21.0564.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Kennedy J.R. AIDS - an autoimmune model // Med. Hypotheses. 1992. Vol. 37. P. 16-19.
2. Hess A.D., Colombani P.M., Esa A.H. Cyclosporine and the immune response: basic aspects // Crit. Rev. Immunol. 1986. Vol. 6. P. 123-149.
3. Smith G.N. The effect of cyclosporin A on the primary immune response to allogeneic red cells in rabbits // Immunology. 1982. Vol. 45. P. 163.
4. Issitt P.D., Gutgsell N.S. Hemolytic anemias with a negative Coombs' test and a positive Coombs' test without hemolytic anemia // Ann. Med. Interne. 1980. Vol. 131. P. 452-466.
5. Reviron M., Janvier D., Noel L., Bonnet M., Reviron J. Rheumatoid factor inhibition of an ELISA test for anti-HIV antibodies // Presse. Med. 1987. Vol. 16. P. 912.
6. Корепанов А.С., Бедулева Л.В., Меньшиков И.В., Князев А.В. Идиотипические механизмы регуляции развития аутоиммунной реакции в экспериментальной модели аутоиммунной гемолитической анемии у мышей // Вестн. Удм. ун-та. Сер. Биология. Науки о Земле. 2012. Вып. 2. С. 62-67.
7. Бедулева Л.В., Корепанов А.С., Меньшиков И.В., Сосновцева А.О., Столярова Е.Ю. Толерантность, вызванная циклоспорином А в модели коллаген-индуцированного артрита крыс, опосредована ревматоидным фактором // Вестн. Удм. ун-та. Сер. Биология. Науки о Земле. 2012. Вып 4. С. 84-90.
Поступила в редакцию 04.09.13
L. V. Beduleva, N.N. Abisheva, T. V. Khramova, I. V. Menshikov
Tolerance to autoimmune hemolytic anemia in mice caused by rat erythrocytes and cyclosporine А
Cyclosporin A (CSA) has been used in an attempt to form tolerance to rat erythrocytes (RE) and prevent induction of autoimmune hemolytic anemia in mice immunized with RE. In one experiment, mice were given i.p. injection of RE and u.c. injections of CSA (75mg/kg daily, for 7 days). In a second experiment, mice were given i.p. injection of RE and u.c. injections of CSA (25 mg/kg/day for 5 days). Mice were rendered unresponsive to RE (the first experiment), or produced low anti-RE titres (the second experiment). We have revealed that seven-day course of cyclosporine A (75mg/kg/day) after immunization with RE induces tolerance to RE. Mice given five-day course of cyclosporine A (25 mg/kg/day) responded normally to RE 45 days after CSA treatment. CSA treated mice didn't develop anemia in response to second injection of RE 45-55 days after CSA treatment compared with the control animals showed profound anemia.
Keywords: сyclosporin A, autoimmune hemolytic anemia, induced tolerance, rheumatoid factor.
Бедулева Любовь Викторовна, доктор биологических наук, профессор E-mail: blv76@mail.ru
Абишева Надежда Николаевна, старший преподаватель E-mail: Naidik84@mail.ru
Храмова Татьяна Владимировна, студентка E-mail: khratat@mail.ru
Меньшиков Игорь Викторович, доктор биологических наук, профессор E-mail: miv140560@yandex.ru
ФГБОУ ВПО «Удмуртский государственный университет» 426034, Россия, г. Ижевск, ул. Университетская, 1 (корп. 1)
Beduleva L.V., doctor of biology, professor E-mail: blv76@mail.ru
Abisheva N.N., senior lecturer E-mail: Naidik84@mail.ru
Khramova T.V., student E-mail: khratat@mail.ru
Menshikov I.V., doctor of biology, professor E-mail: miv140560@yandex.ru
Udmurt State University
426034, Russia, Izhevsk, Universitetskaya st., 1/1
