CC BY
10
Вестник ДВО РАН. 2022. № 5
Научная статья УДК 577.21:57.045
DOI: 10.37102/0869-7698 2022 225 05 2
Устойчивость к холодовому стрессу растений Nicotiana tabacum, трансформированных геном AtCPKl Arabidopsis thaliana
Г.Н. Веремейчик^, О.А. Тихонова
Галина Николаевна Веремейчик кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Федеральный научный центр биоразнообразия наземной биоты Восточной Азии ДВО РАН, Владивосток, Россия gala-vera@mail.ru
https://orcid.org/0000-0003-0549-2801
Ольга Андреевна Тихонова студент
Дальневосточный федеральный университет, Владивосток, Россия olga.tikhonova.kam@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-6794-7085
Аннотация. Исследован эффект избыточной экспрессии одного из важнейших сенсоров кальция -кальций-зависимой протеинкиназы (CDPK) на устойчивость к холодовому стрессу растений Шеойапа 1аЪасиш Ь. В работе использован ген АСРК1 арабидопсиса - одной из наиболее изученных изоформ растительных CDPK. Помимо нативной формы гена АСРК1 использованы полученные ранее мутантные формы: неактивная (изоформа мутация ЮМ4) и постоянно-активная кальций-независимая (изоформа С^ мутация ЮМ23). Данными формами гена методом агробактериальной трансформации были трансформированы растения табака. Нами показано, что экспрессия нативной формы гена приводит к значительному увеличению устойчивости трансгенных растений как к длительному воздействию холода, так и к воздействию холода при проращивании семян по сравнению с контрольными растениями. Мутация К1М23 усиливает этот эффект, мутация ЮМ4 полностью его нивелирует.
Ключевые слова: кальций-зависимая протеинкиназа, Шсойапа 1аЪасит, AraЪidopsis №аНапа, абиотический стресс, холодовой стресс, АСРК1
Для цитирования: Веремейчик Г.Н, Тихонова О.А. Устойчивость к холодовому стрессу растений Nicotiana tabacum, трансформированных геном AtCPKl Arabidopsis thaliana // Вестн. ДВО РАН. 2022. № 5. С. 17-24. http://dx.doi.org/10.37102/0869-7698_2022_225_05_2.
Благодарности. Авторы выражают благодарность руководителю лаборатории биоинженерии члену-корреспонденту РАН, доктору биологических наук В.П. Булгакову за поддержку и наставничество.
Финансирование. Грант РНФ, № 20-16-00016 (Булгаков В.П.).
© Веремейчик Г.Н., Тихонова О.А., 2022
Original article
Cold stress tolerance of Nicotiana tabacum plants transformed with the AtCPK1 gene of Arabidopsis thaliana
G.N. Veremeichik, O.A. Tikhonova
Galina N. Veremeichik Candidate of Sciences in Biology, senior researcher
Federal Scientific Center of the East Asia Terrestrial Biodiversity, FEB RAS, Vladivostok, Russia gala-vera@mail.ru
https://orcid.org/0000-0003-0549-2801
Abstract. We studied the effect of an over expression of one of the important calcium sensors, calcium-dependent protein kinase (CDPK), on cold stress tolerance in Nicotiana tabacum L. plants. In this work, we used AtCPK1 gene of Arabidopsis thaliana - one of the most studied isoform of CDPK plant. In addition to the native form of the AtCPK1 gene, its mutant forms, inactive (Na isoform, KJM4 mutation) and regularly active, independent of the presence of calcium ions (Ci isoform, KJM23 mutation), were used. Those gene forms transformed tobacco plants by agrobacterial transformation method. We have shown that the expression of the native form of the gene leads to a significant increase in resistance of the transgene plants both to prolonged exposure of cold and to exposure of cold during germination of seeds as compared to the control plants has been greatly increased. A mutation of KJM23, increases this effect, a mutation of KJM4 completely eliminates this effect.
Keywords: calcium-dependent protein kinase, Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana, abiotic stress, cold stress, ACPK1
For citation: Veremeichik G.N., Tikhonova O.A. Cold stress tolerance of Nicotiana tabacum plants transformed with the AtCPK1 gene of Arabidopsis thaliana. Vestnik of the FEB RAS. 2022;(5):17-24. (In Russ.). http://dx.doi.org/10.37102/0869-7698_2022_225_05_2.
Acknowledgments. The authors are grateful to the Head of the Laboratory of Bioengineering, RAS corresponding member, Doctor of Biological Sciences V.P. Bulgakov for support and mentorship.
Funding. Financial support was provided by the Russian Science Foundation, RSF grant No. 20-16-00016 (V.P. Bulgakov).
Введение
Повышение устойчивости растений к холоду - важное направление в селекции и генетической инженерии растений. В растениеводстве для повышения холодоустойчивости растений применяют прививание теплолюбивых растений на более холодоустойчивые, внесение калийных удобрений в почву при заморозках, а также процедуру закаливания растений, когда проросшие семена перед посевом
Olga A. Tikhonova Student
Far-East State University, Vladivostok, Russia
olga.tikhonova.kam@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-6794-7085
выдерживают при чередующихся через 12 ч низких (1-5 °C) и более высоких (10-20 °C) температурах.
Основным инструментом генетической инженерии растений является трансформация каким-либо геном, экспрессия которого улучшает свойства растения. Одним из примеров таких регуляторных элементов являются гены кальций-зависимых протеинкиназ (CDPK). Изменение токов ионов кальция в растительной клетке является одним из основных сигналов стрессового внешнего воздействия. Увеличение внутриклеточной концентрации кальция приводит к инактивации аутоингибиторного домена CDPK, что обеспечивает фосфорилирующую способность фермента [1]. За счет фосфорилирования CDPK активирует активность других ферментов, запуская реакцию на негативное внешнее воздействие. Таким образом, CDPK передают сигнал о внешнем воздействии с помощью фосфорили-рования белковых мишеней, например, мембранных каналов, НАДФН-оксидаз, транскрипционных факторов. Эти ферменты вовлечены в регуляцию защитного ответа растений на биотический и абиотический стресс, вызванный действием окружающей среды [2, 3].
В настоящей работе использовался ген протеинкиназы Arabidopsis thaliana AtCPKl. Данный фермент локализуется в масляных тельцах и пероксисомах и играет потенциальную роль в регуляции пероксисомных функций, таких как метаболизм липидов и окислительный стресс [4]. Являясь регулятором врожденной иммунной системы у арабидопсиса, AtCPKl участвует в зависимом от салициловой кислоты сигнальном пути и модулирует экспрессию генов защиты и устойчивости к болезням [5]. Клетки Rubia cordifolia и Vitis amurensis, модифицированные AtCPKl, имели повышенную продукцию вторичных метаболитов, таких как рез-вератрол или антрахиноны [6, 7].
Ранее были получены [8] мутантные формы AtCPKl, которые в данной работе использовались для изучения роли AtCPKl в устойчивости растений к холоду. Помимо нативной формы гена AtCPKl (Ak, от англ. «Arabidopsis kinase»), растения были трансформированы неактивной формой (мутация KJM4, изоформа Na, от англ. «Notactive») и независимой от присутствия ионов кальция постоянно активной формой (мутация KJM23, изоформа Ci, от англ. «Calcium independent»). Ранее мы показали, что экспрессия нативной изоформы Ak в растениях Nicotiana tabacum L. приводит к значительному повышению устойчивости к солевому стрессу как при прорастании семян, так и при длительном выращивании трансгенных растений-микроклонов [9]. При этом экспрессия мутантной формы Ci усиливает устойчивость, в то время как растения, трансформированные формой Na, не отличаются от контрольных по уровню устойчивости к солевому стрессу.
Материалы и методы
В работе использовались 4 линии растений табака N. tabacum: Nt - не-трансгенная линия; Na - растения табака, трансформированные неактивной мутантной формой (мутация KJM4, изоформа Na, Notactive); Ak - трансформированные нативной формой гена AtCPKl; Ci - трансформированные независимой от присутствия ионов кальция постоянно активной мутантной формой (мутация KJM23, изоформа Ci, Calcium independent). Растения выращивали методом ми-кроклонального размножения in vitro на среде MS/2, а также использовали гомозиготные семена контрольного и трансгенных растений 3-го поколения.
Повышение устойчивости растений к холоду при трансформации геном AtCPKl арабидопсиса оценивалось двумя методами. При исследовании первым методом двухнедельные растения-микроклоны, выращенные in vitro на среде MS/2, подвергались действию холодового стресса в климатостате в течение 30 дней при следующих параметрах культивирования: фотопериод 16/8 ч, освещенность днем 3000-5000 люкс, температура 12 °C, влажность 70 %. Контрольные растения росли в идентичных условиях, но при температуре 24 °C. После 30 дней пребывания в климатической камере растения фотографировали и взвешивали для оценки прироста биомассы. При оценке вторым методом семена табака проращивали в течение 10 дней на влажной фильтровальной бумаге в 24-луночных планшетах (Corning) при холодовом стрессе (12 °C) и комфортной температуре (24 °C) в климатостате (КС-200, Россия) со следующими параметрами: фотопериод 16/8 ч, освещенность днем 3000-5000 люкс, влажность 70 %. Оценивали процент проросших семян от их общего количества и длину проростков.
Эксперименты повторяли три раза, в каждом из них использовали 20 биологических повторностей. Полученные данные были обработаны в программе Statistica 10.0 (StatSofflnc., США) и представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего; межгрупповой анализ проводили в ANOVA, при P < 0,05 различия считали достоверными.
Результаты и обсуждение
Целью работы было исследование влияния избыточной экспрессии гена AtCPKl на устойчивость к холодовому стрессу трансгенных растений и семян N. tabacum, а также выявление эффекта мутаций в аутоингибиторном домене AtCPKl неактивной (Na) и постоянно активной (Ci) изоформ гена в сравнении с диким типом (Ak).
Влияние холодового стресса на прорастание семян табака
Устойчивость табака к холодовому стрессу при исследовании данным методом выражалась в прорастаниии наибольшего числа семян при температуре 12 °C, они сравнивались с контрольными семенами, прорастающими при 24 °C. На рис. 1 можно видеть разницу между семенами, прорастающими в холодовом стрессе или при комфортной температуре. Под действием холодового стресса не изменилось прорастание только у семян, трансформированных изоформой Ci; у не-трансгенных и трансформированных изоформой Na семян значительно снизилось количество проросших, а для семян табака с нативной формой гена отмечается их снижение примерно наполовину. Также визуально можно заметить уменьшение длины проростков в сравнении с семенами, проращиваемыми при температуре 24 °C. На рис. 1, б показано влияние холода на процент прорастания семян. При температуре 24 °C разницы между контрольными и модифицированными различными изоформами гена AtCPKl растениями табака не обнаружено. Под действием холодового стресса процент проросших семян снижается на 90 % для линий Nt и Na, на 60 % - для линии Ak, в то время как для линии Ci снижения не наблюдается.
Также было выполнено измерение и сравнение длин проростков семян табака при проращивании в контрольных условиях и холодовом стрессе (рис. 1, в).
Рис. 1. Влияние холодового стресса (12 °С в течение 10 дней) на прорастание семян контрольной и трансгенных линий табака: а - репрезентативный вид; б - влияние холода на процент прорастания семян; в - влияние холода на длину проростков. Nt - семена контрольной нетрасгенной линии N. tabacum; Na - семена трансгенной линии, трансформированной мутантной неактивной формой AtCPKl; Ak - семена трансгенной линии, трансформированной нативной формой гена AtCPKl; Ci - семена трансгенной линии, трансформированной мутантной постоянно-активной формой гена AtCPKl. Эксперимент повторен 3 раза, данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего; буквы над планками погрешностей обозначают статистически достоверную разницу (P < 0,05, LSD Фишера)
Nf Na Ak Cí
Уменьшение длины семядолей имеет сходную с проращиванием закономерность: растение табака с неактивной протеинкиназой АСРК1 не отличается от нетранс-генного растения и имеет наиболее сильное уменьшение длины проростка, а растение табака, модифицированное геном фермента с постоянной активностью, меньше всех подвержено действию холодового стресса.
Влияние холодового стресса
на рост двухнедельных растений табака
Проверка взрослых растений на устойчивость к холодовому стрессу также проводилась в климатостате при следующих параметрах: фотопериод 16/8 ч; освещенность днем 3000-5000 люкс; температура 12 °С или 24 °С, влажность 70 %. В таких условиях визуально оценивали длину побега и толщину стеблей, размер листьев по прошествии 30 дней, а также взвешивали растения до начала эксперимента и по его окончании.
Внешне растения, подверженные действию холодового стресса в течение 30 дней, заметно отличаются от контрольных растений, выращенных при температуре 24 °С, которые имеют более вытянутые стебли и черенки, а также листья большего размера (рис. 2, а, б). Кроме того, было показано, что прирост биомассы растений N и № снижен более чем в 4 раза при воздействии холода, в то время как рост растений Ак и С при холодовом стрессе достоверно выше (рис. 2, в).
Таким образом, мы показали, что избыточная экспрессия нативной формы гена АСРК1 арабидопсиса в растениях табака значительно увеличивает устойчивость к холодовому стрессу по сравнению с контрольными растениями. При этом неактивная изоформа АСРК1 полностью нивелирует данный эффект,
А
. 50 шсн _
Nt Na
Nt Na
Г
П _24X', 30 л мен__
А к С
ÜÜ! M %
iZt", 30дней
Ak C¡
* - г ш
á и
Q я
5 o.t
= **
=
■2 И
= ftf
l-
rln
4, (i
Г I"
M píi ЛЬ Ci Nt Лк Cl
lie. 3«дней
Рис. 2. Влияние холодового стресса (12 °С в течение 30 дней) на микроклоны контрольной и трансгенных линий табака: а, б - репрезентативный вид; в - влияние холода на накопление биомассы. Nt - растения-микроклоны контрольной нетрасгенной линии N. tabacum; Na - растения-микроклоны трансгенной линии, трансформированной мутантной неактивной формой AtCPKl; Ak - растения-микроклоны трансгенной линии, трансформированной нативной формой гена AtCPKl; Ci - растения-микроклоны трансгенной линии, трансформированной мутантной постоянно-активной формой гена AtCPKl. Эксперимент повторен 3 раза, данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего; буквы над планками погрешностей обозначают статистически достоверную разницу (P < 0,05, LSD Фишера)
устойчивость к холодовому воздействию растений табака, трансформированных изоформой не отличается от таковой у контрольных растений как при длительном культивировании, так и при проращивании семян. Мутация изоформы С обеспечивает трансгенным растениям повышенную устойчивость к холоду, при которой растения имеют прирост биомассы и процент проросших семян, близкие к таковым у контрольных растений, не подверженных действию холода.
Выводы
В ходе работы было исследовано действие холодового стресса на накопление биомассы при длительном выращивании растений и прорастание семян N. ^аЬасит дикого типа и модифицированных нативным геном АСРК1 и его му-тантными формами - неактивной и постоянно активной. Показано, что избыточная экспрессия данного гена оказывает воздействие на устойчивость растений к холодовому стрессу, в особенности при их трансформации мутантной постоянно-активной изоформой АСРК1-а.
Повышение устойчивости сельскохозяйственных растений к абиотическим стрессам (засухе, засоленности почв, заморозкам) - важная для современного растениеводства задача, и показанный в данной работе эффект может быть одним из путей ее решения. Не менее важны исследования молекулярного механизма, обеспечивающего устойчивость растений при избыточной экспрессии генов CDPK растений. Как показано ранее [9, 10], устойчивость к солевому и холодовому
стрессам модулируется через систему метаболизма активных форм кислорода при непосредственном участии CDPK.
СПИСОК ИСТОЧНИКОВ
1. Harmon AC, Yoo B-C, McCaflery C. Pseudosubstrate inhibition of CDPK, a protein kinase with a calmodulin-like domain // Biochemistry. 1994. N 33. P. 7278-7287. https://doi.org/10.1021/bi00189a032.
2. Schulz P., Herde M., Romeis T. Calcium-dependent protein kinases: hubs in plant stress signaling and development // Plant Physiology. 2013. N 163. P. 523-530.
3. Boudsocq M., Sheen J. CDPKs in immune and stress signaling // Trends Plant Sci. 2013. N 18. P. 30-40.
4. Dammann C., Ichida A., Hong B., Romanowsky S.M., Hrabak E.M., Harmon A.C., Pickard B.G., Harper J.F. Subcellular targeting of nine calcium-dependent protein kinase isoforms from Arabidopsis 1 // Plant Physiology. 2003. N 132. P. 1840-1848.
5. Coca M., Segundo B.S. AtCPK1 calcium-dependent protein kinase mediates pathogen resistance in Arabidopsis // The plant journal. 2010. N 63. P. 526-540.
6. Veremeichik G.N., Grigorchuk V.P., Shkryl Y.N., Bulgakov D.V., Silantieva S.A., Bulgakov V.P. Induction of resveratrol biosynthesis in Vitis amurensis cells by heterologous expression of the Arabidopsis constitutively active, Ca2+-independent form of the AtCPKl gene // Process Biochemistry. 2017. N 54. P. 144-155.
7. Shkryl Y.N., Veremeichik G.N., Makhazen D.S., Silantieva S.A., Mishchenko N.P., Vasileva E.A., Fedoreyev S.A., Bulgakov V.P. Increase of anthraquinone content in Rubia Cordifolia cells transformed by native and constitutively active forms of the AtCPKl gene // Plant Cell Reports. 2016. N 35. P. 1907-1916.
8. Harper J.F, Huang J.F, Lloyd S.J. Genetic identification of an autoinhibitor in CDPK, a protein kinase with a calmodulin-like domain // Biochemistry. 1994. N 33. P. 7267-7277. https://doi.org/10.1021/ bi00189a031
9. Veremeichik G.N., Shkryl Y.N., Silantieva S.A., Gorpenchenko T.Y., Brodovskaya E.V., Yatsun-skaya M. S., Bulgakov V.P. Managing activity and Ca2+ dependence through mutation in the Junction of the AtCPK1 coordinates the salt tolerance in transgenic tobacco plants // Plant Physiology and Biochemistry. 2021. N 165. P. 104-113.
10. Dong H, Wu C, Luo C, Wei M, Qu S, Wang S. Overexpression of MdCPK1a gene, a calcium dependent protein kinase in apple, increase tobacco cold tolerance via scavenging ROS accumulation // PLoS One. 2020. N 19;15(11):e0242139.
REFERENCES
1. Harmon AC, Yoo B-C, McCaflery C. Pseudosubstrate inhibition of CDPK, a protein kinase with a calmodulin-like domain. Biochemistry. 1994;(33):7278-7287. https://doi.org/10.1021/bi00189a032.
2. Schulz P., Herde M., Romeis T. Calcium-dependent protein kinases: hubs in plant stress signaling and development. Plant Physiology. 2013;(163):523-530.
3. Boudsocq M., Sheen J. CDPKs in immune and stress signaling. Trends Plant Sci. 2013;(18):30-40.
4. Dammann C., Ichida A., Hong B., Romanowsky S.M., Hrabak E.M., Harmon A.C., Pickard B.G., Harper J.F. Subcellular targeting of nine calcium-dependent protein kinase isoforms from Arabidopsis 1. Plant Physiology. 2003;(132):1840-1848.
5. Coca M., Segundo B.S. AtCPK1 calcium-dependent protein kinase mediates pathogen resistance in Arabidopsis. The plant journ. 2010;(63):526-540.
6. Veremeichik G.N., Grigorchuk V.P., Shkryl Y.N., Bulgakov D.V., Silantieva S.A., Bulgakov V.P. Induction of resveratrol biosynthesis in Vitisamurensis cells by heterologous expression of the Arabidopsis constitutively active, Ca2+-independent form of the AtCPKl gene. Proc. Biochemistry. 2017;(54):144-155.
7. Shkryl Y.N., Veremeichik G.N., Makhazen D.S., Silantieva S.A., Mishchenko N.P., Vasileva E.A., Fedoreyev S.A., Bulgakov V.P. Increase of anthraquinone content in Rubia Cordifolia cells transformed by native and constitutively active forms of the AtCPKl gene. Plant Cell Reports. 2016;(35):1907-1916.
8. Harper J.F, Huang J.F, Lloyd S.J. Genetic identification of an autoinhibitor inCDPK, a protein kinase with a calmodulin-like domain. Biochemistry. 1994;(33):7267-7277. https://doi.org/10.1021/bi00189a031.
9. Veremeichik G.N., Shkryl Y.N., Silantieva S.A., Gorpenchenko T.Y., Brodovskaya E.V., Yatsunskaya M.S., Bulgakov V.P. Managing activity and Ca2+ dependence through mutation in the Junction of the AtCPKl coordinates the salt tolerance in transgenic tobacco plants. Plant Physiology and Biochemistry. 2021;(165):104-113.
10. Dong H, Wu C, Luo C, Wei M, Qu S, Wang S. Overexpression of MdCPKla gene, a calcium dependent protein kinase in apple, increase tobacco cold tolerance via scavenging ROS accumulation. PLoS One. 2020;(19;15(11)):e0242139.
