CC BY
111
ЗАЩИТА РАСТЕНИЙ
УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ВОЗБУДИТЕЛЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО ОЖОГА РИСА НА ОСНОВЕ ПЦР
М.С. Егорова1, А.Н. Игнатов2, Е.С. Мазурин1
!ФГБУ Всероссийский центр карантина растений (ФГБУ ВНИИКР) ул. Пограничная, 32, п. Быково, Раменскийрайон, Московская область, 140150 2Кафедра ботаники, физиологии растений и агробиотехнологии Российский университет дружбы народов ул. Миклухо-Маклая, 8/2, Москва, Россия, 117198
На основе анализа оригинальных и ранее опубликованных последовательностей ДНК ХапШо-шопаэ о^ае ру. о^ае были разработаны праймеры для ПЦР «в реальном времени», позволяющие достоверно идентифицировать возбудителя бактериального ожога риса, без перекрестных реакций с близкородственными видами. Была оптимизирована среда для БИО-ПЦР УРОЛ, содержащая в качестве селектирующих факторов антибиотики циклогексимид 50 мг/л + цефазолин 30 мг/л + гента-мицин 2 мг/л. Показано, что чувствительность праймеров при БИО-ПЦР с использованием оригинальной селективной питательной среды в 100 раз эффективнее прямого ПЦР анализа. Оптимизированная БИО-ПЦР диагностика возбудителя бактериального ожога риса позволяла обнаружить 50 КОЕ/мл семенного экстракта.
Ключевые слова: бактериальный ожог риса, ПЦР «в реальном времени», БИО-ПЦР.
Бактериальный ожог риса (возбудитель Xanthomonas oryzae pv. oryzae [4]) относится к числу наиболее вредоносных заболеваний во всем мире [7]. Вызывает заболевания многих растений: культурного риса, некоторых видов дикого риса, проса куриного и рисового, злаковых сорняков, сныти круглой и др. В странах тропической Азии потери урожая составляют от 22 до 81%, в странах с умеренным климатом — несколько ниже [2].
Бактериальный ожог риса внесен в Список А1 Перечня ЕОКЗР (Европейской и Средиземноморской организации по карантину и защите растений) [3].
Xanthomonas oryzae pv. oryzae на данный момент входит в перечень карантинных организмов, не зарегистрированных на территории Российской Федерации.
Заболевание переносится в свободные от заражения районы с семенным материалом. В связи с расширением торговых отношений и импортом в Российскую
Федерацию семян из стран распространения данного бактериоза увеличивается опасность его завоза в нашу страну.
Тестирование зараженности семян является достаточно сложной задачей, так как возбудитель находится в семенах под оболочкой и в небольших количествах, в связи с чем разработка чувствительных и достоверных методов диагностики имеют большое значение.
Целью нашей работы было создание надежной тест-системы для диагностики возбудителя бактериального ожога в семенах риса. Для достижения поставленной цели планировалось решение следующих задач:
1) подбор и проверка ПЦР праймеров, специфичных для Xanthomonas oryzae pv. oryzae;
2) разработка протокола БИО-ПЦР анализа для диагностики бактериального ожога риса;
3) сравнение чувствительности БИО-ПЦР и прямого ПЦР анализа.
Объекты и методы исследования. В работе использовали коллекцию бактерий (47 штаммов), предоставленную лабораторией бактериальных болезней ГНУ-ВНИИ фитопатологии РАСХН, а также типовые штаммы Xanthomonas oryzae pv. oryzae.
Выделение ДНК из бактерий проводили набором «Проба ГС» кат. № Р-003/1 («ДНК-Технология», Москва), основанным на использовании для лизиса клеток сильного хаотропного агента — гуанидина тиоцината (GuSCN), и с последующей сорбцией ДНК на носителе.
Концентрацию и чистоту выделенной ДНК измеряли на спектрофотометре NanoDrop 2000 для количественного определения НК и белка. Оценку качества экстрагированной ДНК проводили на основании измерения оптической плотности раствора ДНК при 280 и 260 и 230 нм. Для чистых образцов ДНК соотношение оптических плотностей, полученных при 260/280 нм, должно быть около 1,8, при 260/230 нм 1,8—2,2.
Амлификацию и детекцию в реальном времени проводили на амплификаторе iCycler iQ 5 (Bio-Rad, США). Для проведения ПЦР «в реальном времени» были разработаны праймеры и специфичный зонд. Подбор праймеров и зондов осуществлялся на основе гена gyr B [1]. Праймерные системы на основе последовательностей гена gyrB позволяют диагностировать бактерии рода Xanthomonas до вида [5; 6]. Синтез праймеров и зондов проводили в ЗАО «Синтол», Москва.
Из базы данных Genßank (www.ncbi.nlm.nih.gov) были выбраны нуклеотид-ные последовательности гена gyr B возбудителей бактериального ожога риса. Также при анализе использовали данные секвенирования чистых культур Xanthomonas sрp. из коллекции ГНУ-ВНИИ фитопатологии РАСХН. Всего было проанализировано около 48 нуклеотидных последовательностей. Анализ последовательностей и выбор праймеров проводили с помощью программ «BioEdit» и «Primer 3».
Объем реакционной смеси составлял 25 мкл и включал 2,5 мкл 10хПЦР буфера, 2,5 мкИ^ MgCl2, 200 мкМ dNTP по 7,5 пкМ праймеров, 5 пкМ зонда, 1 ед. термостабильной полимеразы («Диалат», Москва) и 5 мкл ДНК. Реакцию проводили
при следующих температурно-временных условиях: 1 цикл 95 °C — 5 мин; 40 циклов 95 °C — 15 сек, 61 °C — 40 сек.
Для разработки БИО-ПЦР анализа использовали партию риса сорта «Луговой», который искусственно заражали типовым штаммом Xanthomonas oryzae pv. oryzae NCCPB 3002Т в условиях вакуума.
Партию искусственно зараженных семян стерилизовали в 10% гипохлорите натрия 2 мин, промывали 3 раза в стерильной воде, помещали в PBS с добавлением Твин 20 (на 500 г семян 750 мл PBS 1x + 0,01% Tween 20). Охлаждали при +4 °С 24 часа. Помещали на шейкер на 30 минут, 210 об./мин. Далее гомогенизировали 2 мин, со скоростью 8, пропускали через бактериологический фильтр и высевали на селективную питательную среду YPGA с разными антибиотиками и наблюдали за ростом целевой бактерии, а также сапротрофной микробиоты. Возможность выделения патогена наблюдали визуально и для подтверждения ставили ПЦР «в реальном времени» с подозрительными колониями.
Сравнение чувствительности прямого и БИО-ПЦР анализа проводили путем внесения известного числа клеток возбудителя в семенной экстракт с последующей постановкой ПЦР. Готовили суспензию клеток Xanthomonas oryzae pv. oryzae. Определение концентрации бактериальной суспензии проводили методом серийных разведений. Подсчет колоний проводили через сутки и рассчитывали концентрацию бактерий (КОЕ/мл).
Из каждого разведения бактериальной суспензии вносили по 100 мкл к 1 мл семенного экстракта. Таким образом, формировали различные варианты семенных экстрактов с известным количеством клеток возбудителя.
Для сравнения чувствительности прямого и био-ПЦР анализа использовали ПЦР «в реальном времени» с разработанными праймерами X.o.F и X.o.R и пробой X.o.P. В первом случае ставили прямую ПЦР, при котором исследовали полученный семенной экстракт. Во втором случае проводили Био-ПЦР, т.е. семенной экстракт высевали на питательные среды. Смыв с поверхности чашек проводили через 18 часов после посева, добавляя в чашку 500 мкл стерильного физраствора. Пробы до проведения ПЦР-анализа хранили при — 18 °С.
Результаты и обсуждения. На начальном этапе исследований нами была проанализирована литература, характеризующая различия в пределах рода Xanthomo-nas на уровне нуклеотидных последовательностей определенных участков генома. Наиболее подходящим геном — мишенью для разработки видоспецифичных прай-меров и зондов — является ген субъединицы Б фермента ДНК-гиразы (gyrB).
На основании выровненных последовательностей нами были разработаны праймеры X.o.F — GGC AAY CAG CAT CCG GC и X.o.R — CTT CGC CCA TAT GAC GGC, а также меченный флуоресцентным красителем НЕХ зонд, специфичные для Xanthomonas oryzae pv. oryzae.
После подбора зонда проверяли его специфичность. Было установлено, что флуоресценция по красителю НЕX регистрировались только при исследовании ДНК данного возбудителя. При тестировании других видов рода Xanthomonas, а также других фитопатогенных бактерий, выделенных с риса, зафиксирован отрицательный результат. Результаты представлены в табл. 1.
Таблица 1
Специфичность ПЦР «в реальном времени» с зондом X.OR.-P
ДНК возбудителя Зонд
X.OR.-P
X. oryzae 23,96
X. campestris NA
X. axonopodis NA
X. arboricola NA
X. hortorum NA
X. cynarae NA
X. pisi NA
X. gardeneri NA
Erwinia amylovora NA
Dickeya dianthicola NA
Pantoea agglomerans NA
Pseudomonas sp. NA
Примечание: ЫД — отсутствие сигнала флуоресценции.
На первоначальном этапе разработки БИО-ПЦР диагностики была выбрана оптимальная среда, для роста и размножения целевой бактерии. При использовании среды YPGA, содержащей дрожжевой экстракт (5,0 г/л), пептон (5,0 г/л), глюкоза (10,0 г/л), агар (12,0 г/л), рост бактерий был обнаружен через 17 часов. Далее семенной экстракт высевали на чашки со средой YPGA с разными антибиотиками в качестве селектирующего фактора и наблюдали за ростом целевой бактерии, а также сапротрофной микробиоты. Только в варианте с использованием комбинации антибиотиков Циклогексимид 50 мг/л + цефазолин 30 мг/л + гентамицин 2 мг/л был виден рост целевой бактерии через сутки.
Было проведено сравнение чувствительности диагностики прямой и БИО-ПЦР, при этом последняя модификация показала более высокую чувствительность. Использование БИО-ПЦР в 100 раз повышает чувствительность диагностики в сравнении с прямой ПЦР. Оптимизированная БИО-ПЦР диагностика возбудителя бактериального ожога риса позволяла обнаружить 50 КОЕ/мл семенного экстракта. Данные представлены в табл. 2.
Таблица 2
Чувствительность прямой ПЦР и оптимизированной БИО-ПЦР для диагностики семян риса, зараженных Xanthomonas oryzae pv. oryzae.
Праймеры X. or F_X. or. R, зонд X.OR.-P
Среда Концентрация Xanthomonas oryzae в семенном экстракте, клеток/мл
5,2х108 5,2х107 5,2х106 5 5,2х105 4 5,2х104 3 5,2х103 2 5,2х102 5,2х10
Прямая ПЦР 29,92* 30,92 31,54 33,21 34,28 35,61 N/A N/A
БИО-ПЦР 26,06 28,65 29,47 30,05 30,99 32,15 33,87 34,61
К+(ДНК возбудителя) 21,86 25,03 26,39 28,06 30,18 31,14 32,14 33,40
К- (здоровые семена) — — — — — — — —
*числовые значения — пороговые значения цикла (С().
Выводы
1. Разработаны праймеры, позволяющие достоверно идентифицировать возбудителя бактериального ожога риса и не дающие перекрестных реакций с близкородственными видами.
2. Разработана селективная питательная среда YPGA, содержащая в качестве селектирующих факторов антибиотики циклогексимид 50 мг/л + цефазолин 30 мг/л + гентамицин 2 мг/л для проведения БИО-ПЦР.
3. Показано, что чувствительность метода БИО-ПЦР с использованием разработанной селективной питательной среды составила около 50 КОЕ патогена в 1 мл семенного экстракта.
ЛИТЕРАТУРА
[1] Пунина Н.В., Зотов В.С., Кузнецов Б.Б., Игнатов А.Н. Оценка генетического разнообразия межгенного транскрибируемого региона 16S-23S рРНК, гена GYRB и разработка ПЦР диагностики фитопатогенных ксантомонад // Вестник Московского государственного областного университета. — 2008. — № 2. — С. 3—17.
[2] OEPP/EPPO. Data sheets on quarantine organisms, Xanthomonas oryzae // Bulletin OEPP/EPPO Bulletin. — 1990. — V. 16. — P. 1—8.
[3] OEPP/EPPO. Diagnostics, Xanthomonas oryzae // Bulletin OEPP/EPPO Bulletin. — 2007. — V. 37. — P. 543—553.
[4] Swings J.G., Van Den Mooter M., Vauterin L., Hoste B., Gillis M., Mew T.W. and Kersters K. Reclassification of the causal agents of bacterial blight Xanthomonas campestris pathovar oryzae and bacterial leaf streak Xanthomonas campestris pathovar oryzicola of rice as patho-vars of Xanthomonas oryzae new species Ex Ishiyama // Int. J. Syst. Bacteriol. — 1990. — V. 40. — P. 309—311.
[5] Yamamoto S., BouvetP.J. andHarayama S. Phylogenetic structures of the genus Acinetobacter based on gyrB sequences: comparison with the grouping by DNA-DNA hybridization // Int. J. Syst. Bacteriol. — 1999. — V. 49. — P. 87—95.
[6] Yamamoto S. and Harayama S. Phylogenetic analysis of Acinetobacter strains based on the nuc-leotide sequences of gyrB genes and on the amino acid sequences of their products // Int. J. Syst. Bacteriol. — 1996. — V. 46. — P. 506—511.
[7] Zhao W.J., Zhu S.F., Liao X.L., Tan T.W. Detection of Xanthomonas oryzae pv. oryzae in seeds using a specifi c TaqMan probe // Molecular Biotechnology. — 2007. — V. 35. — P. 119—127.
DEVELOPMENT DIAGNOSTIC METHODS OF BACTERIAL BLIGHT OF RICE ON BASED PCR
M.S. Egorova1, A.N. Ignatov2, E.S. Mazurin1
'All-Russian Plant Quarantine Center Pogranichnaya str., 32, Bykovo, Ramenskoe, Moscow region, Russia, 140150 2Department of botany, plant physiology and agrobiotechnology Peoples' Friendship University of Russia
Miklukho-Maklaya str., 8/2, Moscow, Russia, 117198
Primers identifying bacterial blight pathogen, without cross-reactions with closely related species were designed based on the analysis of the original and GeneBank DNA sequences of Xanthomonas oryzae pv. oryzae. Media YPGA containing cycloheximide 50 mg / l + cefazolin 30 mg / l + gentamicin 2 mg / l has been optimized for BIO-PCR. Sensitivity of the BIO-PCR analysis using original selective media up to 100 times more effective than direct PCR analysis. The sensitivity of the primers in BIO-PCR analysis with original selective media has achieved 50 CFU/ml.
Key words: Bacterial leaf blight of rice, Real-time PCR, BIO-PCR.
REFERENCES
[1] Punina N.V., Zotov V.S., Kuznecov B.B., Ignatov A.N. Ocenka geneticheskogo raznoobrazija mezhgennogo transkribiruemogo regiona 16S-23S rRNK, gena GYRB i razrabotka PCR diagnos-tiki fitopatogennyh ksantomonad // Vestnik Moskovskogo gosudarstvennogo oblastnogo univer-siteta. — 2008. — № 2. — S. 3—17.
[2] OEPP/EPPO. Data sheets on quarantine organisms, Xanthomonas oryzae // Bulletin OEPP/EPPO Bulletin. — 1990. — V. 16. — P. 1—8.
[3] OEPP/EPPO. Diagnostics, Xanthomonas oryzae // Bulletin OEPP/EPPO Bulletin. — 2007. — V. 37. — P. 543—553.
[4] Swings J.G., Van Den Mooter M., Vauterin L., Hoste B., Gillis M., Mew T.W. and Kersters K. Reclassification of the causal agents of bacterial blight Xanthomonas campestris pathovar oryzae and bacterial leaf streak Xanthomonas campestris pathovar oryzicola of rice as pathovars of Xanthomonas oryzae new species Ex Ishiyama // Int. J. Syst. Bacteriol. — 1990. — V. 40. — P. 309—311.
[5] Yamamoto S., BouvetP.J. andHarayama S. Phylogenetic structures of the genus Acinetobacter based on gyrB sequences: comparison with the grouping by DNA-DNA hybridization // Int. J. Syst. Bacteriol. — 1999. — V. 49. — P. 87—95.
[6] Yamamoto S. and Harayama S. Phylogenetic analysis of Acinetobacter strains based on the nucleotide sequences of gyrB genes and on the amino acid sequences of their products // Int. J. Syst. Bacteriol. — 1996. — V. 46. — P. 506—511.
[7] Zhao W.J., Zhu S.F., Liao X.L., Tan T.W. Detection of Xanthomonas oryzae pv. oryzae in seeds using a specifi c TaqMan probe // Molecular Biotechnology. — 2007. — V. 35. — P. 119—127.
