CC BY
9УДК 637:07 DOI 10.36508fRSATU.2019.62.37.005
УСКОРЕННЫЙ МЕТОД ПОДСЧЕТА МЕЗОФИЛЬНЫХ АЭРОБНЫХ И ФАКУЛЬТАТИВНО-АНАЭРОБНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ В ПТИЦЕПРОДУКТАХ
КОЗАК Сергей Степанович, д-р вет. наук, профессор, гл. научный сотрудник лаборатории санитарно-гигиенической оценки сырья и продуктов, ВНИИПП - филиал ФГБНУ ФНЦ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт птицеводства» РАН, vniippkozak@gmail.com СЕМЕНОВ Владимир Григорьевич, д-р биол. наук, профессор, заведующий кафедрой морфологии, акушерства и терапии ФГБОУ ВО Чувашская ГСХА, semenov_v.g@list.ru АБДРАИМОВ Рафат Турсыналиевич, аспирант, vniippkozak@gmail.com
КОЗАК Юлия Александровна, канд. вет. наук, вед. научный сотрудник лаборатории санитарно-гигиенической оценки сырья и продуктов, vniippkozak@gmail.com
ВНИИПП - филиал ФГБНУ ФНЦ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт птицеводства» РАН
Проведена апробация и произведены сравнительные испытания тест-пластин, предназначенных для подсчета количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) в птицепродуктах. Лабораторные испытания включали в себя выявление диапазонов чувствительности тест-пластин для определения КМАФАнМ, подсчет процента их извлекаемо-сти (% всхожести) с поверхности тест-пластин, а также проведение их сравнительных испытаний с помощью классического метода анализа. Тест-пластины типа 1 содержат готовую питательную среду, гель и тетразолиевый индикатор; используются для подсчета КМАФАнМ в образцах пищевых продуктов, продовольственном сырье, а также при мониторинге окружающей среды. Тест-пластины типа 2 предназначены для экспрессного подсчета КМАФАнМ в пищевых продуктах и объектах внешней среды, содержат готовую питательную среду, водорастворимый желирующий агент, цветной индикатор. При сравнении чувствительности классических сред и тест-пластин типа 1 и типа 2 при определении КМАФАнМ была установлена высокая чувствительность как питательного агара, так и испытуемых тест-пластин. Для плотных сред она составляет не менее 0,1 мл суспензии из 6-го разведения. В наших исследованиях на всех чашках и тест-пластинах из 6 и 7 разведений выявлен рост типичных колоний, что свидетельствует о высокой чувствительности. Установлено, что процент извлекаемости на тест-пластинах хороший: на тест-пластинах типа 1 - 98,9%, на тест-пластинах типа 2 - 86,8%. При сравнительном исследовании классического метода и тест-пластин был получен хороший результат. Во всех случаях результаты исследований на КМАФАнМ тест-пластин сопоставим с классическим методом: процент извлекаемости апробируемого материала составил более 80%, в некоторых случаях - даже 100%. Тест-пластины для определения КМАФАнМ просты в использовании, надежны, имеют длительный срок хранения (1 год), с их применением уменьшаются сроки проведения анализа, уменьшается трудоемкость исследований.
Ключевые слова: тест-пластины для подсчета КМАФАнМ, классические среды, птицепродукты.
Введение
Выпуск безопасной продукции является одной из ключевых задач пищевой промышленности. Традиционные методы выявления микрофлоры занимают время, и на получение результатов уходит достаточно большое количество времени, поэтому иногда уже невозможно исправить ситуацию. В свете изложенного остается актуальной разработка быстрых, относительно недорогих и более динамичных методов оценки микробного загрязнения [3].
Аэробные и факультативно-анаэробные бактерии могут присутствовать в различных пищевых продуктах, их количество служит индикатором микробного загрязнения. Общеизвестно, что вероятность присутствия патогенных бактерий в объектах среды обитания повышается по мере роста общей микробной контаминации. Точное выявление количества аэробных и факультативно-анаэробных бактерий в сырье, конечном продукте и объектах внешней среды является важным критерием оценки качества произведенного продукта, его безопасности на пищевом производстве [2].
В данной работе был исследован метод опре-
деления КМАФАнМ на тест-пластинах. На их поверхность была нанесена питательная среда, благоприятная для роста микроорганизмов. Специальное вещество, содержащееся в составе питательной среды, при комнатной температуре превращается в гель при добавлении жидкости. Образуемая гелеобразная питательная среда позволяет проводить учет численности микроорганизмов.
Преимущества данного метода заключаются в том, что пластины всегда готовы для немедленного использования: исключается время на подготовку среды - появляется возможность выполнить тесты в два раза быстрее, уменьшается потребность в проведении контроля качества в сертифицированных лабораториях (каждая коробка пластин имеет сертификат качества), становится менее трудоемким процесс уборки. Кроме того, компактный размер пленки позволяет сэкономить рабочую площадь лаборатории и уменьшить площади, необходимые для хранения, увеличивает продолжительность хранения тестов (до 1 года) в сравнении с методом использования готовых питательных сред.
© Козак С. С., Семенов В. Г., Абдраимов Р. Т., Козак Ю. А., 2019 г.
Материалы и методы
Методика проведения работ была основана на лабораторных испытаниях. Она включала несколько этапов работы: выявление диапазонов чувствительности тест-пластин для определения КМАФАнМ, определение процента извлекаемо-сти (% всхожести) на тест-пластинах, проведение сравнительных испытаний с использованием классического метода анализа [1].
При выполнении работы были использованы:
- тест-пластины типа 1: в их состав включены питательная среда, гель, индикатор тетразо-лиевый, который облегчает подсчет колоний; они используются для подсчета КМАФАнМ в образцах пищевых продуктов, продовольственном сырье, а также при осуществлении мониторинга окружающей среды. Посевы термостатируются при температуре 30±1° С в течение 48±3 ч.
- тест-пластины типа 2 для экспрессного подсчета КМАФАнМ в пищевых продуктах, объектах внешней среды (воздух, производственные поверхности). В их состав включены готовая питательная среда, желирующий водорастворимый агент, индикатор цветной, облегчающий учет колоний. Посевы термостатируются при температуре 37±1° С в течение 24±2 ч.
Определение КМАФАнМ с использованием тест-пластин проводили в соответствии с инструкцией по применению.
На тест-пластинах подсчитывали все окрашен-
ные колонии после инкубирования посевов вне зависимости от их размера и интенсивности. На тест-пластине типа 1 - все красные колонии, на тест-пластине типа 2 - все красные и синие колонии. Для подсчета применяли лупы, стандартный счетчик колоний или автоматическое считывающее устройство. В тех случаях, когда число колоний было более трехсот, на тест-пластинах наблюдалось окрашивание в красный, розовый либо синий цвета всей зоны роста. При этом посередине тест-пластины отсутствуют колонии, а по периферии, наоборот, они отчетливо видны. Поэтому с целью более точного подсчета количества микроорганизмов нужно повысить разведение образца и повторно провести анализ.
В посевах разведений, количество колоний в которых не превышало трехсот, следует проводить подсчет. Результаты подсчета количества колоний будут наиболее достоверными тогда, когда хотя бы на одной пластине содержится не менее пятнадцати колоний.
Результаты экспериментальных исследований Выявление чувствительности питательных сред Чувствительность питательных сред должна составлять не менее 0,1 мл суспензии из 6-го разведения для плотных и 1 мл из 7-го разведения для жидких сред. Результаты разведения суспензии тестового штамма приведены в табл. 1.
Таблица 1 - Разведение суспензии тестового штамма
Показатель, КОЕ/на чашку Результат
Количество колоний при посеве 0,1 мл из 6 разведений 101 99 107
Среднее количество колоний на чашке при посеве 0,1 мл из 6 разведения Норма=100±20 102
Количество колоний при посеве 0,1 мл из 7 разведения 9 12 11
Среднее количество колоний на чашке при посеве 0,1 мл из 7 разведения Норма=1/10 от среднего значения для 6-го разведения 10
С целью выявления чувствительности питательных сред использовали суспензию тестового штамма из 5, 6, 7 и 8 разведений по 0,1 мл. Посев каждой дозы суспензии живых клеток выполняли в объеме не менее чем на три чашки или пластины. В таблице 1 представлены результаты контроля разведения суспензии тестового штамма.
Данные, представленные в таблице, свиде-Таблица 2 - Определение показателей чувал
тельствуют о том, что разведение суспензии было произведено корректно: в 6-ом разведении выросло около 100 КОЕ/на чашку, в 7-ом разведении - около 10, что соответствует норме, которая используется при определении чувствительности. Результаты определения чувствительности питательного агара и тест-пластин представлены в таблице 2.
тельности питательного агара и тест-пластин
Наименование среды Номер чашки или пластины Условия посева - по 0,1 мл из разведения:
5 6 7 8
Питательный агар 1 + + + -
2 + + + -
3 + + + -
Тест-пластины тип 1 1 + + + -
2 + + + -
3 + + + -
Тест-пластины тип 2 1 + + + -
2 + + + -
3 + + + -
Данные, представленные в таблице 2, свидетельствуют о том, что чувствительность и питательного агара, и тест-пластин хорошая: на всех чашках из 6 и 7 разведений наблюдается рост колоний. Из 8-го разведения на испытуемых средах их рост не наблюдался.
Определение процента извлекаемости (% всхожести) Посев производили как на питательный агар (контроль), так и на тест-пластины. Всхожесть определяли соотношением числа колоний на испытуемой питательной среде к числу колоний в контрольном варианте в процентах.
Результаты экспериментальных исследований представлены в таблице 3.
Таблица 3 - Определение процента извлекаемости на тест-пластинах
Среда Количество колоний Среднее количество колоний
1 2 3 4 5
Питательный агар 54 58 53 61 56 56,4
Тест-пластины тип 1 55 57 52 59 56 55,8
% всхожести 98,9
Тест-пластины тип 2 52 49 47 54 43 49,0
% всхожести 86,8
Данные, представленные в таблице 3, свидетельствуют о том, что процент извлекаемости (% всхожести) на тест-пластинах хороший (более 80%): на тест-пластинах типа 1 - 98,9%, на тест-пластинах типа 2 - 86,8%.
Сравнительные испытания результатов определения КМАФАнМ в образцах пищевых продуктов
классическим и экспрессным методом с применением тест-пластин Результаты экспериментальных исследований представлены в таблице 4.
Таблица 4 - Сличительные испытания результатов определения КМАФАнМ
Наименование образца Микробиологические исследования на определение КМАФАнМ, КОЕ в 1 г продукта % извлекаемости
классическим методом с применением тест-пластин тип 1 % извлекаемости с применением тест-пластин тип 2 % извлекаемости
Смыв со скорлупы яйца образец № 1 8,2103 8,4103 102,4 7,9103 96,3
-//- образец № 2 2101 2101 100 2-101 100
-//- образец № 3 2,5104 2,3104 92,0 2,1104 84,0
-//- образец № 4 7,7103 6,5103 84,4 6,2103 80,5
-//- образец № 5 3,3103 2,8103 84,8 2,7103 81,8
-//- образец № 6 2,5103 2,5103 100 2,3103 92,0
-//- образец № 7 3,8103 3,4 103 89,4 3,5103 92,1
Мясо птицы механической обвалки 2,6103 2,4 103 92,3 2,1103 80,7
Мясо птицы механической обвалки 6,2102 5,6-102 90,3 5,2102 83,8
Мясо птицы механической обвалки 3,5103 2,9103 82,8 2,8103 80,0
Мясо птицы механической обвалки 6,0102 5,2 102 86,6 5,4102 90,0
Мясо птицы механической обвалки 1,7104 1,6104 94,1 1,4104 82,3
Мясо птицы механической обвалки 8,1104 7,2104 88,8 7,3104 90,1
С9-
Продолжение таблицы 4
Мясо птицы механической обвалки 30 30 100 <10 100
Голень кур <10 <10 100 <10 100
Окорочок кур 5,4-103 5,2103 96,2 5,1103 94,4
Крыло кур 3,4104 2,9104 85,2 2,9104 85,2
Полутушка кур <10 <10 100 <10 100
Полутушка кур <10 <10 100 <10 100
Мясо птицы механической обвалки 6,8104 5,8104 85,3 5,5104 80,8
Мясо птицы механической обвалки 6,4104 6,1104 95,3 5,9104 92,2
Голень кур 5,8-103 5,3103 91,3 5,4103 93,1
Грудка кур 1,1103 9,6102 87,2 9,4102 85,4
Филе грудки кур 6,3102 5,8102 92,1 5,3102 84,1
Образцы продуктов из мяса птицы и яиц, поступающих в исследовательский лабораторный центр для определения количества КМАФАнМ, исследовали двумя методами, классическим и экспрессным, с применением тест-пластин с последующим сравнением полученных результатов. Всего было исследовано 17 образцов пищевых продуктов и 7 образцов смывов с поверхности скорлупы яиц.
Данные, представленные в таблице 4, свидетельствуют о том, что при определении КМАФАнМ
Рис. 1 - Рост микроорганизмов на тест-пластинах тип 1
Выводы
В результате проведенной работы по тестированию тест-пластин для определения КМАФАнМ в птицепродуктах было установлено следующее: - при сравнении чувствительности классических сред (питательный агар) при определении КМАФАнМ и тест-пластин типа 1 и типа 2 была выявлена высокая чувствительность как питательного агара, так и испытуемых тест-пластин. Для плотных питательных сред чувствитель-
в образцах пищевых продуктов классическим и экспресс-методом с применением тест-пластин результат сравнительных испытаний положительный. Во всех случаях он сопоставим с классическим методом: процент извлекаемости составил более 80%, а в некоторых случаях достигал 100%.
На рисунках 1 и 2 представлены колонии мезо-фильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов на тест-пластинах после инкубации.
Рис. 2 - Рост микроорганизмов на тест-пластинах тип 2
ность должна быть не менее 0,1 мл суспензии из шестого разведения. В опыте на всех чашках и тест-пластинах из 6 и 7 разведений выявлен рост типичных колоний, что свидетельствует об их высокой чувствительности;
- процент извлекаемости (% всхожести) на тест-пластинах хороший: на тест-пластинах типа 1 - 98,9%, на тест-пластинах типа 2 - 86,8%.
- при сравнительных исследованиях пищевых продуктов, поступающих в лабораторию, с по-
мощью классического метода и тест-пластин был получен положительный результат.
Во всех случаях результаты исследования на КМАФАнМ сопоставимы с классическим методом: процент извлекаемости составил более 80%, в некоторых случаях - даже 100%.
По результатам апробации метода можно сделать вывод о том, что тест-пластины для определения КМАФАнМ просты в использовании, надежны, имеют длительный срок хранения (1 год). При их применении уменьшаются сроки проведения анализа, трудоемкость исследований.
Результаты исследований были использованы при разработке государственного стандарта 7702.2.1 - «Продукты убоя птицы, продукция из мяса птицы и объекты окружающей производственной среды. Методы определения количества
мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов».
Список литературы
1. ГОСТ 31468-2012 «Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы. Метод выявления сальмонелл». - Режим доступа: docs.cntd. ги^оситепУ464671970.
2. Козак, С. С. Экспресс-метод определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в птицепро-дуктах / С. С. Козак, П. С. Левин // Птица и птице-продукты. - 2015. - № 1. - С. 18-23.
3. Соколов, Д. М. Автоматизация микробиологических исследований при оценке безопасности пищевых продуктов и сырья / Д. М. Соколов, М. С. Соколов // Молочная промышленность. - 2014. -№ 2. - С. 70-73.
OF THE ACCELERATED METHOD OF CALCULATION OF MEZO-FILNYH AEROBIC AND OPTIONALLY ANAEROBIC MICROORGANISMS IN POULTRY-FARMING PRODUCTS
Kozak Sergey S., is a doctor of veterinary sciences, professor, chief researcher of the laboratory for sanitary and hygienic assessment of raw materials and products, All-Russian Research Institute of the Poultry Industry (VNIIPP) - branch of the Federal State Budgetary Scientific Institution of the Federal Scientific Center "All-Russian Research and Technology Institute poultry farming of the Russian Academy of Sciences, vniippkozak@gmail.com
Semenov Vladimir G., is a doctor of biological science, professor, head of the department of morphology, obstetrics and therapy of Chuvash State Agricultural Academy, semenov_v.g@list.ru
Abdraimov Rafat T., is a graduate student, vniippkozak@gmail.com
Kozak Yulia A., is a candidate of veterinary, leading researcher of the laboratory for sanitary and hygienic assessment of raw materials and products, vniippkozak@gmail.com
All-Russian Research Institute of the Poultry Industry (VNIIPP) - branch of the Federal State Budgetary Scientific Institution of the Federal Scientific Center "All-Russian Research and Technology Institute poultry farming of the Russian Academy of Sciences
Approbation and comparative tests of test-plates designed to count the number of mesophilic aerobic and facultative anaerobic microorganisms (NMAFAnM) in poultry products were carried out. Laboratory tests included identifying the sensitivity ranges of test plates for determining NMAFAnM, calculating the percentage of their recoverability (% germination) from the surface of the test-plates, as well as conducting their comparative tests using the classical analysis method. Type 1 test-plates contain ready-made nutrient medium, gel and tetrazolium indicator; they are used to calculate NMAFAnM in food samples, food raw materials, and also when monitoring the environment. Type 2 test-plates are intended for express counting of NMAFAnM in food products and environmental objects; they contain ready-made nutrient medium, a water-soluble gelling agent and a color indicator. When comparing the sensitivity of classical media and type 1 and type 2 test-plates when determining NMAFAnM, a high sensitivity of both nutrient agar and test test-plates was established. For solid media, it is at least 0.1 ml of a suspension of 6 dilutions. In our studies, the growth of typical colonies was revealed on all plates and test-plates from 6 and 7 dilutions, which indicates high sensitivity. The recovery rate on the test-plates was found to be good: 98.9% on type 1 test-plates and 86.8% on type 2 test-plates. In a comparative study of the classical method and test-plates, a good result was obtained. In all cases, the results of studies on NMAFAnM test-plates are comparable with the classical method: the percentage of extractability of the tested material was more than 80%, in some cases even 100%. Test-plates for determining NMAFAnM are easy to use, reliable, have a long shelf life (1 year), with their use, the analysis time is reduced, and the complexity of research is reduced.
Key words: test-plates for calculation NMAFAnM, classical environments, poultry products.
Literatura
1. GOST 31468-2012 «Myaso pticy, subprodukty i polufabrikaty iz myasa pticy. Metod vyyavleniya sal'monell». - Rezhim dostupa: docs.cntd.ru>document/464671970.
2. Kozak, S. S. Ekspress-metod opredeleniya kolichestva mezofil'nyh aerobnyh i fakul'tativno-anaerobnyh mikroorganizmov v pticeproduktah / S. S. Kozak, P. S. Levin // Ptica i pticeprodukty. - M., 2015. - № 1. - S. 18-23.
3. Sokolov, D. M. Avtomatizaciya mikrobiologicheskih issledovanij pri ocenke bezopasnosti pishchevyh produktov i syr'ya /D. M. Sokolov, M. S. Sokolov//Molochnaya promyshlennost'. - M., 2014. - № 2. - S. 70-73.
