CC BY
67
УДК 614.31 - 049.5:664 - 027.3
Ускоренный метод определения санитарной безопасности
пищевых продуктов
И. В. Пилипенко, канд. техн. наук, доцент Одесская национальная академия пищевых технологий
Проблема качества и безопасности пищевого сырья и продуктов его переработки многогранна, и наиболее важным критериальным аспектом ее является микробиологическая безопасность продукции. Санитарную безопасность пищевых продуктов определяет регламентация нормативными документами наличия микроорганизмов отдельных групп и видов. К ним относят патогенные, условно-патогенные микроорганизмы, возбудители порчи пищевых продуктов, эмерджентные биологические опасности. Особое место среди них занимает Clostridium perfringens - широко распространенный в окружающей среде микро-
организм, который может конта-минировать сырье и пищевые продукты. Это анаэробная неподвижная спорообразующая палочковидная бактерия, которая вызывает газовую гангрену и острое кишечное заболевание. Считается, что примерно 7% пищевых отравлений связано с заражением пищевых продуктов Clostridium perfringens, причем тяжесть заболевания может быть различной, но в случае некротического энтерита высока вероятность смертельного исхода [1, 2]. Источником инфекции могут быть мясо и мясные продукты, рыба, морепродукты. В качестве причины вспышек заболевания также отмечены такие продукты,
как овощные салаты, холодные мясные закуски, изделия из измельченного мяса, бобовые и макаронные блюда. В плодоперерабатывающей промышленности основную опасность представляет, по-видимому, реконтаминация сырья. В консервах Clostridium perfringens следует рассматривать как возбудителя их бом-бажной порчи и пищевых отравлений людей. Споры Clostridium perfringens могут сохраняться в овощных, фруктовых и томатных консервах, стерилизуемых при температуре 105 °С и ниже. Анализ известных классических и современных методов определения Clostridium perfringens показывает их длительность и недостаточную специфичность [2-5]. Имеются исследования с использованием свечения при гибридизации в комбинации с культивированием на фильтре (FISHFC) с целью сокращения времени для специфического выявления и количественного учета жизнеспособных Clostridium perfringens в сравнении с классическими методами, однако длительность только процедуры культивирования по этому методу составляет 6 ч [6]. Это обусловливает необходимость разработки ускоренных надежных методов выявления Clostridium perfringens, что особенно важно для скоропортящегося сырья, полуфабрикатов и продуктов длительного хранения.
I6S pPHK
M I 2 3 -I 5 6 7
Рис. 1. Визуализация продуктов ПЦР-анализа 16S рРНК гена геномной ДНК Clostridium perfringens при помощи электрофореза на 2%-ном агар-геле. Полосы на геле соответствуют следующим концентрациям клеток: полоса 1 -100000 клеток/мл; полоса 2 - 50000 клеток/мл; полоса 3 -20000 клеток/мл; полоса 4 -15000 клеток/мл; полоса 5 -10000 клеток/мл; полоса 6 - 5000 клеток/мл; полоса 7- 2000 клеток/мл; полоса М содержат ДНК маркеры
60000
О 20000 40000 60000 80000 100000 120000
Рис. 2. Калибровочный график по результатам ПЦР-анализа 16S рРНК генов, полученных при разбавлении чистой культуры Clostridium perfringens. По оси Х -концентрации Clostridium perfringens, выраженные числом клеток в 1 мл объема; по оси У -денсиметрические единицы (обработка фотографии геля программой ImageJ)
Цель исследования - разработка ускоренного видоспецифично-го метода индикации Clostridium perfringens в пищевом сырье и продуктах его переработки.
При разработке ускоренного способа выявления Clostridium perfringens осуществляли следующие процедуры:
отбор пробы для анализа; выделение ДНК из полученных проб;
проведение полимеразной цепной реакции ( ПЦР); анализ продуктов ПЦР; оценка безопасности образцов пищевых продуктов.
Как показал аналитический обзор, необходимость выявления сульфит-редуцирующих клостридий и проведения количественного определения Clostridium perfringens обусловлена его регламентацией нормативными документами [7 - 9], согласно которым установлена масса продукта, в которой они не допускаются (табл. 1). Следует также отметить, что наличие Clostridium perfringens в консервах с рН выше 3,5 не допускается и должно систематически контролироваться.
В соответствии с приведенной схемой процедур при разработке способа из основной биомассы образца выделяли клетки содержащихся в нем различных микроорганизмов и отделяли их от основной биомассы образца. В выделенных клетках микроорганизмов проводили их лизис в присутствии ингибитора ДНКазы. Подробное описание подготовительных этапов приведено в [2]. Для проведения ПЦР-анализа размораживали реактивы на льду и готовили реакционную смесь с использованием праймеров, специфических к гену 16S рибосомальной РНК Clostridium perfringens, добавляли
Таблица 2
Степень санитарной безопасности пищевых продуктов и пищевого сырья по Clostridium
perfringens
Продукт Плотность продукта ПЦР, усл. ед. Концентрация Clostridium perfringens в пробе, клеток /мл Pan^-мен-тированная навеска, г Округленное до 1 количество копий Clostridium perfringens, присутствующее в регламентированной навеске Степень санитарной безопасности
Зеленый горошек перед стерилизацией 3130 5700 G,5 14 Продукт не безопасен
Сардельки варёные 230 420 G,G1 0 Продукт безопасен / высокий уровень безопасности
Рулет свиной варёный 40240 73 400 G,G1 4 Продукт не безопасен
Окорок свиной варёный 0 0 G,G1 0 Продукт безопасен / высокий уровень безопасности
Колбаса «Салями» 12890 23600 G,G1 1 Продукт не безопасен
25 мкл пробы и помещали содержимое в ПЦР-машину - 9600 GeneAmp (PerkinElmer). Задавали режим амплификации, а после окончания ПЦР пробы охлаждали до 4 °С.
В случае необходимости количественного определения Clostridium perfringens его осуществляли путём построения калибровочного графика с измерением количества копий ДНК. Для этого культуру Clostridium perfringens, выращенную на сахарном кровяном агаре, использовали для анализа ресуспендированием в дистиллированной воде из расчёта примерно 106 клеток на 1 мл. Готовили разбавленные клеточные суспензии с концентрациями: 1х105, 5х104, 15х103, 10х103, 5х103, 2х103 клетки в 1 мл, которые подвергали ПЦР-анализу аналогично описанному выше. Анализ продуктов ПЦР-амплификации с помощью гель-электрофореза показан на рис. 1.
Продукты ПЦР анализировали с помощью гель-электрофореза,
а количественное содержание продуктов ПЦР в геле измеряли путем обработки фотографии при помощи программы ImageJ. По полученным результатам строили калибровочный график (рис. 2).
Регрессионное уравнение,полученное при построении этого графика, позволяет определить концентрацию Clostridium perfringens в 1 мл объема пробы по формуле
Х=У/0,548,
где Х - искомая концентрация клеток в 1 мл объема пробы, У - плотность пятна на геле, представляющего искомый продукт ПЦР.
По разработанному ПЦР-анализу проводили исследование образцов пищевых продуктов на наличие Clostridium perfringens и их количественную характеристику. При обнаружении заданной праймерами длины ампликона определяли количество копий геномной ДНК Clostridium perfingens. Для этого использова-
^ УПРАВЛЕНИЕ КАЧЕСТВОМ И БЕЗОПАСНОСТЬЮ ПИЩЕВОЙ ПРОДУКЦИИ
У ТЕМАНОМЕРА
Таблица 1
Регламентируемые нормы сульфитредуцирующих клостридий в пищевых продуктах
Продукт Масса продукта, в которой не допускаются сульфитреду-цирующие клостридии, г
Кровь пищевая 1,0
Продукты переработки крови:
альбумин пищевой 1,0
сухой концентрат плазмы (сыворотки) крови 1,0
Колбасы и продукты из мяса убойных животных сырокопченые и сыровяленые, в том числе нарезанные и упакованные под вакуумом 0,01
Колбасы полукопченые и варено-копченые 0,01
Колбасы варено-копченые, полукопченые, сроки годности которых превышают 5 сут, в том числе нарезанные и упакованные под вакуумом, в условиях модифицированной атмосферы 0,1
Изделия колбасные вареные (колбасы, сосиски, сардельки, хлеб мясной):
высшего и первого сорта 0,01
второго сорта 0,01
Колбасы вареные с добавлением консервантов, в том числе деликатесные 0,1
Изделия колбасные вареные, сроки годности которых превышают 5 сут, нарезанные и упакованные под вакуумом, в условиях модифицированной атмосферы 0,1
Продукты мясные вареные: окорока, рулеты из свинины и говядины, свинина и говядина прессованные, ветчина, бекон, мясо свиных голов прессованное, баранина в форме 0,1
Продукты мясные копчено-вареные:
окорока, рулеты, корейка, грудинка, шейка, балык свиной и в оболочке 0,1
щековина (баки), рулька 0,01
Продукты мясные копчено-запеченные, запеченные 0,1
Продукты вареные и запеченные, копчено-запеченные, сроки годности которых превышают 5 сут, в том числе нарезанные и упакованные под вакуумом, в условиях модифицированной атмосферы 0,1
Колбасы кровяные 0,1-0,01 для продуктов, сроки годности которых превышают 2 сут
Зельцы 0,1
Колбасы ливерные 0,01
Паштеты из печени и (или) мяса, в том числе в оболочках 0,1
Желированные мясные продукты (студни, холодцы, заливные и т. д.) 0,1
Микробиологические показатели безопасности (промышленная стерильность) полуконсервов группы Д: пастеризованные мясные, мясо-растительные, рыбные и рыбно-растительные консервированные продукты (шпик, соленый и копченый бекон, сосиски, ветчина и др.) 0,1 г (см3) продукта, кроме рыбных полуконсервов, норматив для которых -1,0 г (см3)
Колбасные изделия сыровяленые, сырокопченые 0,01
Колбасные изделия сыровяленые, сырокопченые, нарезанные и упакованные под вакуумом, в условиях модифицированной атмосферы 0,1
Колбасные изделия:
полукопченые 0,01
нарезанные и упакованные под вакуумом, в условиях модифицированной атмосферы 0,1
Вареные колбасные изделия (колбасы, мясной хлеб, сосиски, сардельки, рулеты, ветчина и др.) 0,1
Варено-копченые колбасы 0,1
Тушки и части тушек птицы и изделия запеченные, варено-копченые, копченые 0,1
Тушки и части тушек птицы и изделия сырокопченые, сыровяленые 0,1
Кулинарные изделия из рубленого мяса 0,1
Мясопродукты с использованием субпродуктов птицы, шкурки (паштеты, ливерные колбасы и др.) 0,1
Пресервы пряного и специального посола из неразделанной и разделанной рыбы 0,01
Пресервы малосоленые пряного и специального посола из рыбы:
неразделанной 0,01
разделанной 0,01
Пресервы из разделанной рыбы с добавлением растительных масел, заливок, соусов, с гарнирами и без гарниров (в том числе из лососевых рыб) 0,01
Пресервы «Пасты»:
пасты рыбные 0,01
из белковой пасты 0,1
Пресервы из термически обработанной рыбы 1,0
Полуконсервы пастеризованные из рыбы в стеклянной таре 1,0 г (см3)
Рыбная продукция горячего копчения, в том числе замороженная 0,1*
Рыбная продукция холодного копчения, в том числе замороженная 0,1*
Продолжение таблицы 1
Продукт Масса продукта, в которой не допускаются сульфитреду-цирующие клостридии, г
Рыба соленая, пряная, маринованная, в том числе замороженная: 0,1*
рыба вяленая 0,1
рыба провесная 0,1*
рыба сушеная 0,01*
Кулинарные изделия с термической обработкой:
рыба и фаршевые изделия, пасты, паштеты, запеченные, жареные, отварные, в заливках и др.; с мучным компонентом (пирожки, пельмени и т. п.); в том числе замороженные; 1,G*
многокомпонентные изделия - солянки, пловы, закуски, тушеные морепродукты с овощами, в том числе замороженные 1,G*
Варено-мороженая продукция:
быстрозамороженные готовые обеденные и закусочные рыбные блюда, блинчики с рыбой, начинка рыбная, в том числе упакованные под вакуумом G,1*
изделия структурированные («крабовые палочки» и др.) 1,G
Икра осетровых, лососёвых и других видов рыб: зернистая баночная, ястычная, пробойная, солёная и слабосолёная, копчёная, вяленая, пастеризованная и непастеризованная 1,G
Аналоги икры, в том числе белковые G,1
Нерыбные объекты промысла - двухстворчатые моллюски (мидии, устрицы, гребешок и др.), живые G,1
Пресервы из нерыбных объектов промысла с добавлением растительных масел, заливок, соусов, с гарниром и без гарнира G,G1
Вяленая и сушеная продукция из морских беспозвоночных G,1
Варено-мороженая продукция из нерыбных объектов промысла 1,G*
Сушеные и белковые нерыбные объекты морского промысла:
сухой мидийный бульон, бульонные кубики и пасты, белок изолированный 0,01
белково-углеводный концентрат из мидий 0,1
Грибы заготовляемые соленые и маринованные в бочках, отварные в бочках 0,1 - мезофильные суль-фитредуцирующие клостридии
Специи и пряности, готовые к употреблению 0,01
Комплексные пищевые добавки со специями и пряными овощами 0,01
Пищевкусовая приправа - горчица, хрен столовые 0,01
Продукты из шпика свиного и грудинки свиной соленые, копченые, копчено-запеченные 0,1
Изоляты, концентраты растительных белков, мука соевая 0,1
Концентрат соевого белка, мука соевая текстурированные 0,1
Казеинаты пищевые 0,01
Соусы кулинарные порошкообразные (тепловой сушки) 1,0
Концентраты обеденных блюд, не требующие варки (супы-инстант) 0,1
Первые и вторые обеденные блюда экструзионной технологии, не требующие варки 1,0
Сухие продукты для профилактического питания - смеси крупяные, молочные, мясные (экструзионной технологии) 1,0
Готовые кулинарные изделия из мяса птицы, рыбы в потребительской таре, в том числе упакованные под вакуумом 0,1*
Консервы группы А и неконцентрированные томатопродукты:
контроль перед стерилизацией;
детское питание; Споры мезофильных и термофильных клостридий в 0,5 см3
консервы общего назначения 0,1 см3
* Только упакованные под вакуумом
ли регрессионное уравнение, полученное при построении графика (рис. 2), которое позволяет определить концентрацию Clostridium perfringens в 1 мл объема пробы.
Результаты определения Clostridium perfringens в различных образцах пищевых продуктов с учетом характеристик проб, представ-
ляющих образец (г/мл), приведены в табл. 2.
По результатам проведенного анализа делали вывод о наличии в пробе Clostridium perfringens, а по количеству копий судили о санитарной безопасности пищевых продуктов и их соответствии регламентируемым требованиям. Обнаружение в ре-
гламентированной навеске продукта определяемого микроорганизма свидетельствовало о его санитарной опасности. Аналитическая чувствительность ПЦР-анализа гена 16S рРНК для Clostridium perfringens составляет 2 и более клетки в 1 мкл пробы.
Сравнение с основными классическими продолжительными или не-
^ УПРАВЛЕНИЕ КАЧЕСТВОМ И БЕЗОПАСНОСТЬЮ ПИЩЕВОЙ ПРОДУКЦИИ
У ТЕМА НОМЕРА
достаточно специфичными методами определения микроорганизмов-контаминантов Clostridium perfringens в пищевом сырье и продуктах его переработки позволяет охарактеризовать разработанный ПЦР-метод определения этого микроорганизма как индикативный, видоспеци-фический и ускоренный. Продолжительность ПЦР-анализа в 1,5 -2 раза меньше в сравнении с FISHFC-методом и в десятки раз - в сравнении с 3 - 5-суточным культивированием и диагностикой по традиционным методам.
Таким образом, Clostridium perfringens охарактеризован как микроорганизм - контаминант пищевого сырья и продуктов его переработки. В результате анализа известных классических и современных методов определения Clostridium perfringens разработан индикативный ускоренный метод определения этих микроорганизмов в пищевых продуктах с использованием полимеразной цепной реакции, позволяющий получить достоверный качественный либо количественный результат и характеризовать регламентируемую степень санитарной безопасности пищевого сырья и продуктов его переработки,
что особенно важно для скоропортящегося сырья и продуктов длительного хранения. Разработанный ПЦР-способ позволяет в десятки раз ускорить определение Clostridium perfringens в различных пищевых продуктах и пищевом сырье в сравнении с традиционными методами исследования.
ЛИТЕРАТУРА
1. Персианова, И. П. Микробиология консервирования и микробиологический контроль консервного производства/И. П. Персианова, Л. Н. Герасименко, Л. А. Стоянова. - Одесса: Внешре-кламсервис, 2010. - 310 с.
2. Пилипенко, Л.Н. Консервирование пищевых продуктов. Микробиология, энергетика, контроль: монография/Л.Н. Пилипенко, Я.Г. Верхивкер, И.В. Пилипенко. -Одесса: ВМВ, 2015. - 232 с.
3. ISO 7937. Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the enumeration of Clostridium perfringens. Colony-count technique (ISO 7937:2004).
4. ГОСТ 10444.9. Межгосударственный стандарт. Продукты пищевые. Методы определения Clostridium perfringens. 2002.
5. ГОСТ 29185 - 91 (действующий). Продукты пищевые. Методы выявления и определенияя количества сульфитре-дуцирующих клостридий.
6. Shimizu, S. Fluorescent in situ hybridization in combination with filter cultivation (FISHFC) method for specific detection and enumeration of viable Clostridium perfringens/S. Shimizu [et al.] // Food Microbiology. - 2009. -V. 26. - P. 425 - 431.
7. 1нструк^я про порядок санггарно-техтчного контролю консерв1'в на ви-робничих пщприсмствах, оптових базах, в роздр1'бнш торпвл1' та на пщприсмст-вах громадського харчування № I 4.4.4.077 - 2001, затв. постановою Головного державного санггарного лжаря УкраТни 07.11.2001. - № 140.
8. СанПиН 2.3.2.1078 - 01. Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов. Санитарно-эпидемиологические правила и нормативы СанПиН 2.3.2.1078 - 01, введены с 01.09.2002 г.
9. Пилипенко, Ю.Д. Державнi нормативн документи на сировину, натвфабрикати, матерiали та консерво-вану продукцт. Показники безпечносп та якосп/ Ю. Д. Пилипенко[и др.] // Методичн вказiвки. Видання офщшне. -Киев: М^агрополггики, 2009. - 114 с.
Ускоренный метод определения санитарной безопасности пищевых продуктов
Ключевые слова
Clostridium perfringens; пищевые продукты; ПЦР-анализ; санитарная безопасность; ускоренный метод
Реферат
Описано биологическое действие микроорганизма Clostridium perfringens, его способность вызывать пищевые отравления людей, порчу пищевых продуктов. Клостридии широко распространены в окружающей среде, что обуславливает контаминирование ими сырья и пищевых продуктов. В связи с этим наличие Clostridium perfringens регламентируется в сырье и пищевых продуктах, в консервах с рН выше 3,5 не допускается и должно систематически контролироваться. Clostridium perfringens как микроорганизм-контаминант является критерием санитарной безопасности продуктов. Охарактеризованы классические и современные методы определения Clostridium perfringens в пищевых продуктах. Показано, что в основном они являются продолжительными или недостаточно специфичными. Приведены результаты разработки индикативного ускоренного метода определения Clostridium perfringens в пищевых продуктах с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). Разработанный ПЦР-способ позволяет в десятки раз ускорить определение Clostridium perfringens в сравнении с традиционными методами исследования, получить достоверный качественный либо количественный результат и охарактеризовать регламентируемую степень санитарной безопасности продуктов, что особенно важно для скоропортящегося сырья и продуктов длительного хранения.
Авторы
Пилипенко Инна Васильевна, канд. техн. наук, доцент Одесская национальная академия пищевых технологий, 65039, Украина, г. Одесса, ул. Канатная, д. 112, inna_p@live.ru (l.pylypenko@mail.ru)
A rapid method of the determination of sanitary safety of food products
Key words
Clostridium perfringens; food products; PCR - analysis; sanitary safety; accelerated method
Abstracts
The biological activity of Clostridium perfringens, its ability to cause the food poisoning of people, spoilage of food products have been described. These clostridia are widely distributed in the environment that leads to contamination of raw material and food products by means of them. In this regard, Clostridium perfringens is regulated in raw materials and food products, it is not allowed in can food with a рН above 3.5 and this microorganism should be systematically controlled. Clostridium perfringens as the microorganism-contaminant is a criterion of sanitary safety of products. The classic and modern methods of determination of Clostridium perfringenshave been characterized. It has been shown that the basic methods of identification of this microorganism in food products are either prolonged or insufficiently specific. The results of development of indicative accelerated method for determination of Clostridium perfringens in food products using polymerase chain reaction (PCR) have been presented. The developed PCR-method allows to make determination of Clostridium perfringens ten times as quick in comparison with the traditional methods of research, to get a reliable high-qualitive or quantitative result and describe the regulated degree of sanitary safety of products, that is especially important for perishable raw materials and the long-term storage ones.
Authors
Pylypenko Inna Vasil'yevna, PhD, Technical Sciences, Associate Professor
Odessa National Academy of Food Technologies Kanatnaya, 112, Odessa, Ukraine, 65039, inna_p@live.ru, l.pylypenko@mail.ru
