CC BY
50
УДК / UDC 576.3.001.5:581.3.001.5:631.52
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЦИТОЭМБРИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ В СЕЛЕКЦИОННОЙ ПРАКТИКЕ ВНИИСПК (К 170-ЛЕТИЮ ФГБНУ ВНИИ СЕЛЕКЦИИ
ПЛОДОВЫХ КУЛЬТУР)
USING OF CYTOEMBRYOLOGICAL RESEARCH IN BREEDING OF VNIISPK (TO THE 170TH ANNIVERSARY OF FGBU RESEARCH INSTITUTE OF FRUIT CROPS
SELECTION)
Горбачева Н.Г.*, кандидат сельскохозяйственных наук Gorbacheva N.G., Candidate of Agricultural Sciences Седышева Г.А., доктор сельскохозяйственных наук Sedysheva G.A., Doctor of Agricultural Sciences ФГБНУ ВНИИСПК, Орловская область, Россия FGBNU VNIISPK, Orel region, Russia
*E-mail: gorbachevanata81@yandex.ru
АННОТАЦИЯ
Дается краткая информация об основных направлениях научной деятельности ВНИИСПК. Более подробно описывается работа лаборатории цитоэмбриологии, ее значение в решении вопросов плодоводства: в селекции яблони на полиплоидном уровне при создании триплоидных сортов и отдаленной гибридизации вишни для получения сортов, устойчивых к грибным болезням. Цитологический анализ микро- и макроспорогенеза исходных форм позволяет охарактеризовать качество формирующихся гамет (мужских и женских) и возможность использования этих форм в селекции для получения высокоадаптивных сортов с хозяйственно-ценными признаками.
ABSTRACT
Brief information is given on the basic directions of the scientific activity of the All Russian Research Institute of Fruit Crop Breeding. The work of the cytoembryology laboratory and its importance in the solving fruit growing tasks are detailed: in apple breeding on the polyploidy level when creating triploid varieties and remote hybridization of cherry for obtaining varieties resistant to fungal diseases. The cytological analysis of micro and macrosporogenesis of initial forms gives opportunity to characterize the quality of forming gametes (male and female) and possibility to use these forms in breeding for obtaining highly adaptive varieties with valuable traits.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА
Цитоэмбриология, селекция, яблоня, полиплоидия, вишня, отдаленная гибридизация, микроспорогенез.
KEY WORDS
Cytoembryology, breeding, apple, polyploidy, cherry, remote hybridization, microsporogenesis.
Всероссийский научно-исследовательский институт селекции плодовых культур (ВНИИСПК) является старейшим помологическим учреждением по садоводству. В этом году институту исполняется 170 лет (официальная дата основания - 28 апреля 1845 года). За это время институт не менял своего основного помологического и селекционного направления исследований.
В настоящее время это одно из ведущих селекционных учреждений России -селекционный центр по плодовым культурам с большими научными достижениями, традициями и исследовательскими школами.
Основными направлениями научной деятельности ВНИИСПК в настоящее время являются: создание новых конкурентоспособных сортов плодовых и ягодных растений,
пригодных для выращивания по современным интенсивным технологиям; разработка теоретических и методических основ создания новых форм плодовых и ягодных растений с использованием методов комбинативной селекции, полиплоидии и биотехнологии; мобилизация, сохранение и изучение мирового генофонда плодовых растений и их диких сородичей для использования в селекции; совершенствование имеющихся и разработка новых ресурсосберегающих технологий производства плодов, ягод и посадочного материала на базе новых сортов. Активно развиваются приоритетные направления селекции: селекция на морозо- и зимостойкость, на иммунитет и высокую устойчивость к болезням и вредителям, слаборослость и компактность габитуса, пригодность к механизированной уборке урожая, высокую самоплодность, улучшенный биохимический состав и вкусовые качества плодов, пригодность их к различным видам переработки и хранению, селекция на полиплоидном уровне и др. В институте создано около 180 сортов плодовых и ягодных культур, из которых 123 допущены к использованию. 52 сорта яблони, 8 сортов груши, 21 сорт вишни, 4 сорта черешни, 7 сортов сливы, 2 сорта абрикоса, 8 подвоев для вишни, 13 сортов смородины черной и 8 сортов смородины красной [1].
ВНИИСПК единственное в России учреждение осуществляющее исследования по получению триплоидных сортов яблони от целенаправленных скрещиваний с использованием доноров диплоидных гамет. Получение новых адаптивных триплоидных сортов - важное направление исследований в рамках программы по селекции яблони на полиплоидном уровне. Целенаправленная селекция яблони на полиплоидном уровне - принципиально новый и эффективный метод в селекции. Группой ученых под руководством академика Седова Е.Н. впервые в России и в мире получены триплоидные сорта (Масловское, Августа, Дарёна, Бежин луг, Орловский партизан и др.), отличающиеся повышенными адаптивными и хозяйственно ценными свойствами. Создано 21 (17 от разнохромосомных скрещиваний; 4 от скрещивания диплоидных сортов) новых триплоидных сортов, которые характеризуются регулярным плодоношением и высокой товарностью плодов. Часть новых сортов обладает иммунитетом к парше [2].
В проведении исследований по этому разделу, наряду с селекционерами, большую работу выполняет лаборатория цитоэмбриологии. Селекция яблони, как и других плодовых культур, на полиплоидном уровне невозможна без проведения цитоэмбриологического изучения как на этапе подбора и создания исходных форм, так и на этапе оценки полученных в результате гибридизации полиплоидных сортов и гибридов. Таким образом, в связи с необходимостью осуществления постоянного цитоэмбриологического контроля полиплоидных исходных форм в 1976 году во ВНИИСПК была создана цитологическая лаборатория под руководством заведующей лабораторией, доктором с.-х. наук Г. А. Седышевой [3]. В настоящее время лаборатория цитоэмбриологии - практически единственная в России лаборатория, занимающаяся подобными видами исследований. В практике селекционных работ с плодовыми культурами применение цитологических исследований имеет важное значение в решении вопросов плодоводства. Зная особенности формирования микро-и макроспор, можно достаточно точно охарактеризовать качество формирующихся гамет (мужских и женских). Последнее дает возможность селекционеру осознанно подойти к вопросам постановки генетико-селекционных опытов, к выбору конкретных методов исследований, подбору исходных форм, определению сроков и нужного объема скрещиваний, чтобы получить достаточное количество гибридного материала для последующего изучения и отбора хозяйственно-ценных форм.
Анализ плоидности у гибридных сеянцев, полученных от разнохромосомных скрещиваний, позволяет выявить выход триплоидных растений, что также имеет большое значение для выделения в дальнейшем новых ценных сортов яблони.
Исследование мейоза в пыльниках при работе с плодовыми позволят изучить характер редукционного деления и предсказать фертильность или стерильность гибрида.
Изучение развития, строения и прорастания пыльцы на искусственной среде и на рыльцах пестика помогает определять качество пыльцы и тем самым выявить лучшие сорта - опылители. Изучение картин деления первичного ядра пыльцевых зерен
позволяет установить числа хромосом в гаметах, образующихся в редукционном делении.
Изучение женского гаметофита, его развития, а также строения семяпочки и зародышевого мешка помогает установить насколько эти процессы протекают нормально и позволяют определить перспективность сорта как производителя плодов и семян, что важно при использовании его в качестве материнской исходной формы.
В лаборатории цитоэмбриологии ведется систематическая инвентаризация уровня плоидности коллекции исходных форм, гибридного потомства от интервалентных скрещиваний разного типа (диплоид * тетраплоид, тетраплоид * диплоид и др.). За весь период работы проанализирована плоид ность около 700 сортообразцов коллекционных сортов, исходных форм, элитных и отборных сеянцев яблони. Определена плоидность гибридного потомства более 430 семей от разнохромосомных скрещиваний типа диплоид * тетраплоид, диплоид * триплоид, триплоид * тетраплоид, триплоид * диплоид, тетраплоид * диплоид, тетраплоид * триплоид и тетраплоид * тетраплоид общим объемом более 14,5 тыс. растений. Установлено, что наиболее эффективным способом массового получения триплоидов с целью отбора среди них хозяйственно ценных форм является скрещивание тетраплоидов с диплоидами. В среднем по всем комбинациям скрещивания типа диплоид * тетраплоид формируется 69,5%, а в скрещиваниях типа тетраплоид * диплоид 55, 1% триплоидных растений [4]. Чтобы увеличить выход триплоидных сеянцев необходимо учитывать степень самоплодности тетраплоидных форм, взятых в качестве материнского компонента. Например, низкий выход триплоидных и высокий процент тетраплоидных сеянцев в комбинации, где тетраплоид 30-47-88 использован в качестве материнской формы, обусловлен высокой самоплодностью этой формы: при опылении некастрированных цветков этой формы пыльцой диплоидных сортов на рыльце предпочтительно прорастала собственная пыльца. В комбинации скрещивания 30-47-88 (4х) х Краса Свердловска (2х) из 85 растений 5 растений (5,9%) имели триплоидный набор хромосом, 80 (94,1%) - тетраплоидный. Чтобы повысить выход триплоидных сеянцев в комбинациях скрещивания, где форма 30-47-88 (4х) является материнским родителем, необходимо производить кастрацию цветков. Количество же триплоидных сеянцев с участием в качестве опылителя формы 30-47-88 (4х) высокое (от 59,2% до 100%) [5].
Одно из направлений исследований лаборатории цитоэмбриологии ВНИИСПК -всестороннее изучение эмбриональных структур тетраплоидных форм яблони -доноров диплоидных гамет.
К настоящему времени подробно изучен ход мейоза при микроспорогенезе и формирование микроспор у 18 тетраплоидных форм яблони, формирование женского гаметофита у 12 исходных форм.
При сравнении между собой тетраплоидных форм яблони отмечены общие у них морфологические типы нарушений на всех стадиях микроспорогенеза. Так, на стадиях метафазы-! и II наиболее распространенными типами нарушений являются преждевременное забегание отдельных хромосом к полюсам веретена деления, выброс за пределы ахроматинового веретена, сверхчисленные веретена, часто встречаются микроспороциты с двумя и даже тремя типами нарушений одновременно в одном микроспороците (забегания + выброс и др.), асинхронное деление в разных веретенах. На стадии анафаза-1 и II чаще других типов встречаются выбросы и запоздалое деление (отставание) части бивалентов в центре веретена деления, мосты и комбинации из двух типов нарушений в одном микроспороците одновременно, например, отставание + выбросы. Стадия телофаза- и II характеризуются, в основном, наличием микроядер и сверхчисленных ядер. Часть таких нарушений приводит к формированию спорад с числом микроспор больше или меньше нормы. У подавляющего большинства тетраплоидных форм на стадии тетрад встречаются полиады с числом микроспор от 5 до 7, пентады, гексады, гептады, реже встречаются октады и нонады, а также диады и триады. Несмотря на значительное число нарушений микроспорогенеза, у большинства изученных форм мейоз завершается формированием значительного количества морфологически нормальной одномерной пыльцы. Изредка отмечены крупные пыльцевые зерна.
Макроспорогенез и формирование женского гаметофита у тетраплоидных форм сопровождаются некоторым количеством аномалий на разных этапах. Тем не менее, к началу цветения у всех изученных форм отмечено достаточное количество нормально сформированных зародышевых мешков, готовых к оплодотворению. Большинство изученных форм пригодны для использования в качестве материнских форм в скрещиваниях типа 4х х 2х [6]. На основании полученных данных в качестве доноров диплоидных гамет наиболее эффективными зарекомендовали себя сорта и формы: Уэлси тетраплоидный (2-4-4-4х), Джаент Спай (2-4-4-4х), 13-6-106 (сеянец сорта Суворовец) (4х), Папировка тетраплоидная (2-4-4-4х), Антоновка плоская (2-4-4-4х), 2537-45 (4х), 25-35-120 (4х), 25-35-144, Мелба (4х), Спартан (4х), 20-9-27 (4х), 25-37-47 (4х), 30-47-88 (4х). Особенно уникален донор диплоидных гамет 30-47-88 (4х), характеризующийся иммунитетом к парше. Использование его открывает большие возможности для создания адаптивных триплоидных сортов, иммунных к парше, способных давать экологически безопасную продукцию, что способствует повышению конкурентоспособности отечественной садоводческой продукции.
На основе отдаленной гибридизации с включением в селекционный процесс диплоидных видов во ВНИИСПК в лаборатории селекции косточковых культур доктором наук Джигадло Е. Н. получены доноры устойчивости к таким вредоносным заболеваниям косточковых культур, как коккомикоз и монилиоз. С помощью цитологических методов проанализирована плоидность полученных гибридов в том числе и отдаленных, изучены особенности формирования и качества мужских гамет у этих форм для определения возможности использования их в селекции для получения сортов вишни, устойчивых к данным заболеваниям.
Изучены микроспорогенез и формирование мужского гаметофита у 12 отдаленных гибридов вишни, женского гаметофита у 4 форм.
Установлено, что из тетраплоидных отдаленных гибридов наиболее правильным ходом мейоза отличается гибрид 82990 [Памяти Вавилова х 12-1а-320 (2822 х в. сахалинская)]. Число нарушений у него меньше, чем у других гибридов, а количество нормальных микроспороцитов на разных стадиях мейоза, соответственно, больше и составляет от 65,6 до 92,1%.
Более нарушенный мейоз характерен для тетраплоида 83187 (Памяти Вавилова х C. lannesiana № 1), процент аномальных клеток составляет от 20,9 до 68,5%, в зависимости от стадии деления. Каждой стадии мейоза присущи отклонения от нормы, общие для всех изученных гибридов вишни. Реже встречаются специфические нарушения: в метафазе-I наблюдали единичные случаи, когда микроспороцит был безъядерным, т. е. хроматин полностью отсутствовал (82990), диффузное размещение ассоциаций хромосом по всему микроспороциту; в анафазе-I расщепление веретена у гибрида 83187; на стадии телофаза-I у формы 85017 был зафиксирован микроспороцит, содержащий одно ядро, асинхронное развитие ядер - у гибрида 85023; метафаза-II - наличие трех фигур деления вместо обычных двух (83187, 85017 [Любская (Cerasus vulgarus Mill.) х в. Максимовича]), которые образуются из групп хромосом, выброшенных в процессе первого деления в цитоплазму микроспороцита или появляющихся в результате расщепления веретена; в анафазе-II сверхчисленные фигуры деления отмечены у гибрида 85023; на стадии телофаза-II наблюдали микроспороциты с двумя крупными ядрами (82990, №3 (в. Любская х в. Максимовича -свободное опыление)), из которых в дальнейшем образуются диады. У гибрида № 3 отмечали единичные случаи дегенерации хроматина.
Триплоидный гибрид 85023 (Любская х в. Максимовича) из-за несбалансированности числа хромосом (2n = 3х = 24), в отличие от тетраплоидов, характеризуется максимальным числом отклонений от нормы на всех стадиях микроспорогенеза. У него нарушена конъюгация хромосом, а также ход мейоза. Число нарушений на разных стадиях варьирует от 43,3% (стадия тетрад) до 80,2% (анафаза-I). Среди нарушений, которые обычно встречаются у полиплоидных форм и у отдаленных гибридов, у данной триплоидной формы в ходе мейоза наблюдаются микроспороциты, представляющие собой ценоцитные образования, с увеличенным числом фигур деления (например, шесть веретен нормально развитых на стадии метафазы-II или гигантские микроспороциты неправильной формы на стадии
телофазы-II, число ядер у которых может достигать до 20). Крупные конгломераты на разных стадиях мейоза наблюдали также и у отдаленного тетраплоидного гибрида 85017, что предположительно является следствием нарушения цитокинеза еще на стадии формирования вторичного археспория у отдаленных гибридов [7].
У триплоидных гибридов с разной плодовитостью формируется разное количество сбалансированных гамет. У частично плодовитой формы 85023 гаметы с п=2х=8 составляют 18,6%, гаметы с п=2х=16 - 4,7%. У плодовитой формы 1а-320 [селекционный № 65628 (№2822 х C. sachalinensis №1)] формируется около 5% гамет с гаплоидным числом хромосом, около 2% с диплоидным числом хромосом и 0,7% нередуцированных (п=3х=24) гамет. Неплодовитый триплоидный гибрид 1а-298 [селекционный № 65645 (№2822 х C. Sachalinensis №1)] формирует в 100% случаев несбалансированные по числу хромосом гаметы. Форма 74342 (Любская х C. sachalinensis Edwin Muller) также характеризуется наличием сбалансированных гамет: гаплоидных - 6,7% и диплоидных - 3,3%. В связи с этим частично плодовитые триплоидные формы представляют интерес для включения их в селекцию, что находит практическое подтверждение [8].
Анализ микроспорогенеза плодовитого пентаплоидного гибрида (Cerasus vulgaris х Pr. Serrulata) показал, что среди анеуплоидных гамет (80%) встречаются нормальные гаплоидные (1,3%), диплоидные (8,1%) и триплоидные (1,9%).
Гексаплоидная форма 3-66-9 (в. степная х смесь сортов в. обыкновенной) несмотря на нарушения в микроспорогенезе образует около 50% гамет со сбалансированным числом хромосом.
Исследованные формы продуцируют гетероплоидные гаметы и, как носители признаков устойчивости к коккомикозу и монилиозу представляют несомненный интерес для селекционных целей в качестве источников большого генетического разнообразия при получении форм вишни устойчивых к данным заболеваниям.
Таким образом, благодаря многолетней комплексной работе селекционеров и цитоэмбриологов, ведущейся во ВНИИСПК, получены практические результаты в селекции на полиплоидном уровне и отдаленной гибридизации ведущих плодовых культур - яблони и вишни.
БИБЛИОГРАФИЯ
1. Седов, Е. Н. Старейшее помологическое учреждение России / Е. Н. Седов.- Орел: Изд-во ВНИИСПК, 2006. - 296с.
2. Седов, Е. Н. Селекция и новые сорта яблони / Е. Н. Седов.- Орел: ВНИИСПК, 2011. - 624 с.
3. Седышева, Г. А. Полиплоидия и селекция яблони / Г. А. Седышева, Е. Н. Седов. -Орел: ВНИИСПК, 1994.- 272 с.
4. Седов, Е. Н. Селекция яблони на полиплоидном уровне / Е. Н. Седов, Г. А. Седышева, З. М. Серова. - Орел: ВНИИСПК, 2008.- 368 с.
5. Горбачева, Н. Г. Оценка полиплоидов яблони и отдаленных гибридов вишни как исходных форм в селекции: 06.01.05 «Селекция и семеноводство сельскохозяйственных растений дис. канд. с.-х. наук / Наталья Геннадьевна Горбачева. - Орел, 2011 - 181 с.
6. Седышева, Г.А. Цитоэмбриологический контроль в селекции яблони на полиплоидном уровне / Г.А. Седышева, Н.Г. Горбачева, С.А. Мельник // Селекция и сорторазведение садовых культур: сб. науч. ст. - Орел: ВНИИСПК, 2014.- т.1- С. 2962.
7. Горбачева, Н.Г. Оценка генеративных структур отдаленных гибридов вишни-доноров устойчивости к грибным болезням / Н.Г. Горбачева, Г. А. Седышева, Е.Н. Джигадло // Селекция и сорторазведение садовых культур: сб. науч. ст. - Орел: ВНИИСПК, 2014.- т.1- С. 171-191.
8. Джигадло, Е. Н. Отдаленная гибридизация и полиплоидия в селекции вишни / Е.Н. Джигадло, Г.А. Седышева, А.Ф. Колесникова // Проблемы и перспективы отдаленной гибридизации плодовых и ягодных культур: тез. докл. - Мичуринск: 2000. - С. 29.
