CC BY
13
reduction. Biotechnology Annual Review, 11: 127-152 (2005). ствии гепарина в условиях in vitro // Вестник Нижегородско-
13. Бочкарев А.В., Зимин Ю.В., Хомутов А.Е. Измене- го университета им. Н.И. Лобачевского, 2006, № 5, с. ние активности лактатдегидрогеназы печени крыс при дей- 86-88
УСИЛЕНИЕ ПРОТИВОСВЕРТЫВАЮЩИХ СВОЙСТВ ПЕПТИДОВ СЕМАКСА, ТАФЦИНА C PRO-GLY-PRO ПУТЕМ ИХ КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЯ С ГЕПАРИНОМ
Ляпина Людмила Анисимовна
Проф., докт. биол. наук, кафедра физиологии человека и животных Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова,
зав.лаб., Москва
Григорьева Марина Евгеньевна
Канд. биол.наук, вед.н.сотр. кафедры физиологии человека и животных Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова, Москва
Оберган Тамара Юрьевна
Канд.биол.наук, ст.н.сотр. кафедры физиологии человека и животных Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова, Москва
Майстренко Евгения Семеновна
Канд.биол.наук, ст.н.сотр. кафедры физиологии человека и животных Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова, Москва
АННОТАЦИЯ
Цель - повысить антикоагулянтную активность пептидов семакса и тафцина с Pro-Gly-Pro. Использованы современные коагулологические методы исследования. Показано повышение антикоагулянтного действия пептидов вследствие создания их соединений с гепарином; продемонстрированы их защитные противосвертывающие эффекты на систему гемостаза в условиях in vitro и при внутривенном введении в организм здоровых животных (крыс). Делается вывод о способности комплексов олигопептидов с гепарином предупреждать процессы тромбообразования в организме при их угрозе.
ABSTRACT
Goal - increase the anticoagulant activity of the peptides Semax and taftsin with Pro-Gly-Pro. Coagulological modern methods used in research. Shown to increase the anticoagulant action of peptides due to their connections with heparin; anticoagulation demonstrated their protective effects on the hemostatic system in vitro and when administered intravenously in healthy animals (rats). The conclusion about the ability of complexes of oligopeptides with heparin to prevent thrombus formation process in the body when they are threatened.
Ключевые слова: регуляторные пролинсодержащие пептиды, система гемостаза, фибринолиз, гепарин.
Keywords: regulatory proline-containing peptides, the system of haemostasis, fibrinolysis, heparin.
Установлено, что последовательность Pro-Arg на С-кон-це природного лиганда крови - тетрапептида тафцина (Thr-Lys-Pro-Arg) обусловливает его антиполимеризационное действие в отношении фибрин-мономера [1] и способствует повышению антикоагулянтной активности плазмы крови [7]. Препарат Селанк (H-Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro-OH) - синтетический аналог природного тафцина с присоединенным трипептидом Pro-Gly-Pro обладает анксиолити-ческим действием и используется в основном при терапии генерализованного тревожного расстройства и неврастении [2]. Показано его ингибирующее действие на процессы гемостаза [11]. Синтетический препарат Семакс (H-Met-Gly-His-Phe-Pro-Gly-Pro-OH), также имеющий в своей структуре Pro-Gly-Pro, применяется в клинике в качестве ноотропного, нейропротективного и противоинсультного средства, поскольку он нормализует кровообращение мозга. В организме Семакс активирует противосвертывающую си-
стему, повышая антикоагулянтную и фибринолитическую активность крови и снижая агрегацию тромбоцитов [9]. Эти эффекты, однако, не проявляются в условиях in vitro, что связано с опосредованным действием препаратов на гемостаз.
Установлено, что каждый из пептидов способен действовать в кровотоке как самостоятельно, так и через взаимодействие с антикоагулянтом крови гепарином [4]. Одним из доказательств взаимодействия олигопептидов с гепарином служат экспериментальные данные, свидетельствующие о снижении уровня гепарина после появления в крови этих пептидов [3].
Спектр физиологического действия гепарина широк: он обладает антикоагулянтным, антилипемическим, ней-ропротективным и другими свойствами [4]. Благодаря своим структурным особенностям он способен образовывать комплексы со многими веществами. Комплексные соедине-
ния гепарина с тромбогенными белками крови участвуют в регуляции жидкого состояния крови. Прочная связь гепарина и белка при этом обусловлена соединением сульфатных и карбоксильных групп полисахарида гепарина с NH-груп-пами аргинина белка . Введение животным комплексных соединений высокомолекулярного гепарина с аминокислотами приводило к повышению антикоагулянтной активности крови [6].
Цель исследования заключалась в создании эффективных комплексов гепарина с глипролинами - Семаксом и тафцином с добавленным трипептидом Pro-Gly-Pro и сравнительном изучении их влияния на первичный и плазменный гемостаз, особенно на антикоагулянтную активность плазмы крови крыс в условиях in vitro и in vivo.
В данной работе использованы коммерческие препараты Семакса, тафцина, пептида Pro-Gly-Pro (Россия), гепарина ("Serva", США). Применяли стандартные коагулологиче-ские и биохимические методы исследования [5].
Получали смесь тафцина с пептидом Pro-Gly-Pro при молярном соотношении 1:1. Эта смесь была сходна по структуре с Селанком. Факт комплексообразования между гепарином и олигопептидами - тафцином+Pro-Gly-Pro (ТафPGP) и Семаксом (MGHFPGP) был доказан методами перекрестного электрофореза.
Проводилось исследование полученных нами комплексных соединений гепарина с TафPGP и MGHFPGP в условиях in vitro при разных молярных соотношениях компонентов, равных 1:6, 1:3, 1:1, 3:1, 6:1 .
Результаты экспериментов in vitro. Влияние комплексных соединений гепарина с олигопептидами на показатели гемостаза.
Установлено, что наибольшей антикоагулянтной активностью обладали комплексы MGHFPGP-гепарин и TафPGP-гепарин при соотношении, равном 1:1. Их антико-агулянтные свойства превосходили те же активности контрольных растворов гепарина. Комплексы, полученные при соотношениях пептид-гепарин, равных 3:1, 6:1 практически не обладали антикоагулянтными свойствами. Все исследованные комплексы пептидов с гепарином обнаруживали фибриндеполимеризационную активность, которая была максимальна для комплексов с соотношением компонентов 1:1.
В этих условиях установлено, что комплексные пептидные соединения с гепарином при концентрациях в плазменной среде от 10-1 до 10-4 мг/мл способны проявлять антикоагулянтную активность, повышая ее на 20-40% по
сравнению с контрольным раствором NaCl. Кроме того, в более широком интервале концентраций от 10-1 до 10-7 мг/ мл все исследованные комплексы гепарина c олигопепти-дами обладали фибриндеполимеризационной активностью, т.е. способностью растворять нестабилизированный фибрин даже в присутствии блокаторов ферментативного фибринолиза (Х-аминокапроновой кислоты, антиплазми-на). Эта активность комплексов превышала таковую эквивалентных концентраций пептидов на 40-48 %. В пределах концентраций комплексов гепарина с глипролинами от 10-1 до 10-9 мг/мл агрегация тромбоцитов снижалась на 25-38 %. Значительное снижение агрегации тромбоцитов до 38% наблюдалось под влиянием комплекса TафPGP с гепарином при его концентрациях в системе от 10-4 до 10-6 мг/мл. Следует отметить, что составные части комплексов не вызывали заметного изменения агрегации тромбоцитов.
Таким образом, в условиях in vitro комплексы гепарина с олигопептидами обладали антикоагулянтной, фибринде-полимеризационной и антитромбоцитарной активностью, превышающей таковые активности эквивалентных концентраций составляющих компонентов. Комплекс TафPGP-ге-парин по сравнению с комплексом Семакс-гепарин обладал наибольшей антитромбоцитарной активностью.
Результаты экспериментов in vivo
В экспериментах на животных использовались комплексные соединения гепарина с препаратами глипролинов - TафPGP и MGHFPGP при наиболее оптимальном молярном соотношении их компонентов, равном 1:1.
При внутривенном введении исследуемых комплексов пептидов с гепарином в дозе 1 мг/кг массы тела крыс наблюдался стабильный противосвертывающий эффект, превосходящий действие одного гепарина в эквивалентной дозе. А именно, антикоагулянтная активность комплексов пептидов с гепарином значительно превышала ту же активность отдельных пептидов и превосходила активность эквивалентной дозы гепарина. Фибринолитические свойства плазмы крови крыс после введения комплексов значительно превышали то же действие отдельных пептидов. Также было установлено, что после введения комплексов гепарина с пептидами усиливается антитромбоцитарная активность в плазме крови подопытных животных (табл.1).
Таким образом, впервые установленный факт значительного снижения агрегации тромбоцитов под воздействием указанных комплексов свидетельствовал о наличии у них антитромботической активности и улучшения реологических свойств крови.
Таблица 1.
Антикоагулянтная активность (по тесту АЧТВ), фибринолитическая активность (суммарная - СФА, неферментативная -НФ) и агрегация тромбоцитов (АТ) в плазме крови крыс после внутривенного введения препаратов комплекса таф-цин+Рш^1у-Рш-гепарин- (ТафPGPГ), Семакс-гепарин (СГ) в дозах 1 мг/кг массы тела и их составных частей в эквивалентных дозах (М±т)
Вводимые препараты СФА, мм2 НФ, мм2 АЧТВ, с АТ,%
Гепарин 64.4 ± 0.4 34.9 ± 2.5 65.9 ± 8.7* 99.4 ± 6.4
Комплекс ТафPGPГ 81.0 ± 6.1** 43.0 ±3.3** 119.8±2.2** 61.7 ±7.7**
Комплекс СГ 84.7 ± 7.4** 49.5 ±5.3** 103.6± 6.4** 74.8 ±4.4**
Тафцин+ PGP 43.1±1.7* 29.9±1.1* 39.9 ± 2.9* 94.0 ±2.9
Семакс 40.9 ± 1.1* 27.2± 3.1* 41.3± 2.1* 90.0 ± 4.4
Контроль 0.85%-ный NaCl 36.7 ± 0.9 24.4 ± 1.3 34.4 ± 1.7 100.0 ± 4.4
Примечание. Статистические показатели рассчитаны относительно соответствующих проб контроля с 0.85%-ным №С1. Обозначения: * р < 0.05,**р<0.01
Проведенное исследование противосвертывающих свойств комплексных соединений гепарина с нейротропны-ми пролинсодержащими пептидами (природным тафцином +PGP) и синтетическим Семаксом показало сходство в их противосвертывающем действии. По-видимому, наличие активных пептидных группировок Pro-Gly-Pro в глипроли-нах или Pro-Arg в тафцине при взаимодействии с гепарином способствует проявлению не только антикоагулянтного эффекта [8,10], но и фибринолитического действия в кровотоке. В то же время антикоагулянтная, фибриндеполимери-зационная, антитромбоцитарная активности комплексов с гепарином превышали те же свойства пептидов, являющихся компонентами комплексов, что обусловлено структурными особенностями новых соединений - комплексов пептидов с гепарином. Как пептиды, так и их комплексы при появлении в крови вызывают выброс из эндотелия сосудов тканевого активатора плазминогена, который и приводит к повышению ферментативных фибринолитических свойств плазмы крови, включенных в суммарный фибринолиз, причем комплексы - в большей степени. Известно, что один гепарин также обладает подобным действием. На основании этих фактов можно утверждать, что пептиды в организме способны проявлять свой высокий противосвертывающий эффект через комплексообразование с гепарином. Показано, что комплексные соединения гепарина с пептидами при введении в организм усиливают не только антикоагулянт-ные, но и фибриндеполимеризационные, и антитромбоци-тарные свойства плазмы крови, хотя один гепарин не обнаруживает подобного действия на полимеризацию фибрина и агрегацию тромбоцитов.
Установлено также, что при внутривенном введении препаратов комплексов наибольшим антикоагулянтным действием обладал комплекс ТафPGP-гепарин, наибольшим фибриндеполимеризационным - комплекс Семакс-гепа-рин.
Исследованные нами препараты комплексов имеют значительное преимущество перед известными лекарственными средствами, так как обладают сочетанным широким спектром не только противосвертывающих свойств - анти-коагулянтным, фибринолитичекским , антитромбоцитар-ным и антитромботическим, но и ноотропными (глипро-лины, Семакс) и, как и тафцин, иммуномодулирующими активностями.
Заключение
На основании проведенного исследования можно говорить о перспективности использования комплексов гепарина с олигопептидом Семаксом, иммуномодулирующим пептидом тафцином с добавленным трипептидом Pro-Gly-Pro в качестве антикоагулянтно-фибринолитических и анти-тромбоцитарных препаратов не только для профилактики, но и для лечения тромбоопасных ситуаций. Эти комплексы препятствуют образованию фибрина благодаря наличию у них фибриндеполимеризационной активности и предупреждают процессы агрегации тромбоцитов вследствие наличия у них антитромбоцитарной активности. Проявление значительных антикоагулянтных эффектов комплексными соединениями гепарина с пептидами обусловлено их инги-бирующим действием на активность тромбина. Значитель-
ным фибринолитическим действием в организме обладал комплекс Семакс-гепарин.
Список литературы
I.Пасторова В.Е., Ляпина Л.А., Черкасова К.А., Ашма-рин И.П Пептиды как ингибиторы свертывающей активности тромбина и агрегации тромбоцитов // Успехи физиологических наук, изд-во Наука (М.), 1999 - Т. 30. - № 2. - С. 80- 91.
2.Зозуля А.А., Кост Н.В., Соколов О.Ю., и др. Ингиби-рующий эффект Селанка на активность энкефалиндегради-рующих ферментов как один из возможных механизмов его анксиолитического дейстьвия // Бюл. эксперим. биологии и медицины, 2001- Т.131. - № 4. - С. 376- 378.
З.Оберган Т.Ю. Глипролины и их комплексные соединения с гепарином как физиологические модуляторы функции противосвертывающей системы организма: . дис... канд. биол. наук. М.: 2004. - 225 с.
4.Кондашевская М.В. Морфофункциональные и психофизиологические эффекты высокомолекулярного гепарина (экспериментальное исследование). Автореферат докт.дисс. М.: 2006. - 47 с.
5.Ляпина Л.А., Григорьева М.Е., Оберган Т.Ю., Шубина Т.А. Теоретические и практические вопросы изучения функционального состояния противосвертывающей системы крови. М.: Адвансед Солюшнз, 2012. - 160 с.
6.Ляпина Л.А., Оберган Т.Ю., Пасторова В.Е. Регуля-торная роль соединений гепарина с низкомолекулярными лигандами крови в плазменном и тромбоцитарном гемостазе Известия Российской академии наук. Серия биологическая, издательство Наука (М.), 2011. - № 2. - С .208- 219.
7.Ahmed A., Wernock M., Nieman M., Srikanth S., Mahdi F., Krishnan R., Tulinsky A., Schmaier A. Mechanisms of Arg-Pro-Gly-Phe inhibition of thrombin // J. Physiol. Heart Circ. Physiol. , 2003. - V 285. - P.183-193.
8.Andreeva L.A., Myasoedov N.F., Lyapina L.A., Grigor'eva M.E., Obergan T.Yu, Shubina T.A. Effect of the PRO-GLY-PRO Peptide on Hemostasis and Lipid Metabolism in Rats with Hypercholesterolemia // Doklady Biological Sciences, издательство Maik Nauka/Interperiodica Publishing (Russian Federation), 2013. - V453. - P. 333-335.
9.Grigorjeva M.E., Lyapina L.A. Anticoagulant and fibrinolytic effects of glyprolines in conditions of immobilization stress// Bulletin of Experimental Biology and Medicine, издательство Kluwer Academic Publishers (Netherlands)., 2011. - V. 149. - № 1. - P. 44-46.
10.Lyapina L.A., Grigorieva M.E., Obergan T.Yu, Shubina T.A., Andreeva L.A., Myasoedov N.F. Peptide regulation of metabolic processes under hypercholesterinemia conditions of an organism //Biology Bulletin, изд-во Maik Nauka -Interperiodica (Russian Federation), 2015. - V.42.- № 6. - P. 546- 555.
II.Myasoedov N.F., Andreeva L.A., Grigorjeva M.E., Obergan T.Y., Shubina T.A., Lyapina L.A. The influence of Selank on the parameters of the hemostasis system, lipid profile and blood sugar level// Doklady Biological Sciences, изд-во Maik Nauka/Interperiodica Publishing (Russian Federation), 2014. - V.458 - № 1. - P. 267-270 .
