CC BY
65
‘О.А. Вострюхина,
'Т.А. Штам, 'Н.В. Мохова, 2А.В. Гуляев, 2О.Ф. Чепик,
'В.А. Ланцов
'Институт ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН, Г атчина;
2НИИ онкологии
им. проф. Н.Н. Петрова,
Санкт-Петербург
$8 Карциномы желудочно-кишечного тракта человека (ЖКТ) могут развиваться по супрессорному, />53-зависимому или мутаторному путям. У последнего ослаблена коррекция неспаренных оснований ДНК. Эти альтернативные пути сопряжены с различиями в клинико-патологических характеристиках и терапии заболевания. Мутаторный путь проявляется в нестабильности микросателлитов (MSI) генома. Все карциномы ЖКТ могут быть с высоким (MSI-H), низким (MSI-L) или нулевым (MSS) уровнем MSI.
34 образца ДНК из карцином ЖКТ анализировали по девяти микросателлитным повторам генома и пяти экзонам гена р53 для поиска корреляции между уровнем MSI и целостностью гена р53. Показано, что с большой вероятностью, карциномы MSI-H мутатор-ного типа, тогда как карциномы MSI-L и MSS развиваются по-супрессорному пути.
Ключевые слова: карциномы желудочно-кишечного тракта человека; система коррекции неспаренных оснований; микросател-литная нестабильность генома; конформационный полиморфизм однонитевых молекул ДНК; электрофорез в денатурирующих условиях.
УРОВЕНЬ НЕСТАБИЛЬНОСТИ МИКРОСАТЕЛЛИТОВ И МУТАЦИИ ГЕНА Р53 В КАРЦИНОМАХ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА ЧЕЛОВЕКА
ВВЕДЕНИЕ
Карциномы желудочно-кишечного тракта человека (ЖКТ) могут развиваться по двум путям — супрессорному, р53-зависимому и мутаторному, />53-независимому [10].
Первый путь характеризуется мутациями в генах Л PC, K-ras, DCC и р53. Инициирование же второго связано с частичной инактивацией системы коррекции неспаренных оснований ДНК (КНО). Дефектность КНО проявляется в микросателлитной нестабильности (microsatellite instability, MSI) генома, по степени выраженности которой все карциномы ЖКТ могут быть разделены на три класса: с высокой или низкой нестабильностью микросателлитов и со стабильными микросателлитами, что обозначается символами MSI-H (MSI high), MSI-L (MSI low) и MSS (MS stable) соответственно [2]. До настоящего времени данные о корреляции между уровнем MSI и генетическими путями развития карцином носят неоднозначный характер, особенно для опухолей, проявляющих низкую степень MSI [8, 11,
19, 20, 24]. Известно, что карциномы MSI-H отличаются от карцином MSS по клиническим проявлениям заболевания, патологоанатомическим характеристикам опухолей и чувствительности к терапевтическим агентам. Колоректальные опухоли с повреждениями системы КНО, как правило, выявляются в более раннем возрасте, склонны к полинеоплазии, являются низкодифференцироваными, чаще локализованы в проксимальном отделе ободочной кишки [18]; есть данные и о более высокой выживаемости пациентов с такими опухолями [6]. В экспериментах на ряде клеточных линий [7, 14, 26] и в клинических исследованиях [6] показано, что карциномы ЖКТ в зависимости от их генетической природы имеют различную устойчивость к тем или иным противоопухолевым агентам. Очевидно, что для эффективной терапии конкретного онкологического заболевания важно определить генетический путь его развития. В связи с этим наибольшие трудности возникают с классификацией карцином MSI-L, определением их клинической, патологической и биологической сущности [23]. В частности, необходимо оптимизировать панель чувствительных и специфичных микросателлитных маркеров для выявления MSI разного уровня.
В данной работе мы проанализировали мутационный профиль 34-х образцов ДНК из карцином ЖКТ, используя для определения уровня MSI высокочувствительные маркеры ВАТ26 и ВАТ40, а также микросателлитные повторы в составе таких генов-мишеней дефектной работы системы КНО, как ВАХ, BLM, hMSH3, hMSH6, IGFIIR,
ТСррЯП и Е2Р4. Параллельно проведен поиск мутаций в гене р53 по пяти экзонам, наиболее часто вовлеченным в мутационный процесс. Предложена процедура первичного анализа ДНК опухоли для определения генетического пути развития карцином.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА Образцы тканей и выделение ДНК
В целях увеличения в исследуемой выборке числа опухолей с повреждениями репарационной системы КНО [18] для анализа отбирали опухоли толстой кишки, локализованные в проксимальном отделе ободочной кишки, а также раки желудка и кишечника у пациентов с отягощенной онкологическими заболеваниями семейной историей, хотя и не в строгом соответствии с Амстердамским критерием II [4].
Парафиновые срезы опухолевой и нормальной тканей больных были приготовлены в патолого-ана-томической лаборатории НИИ онкологии им. проф.
Н.Н. Петрова, при этом опухолевые образцы содержали не менее 50% раковых клеток. Выделение геномной ДНК из парафиновых срезов проводили с использованием протеиназы К по стандартной методике [9].
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Фрагменты ДНК, содержащие исследуемые микросателлиты или экзоны гена р53, выделяли из геномной ДНК в паре рак/норма с помощью ПЦР. Амплификацию проводили в пластиковых пробирках (0,5 мл) на аппарате «Терцик» («ДНК-Технология», Москва) в 20 мкл смеси, содержащей 250 мМ каждого из четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов («Медиген», г. Новосибирск), 10 пМ прямого и обратного праймеров («Синтол», Москва), 60-100 нг ДНК, 1 ед Тац-полимеразы в оригинальном буфере («СибЭнзим», г. Новосибирск). Использовали четырнадцать пар праймеров, описанных ранее [3, 12, 22, 28]. Применяли два режима амплификации: (I) для фрагментов с микросателлитами и (II) для экзонов гена р53. Режим (I) состоял из следующих стадий: 4 мин при 95°С; затем 35 циклов, включающих денатурацию ДНК при 94°С в течение 30 сек, отжиг праймеров при 55-60°С в течение 40 сек и полимеризацию при 72°С в течение 40 сек; по окончании циклов 7 мин проводили достройку синтезированных цепей при 72°С. Режим (II) состоял из 4 мин при 95°С; затем 35 циклов, включающих описанные выше прогревы 1 мин при 94°С, 1 мин при 55°С и 1 мин при 72°С; после чего 7 мин при 72°С.
Мутационные повреждения в исследуемых фрагментах ДНК
Наличие мутационных повреждений в амплифи-цированных фрагментах ДНК и характер таких повреждений определяли, используя разновидности электрофореза фрагментов в полиакриламидном геле. Для первичного поиска изменений в структуре ДНК использовали метод ББСР (конформационного полиморфизма однонитевых молекул ДНК) [22]. Для определения делеций или инсерций в нуклеотидных повторах генов-мишеней использовали ЭФДУ (метод электрофореза в денатурирующих условиях). Поиск нуклеотидных замен при повреждениях в гене р53 проводили путем секвенирования ДНК.
Статистическая обработка результатов
Статистическую обработку результатов проводили с использованием точного метода Фишера [1] и программы СгарЬрас! 1ш1а1 (демонстрационная версия). Различия между группами считали достоверными на уровне 95% вероятности при р < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Определение уровня МБ! карцином ЖКТ
Образцы ДНК из опухолевой ткани сравнивали с соответствующей нормой по изменению длины мо-нонуклеотидных повторов ВАТ26 (А2$) и ВАТ40 (А^д), локализованных, соответственно, в пятом интроне гена ЛМ57/2 и во втором интроне гена З-р-НБИ [21]. При анализе 34 карцином было выявлено 19 (56%) опухолей с вариациями длины ВАТ40, среди которых 11 (32%) показывали нестабильность ВАТ26 (табл.1).
Все образцы были проверены на наличие мутаций в семи генах, контролирующих темп мутагенеза и/ или малигнизацию клеток: ВАХ, В1М, ЬМБНЗ, ИМБН6, ЮРИЯ, ТСРрЯП и Е2Р4. Все они содержат микросателлитные повторы в кодирующей области. Делеция или инсерция одного-двух нуклеотидов в микросателлитах первых шести генов приводит к мутациям сдвига рамки считывания, образованию стоп-кодонов и, как следствие этого, к синтезу аномальных белков [2]. Длинный сегмент белка Е2Р4, содержащий повторы серина, функционирует как трансактивационный домен, и его модификация в результате изменения длины микросателлита (САО)13 может приводить к изменению экспрессии ряда генов, что способствует более активному продвижению клетки по клеточному циклу [27].
Рис. 1а иллюстрирует типичный анализ (электро-фореграммы 8БСР и ЭФДУ) продуктов ПЦР для
Таблица 1
Нестабильность микросателлитов и соматические мутации генов в ДНК опухолей
№ опухоли Микросателлиты Гены-мишени дефектной работы системы КНО Уровень MSI
ВАТ40 ВАТ26 ВАХ TGFfiRII hMSH3 hMSH6 BLM IGFIIR E2F4 n
1-14 - - - - - - - _ - 0 MSS
15-20 + - - - - - - - - 1 MSI-L
21 - - - - - - - - + 1
22 + + + - - + - - 4
23 + + - + - - - - + 4
24 + + + - - - - - + 4
25 + + - - - - - - + 3
26 + - - + - - + - - 3
27 + + - - - - - - - 2 MSI-H
28 + + - - - + - + - 4
29 + - + + + - - - 4
30 + + + + - + - + - 6
31 + + - + - - - - + 4
32 + + - + + - • - - - 4
33 + + _ - + - + - 4
34 + + + + + - - - - 5
Итого 19 11 5 7 2 4 . 2 3 5
Примечание: «+» и «-» — обозначают наличие и/или отсутствие повреждения в микросателите или гене, п измененных микросателлитов из 9 исследованных для каждой опухоли.
общее количество
а)
ВАТ40
■ШШЙЯл
б)
р53 экзон 8
ВАТ26
ВАХ
E2F4
Н
Н
100 100 GGAGCCTC СС С
■ 100 100 GG- GCCTN CC С
Рис. 1. Примеры анализа продуктов ПЦР для ДНК из нормальных (Н) и раковых (Р) клеток:
а — изменения длины микросателлитов ВАТ40, ВАТ26 и микросателлитов в кодирующих участках генов ВАХ и E2F4 для ДНК из образца № 24 в раковых клетках по сравнению с нормальными по данным SSCP (слева) и ЭФДУ (справа); б — мутация в 8-м экзоне гена р53 для ДНК из образца № 15 по данным SSCP (вверху) и секвенирования (внизу); буква N в расшифровке элект-рофореграммы для образца из раковых клеток соответствует гетерозиготной замене [С—>А] — аминокислотная замена His—> Asn в 296 кодоне; боковые стрелки показывают полосы на электрофореграммах фрагментов ДНК, измененных по сравнению с нормой
Таблица 2
Карциномы ЖКТ человека, нестабильность генома и мутации в гене р53
Примечания:* РЖ — рак желудка, РТК — толстой кишки; ** — стадия заболевания для злокачественных опухолей указана в соответствии с классификацией по системе TNM, где Т — размер и распространение первичной опухоли, N — отсутствие или наличие метастазов в регионарных лимфатических узлах и степень их поражения, М — отсутствие или наличие отдаленных метастазов, арабские цифры указывают на распространенность злокачественного процесса — 1-1V стадии заболевания;
*** — количество измененных микросателлитов в данной опухоли из 9-ти исследованных (табл. 1);
«+» и «-» обозначают наличие и/или отсутствие мутаций в гене р53; скобках указан номер поврежденного экзона; н.д. — нет данных.
фрагментов ДНК раковых (Р) клеток, в которых обнаружены повреждения микросателлитов по сравнению с нормальными (Н) (образец 24). Эти изменения обнаружены в четырех из девяти исследуемых фрагментов (ВА Т40. ВАТ26, ВАХ и Е2Р4).
Результаты подобного анализа для 34-х образцов ДНК (в паре норма/рак) представлены в табл. 1. Изменение длины микросателлитного участка (Аю) гена ГС/ДЛЯ обнаружено в семи образцах. Мутации
в микросателлитах (Gg) гена ВАХ и (CAG) 13 гена E2F4 найдены в пяти образцах, (А9) гена BLMи (Ag) гена hMSH3 — в одном, а повреждения (С8) гена HMSH6 и (G8) гена IGFIIR выявлены в четырех и трех образцах соответственно.
На основании*этих данных все карциномы были подразделены на три группы: MSS, не имеющие генетических повреждений в девяти маркерах дефектной работы системы КНО (образцы 1-14); MSI-L, имеющие повреждение в одном маркере (образцы 15-20) и MSI-H, имеющие повреждения в двух и более маркерах (образцы 21-34). Таким образом, MSI выявлена в 59% образцов (20/34), в том числе в.21% случаев (7/34) с низкой и в 38% случаев (13/34) с высокой нестабильностью. Представленные результаты отличаются от данных литературы большей частотой встречаемости карцином MSI-H и MSI-L, что объясняется направленной (в соответствии с клини-ко-патологоанатомическими характеристиками) выборкой опухолей, развивающихся по мутаторно-му пути.
Поиск корреляции между уровнем MSI и мутациями гена р53
Исследуемые образцы ДНК анализировали на наличие повреждений в гене р53 по пяти экзонам (с пятого по девятый), наиболее часто вовлеченным в мутационный процесс. Мутации в данной области охватывают более 95% из всех описанных ранее повреждений данного гена [15]. SSCP-анализ ампли-фицированных фрагментов ДНК выявил 17 (50%) мутированных образцов, из них три образца имели повреждение в экзоне 5, пять — в экзоне 6, шесть — в экзоне 7, четыре — в экзоне 8, и ни один не содержал повреждений в экзоне 9 (табл. 2). Выборочное секве-нирование поврежденных фрагментов (образцы № 10, 12,18) выявило в каждом образце гетерозиготные замены, описанные ранее в базе мутаций гена р53 для злокачественных новообразований ЖКТ человека [15].
На рис. 16 приведены в качестве примера SSCP-анализ и секвенирование ДНК карциномы № 15. По данным SSCP в экзоне 8 гена р53 в этом образце присутствует повреждение, характер которого уточнен последующим секвенированием. Эта гетерозиготная мутация (С—>А) вызывает замену гистидина на аспарагин в 296 кодоне гена р53. Такое повреждение представлено в базе мутаций гена р53 лишь для карциномы молочной железы и аденокарциномы простаты [15]. Приведенные в данной работе данные дополняют эту базу случаем карциномы ЖКТ.
В табл. 2 сопоставлены мутации гена р53 с уровнем MSI карцином. Мутации обнаружены в 10 из
№ Локализация Стадия п *** Уровень Мутации
опухоли опухоли* заболевания** MSI в гене р53
1 РЖ II (T3N0M0) 0 + (5)
2 РЖ II (T3N0M0) 0 -
3 РЖ II (T3N0M0) 0 + (6,7)
4 РЖ II (T3NOMO) 0 + (7)
5 РЖ I (TIN0M0) 0 + (8)
6 РЖ н.д. 0 -
7 РЖ 11 (T3N0M0) 0 + (7)
8 РЖ IV (T4N2M0) 0 MSS -
9 РТК IV (T3N4M1) 0 -
10 РТК II (T3N0M0) 0 + (5)
11 РЖ II (T3N0M0) 0 + (6)
12 РТК II (T3N0M0) 0 + (6)
13 РЖ II (T3N0M0) 0 + (5)
14 РЖ Mia CT3N1M0) 0 + (7)
15 РЖ Ilia (T4N0M0) 1 + (В)
16 РЖ II (T3N0M0) 1 + (8)
17 РЖ I (T2N0M0) 1 + (8)
18 РТК Illb (T3N1M0) 1 MSI-L + (7)
19 РТК I (T2N0M0) 1 -
20 РЖ I (T1N0M0) 1 + (6)
21 РТК I (T2N0M01 1 + П)
22 РЖ II (T3N0MX) 4
23 РЖ II (T3N0M0) 4 -
24 РТК II (T3N0M0) 4 -
25 РТК III (T3N1M0) 3 -
26 РТК IV (T3N1M1) 3 -
27 РТК II (T3N0M0) 2 -
28 РТК III (T4N1M0) 4 MSI-H -
29 РЖ II (T3N0M0) 4 -
30 РТК III (T4N1M0) 6 -
31 РТК II (T3N0M0) 4 -
32 РЖ II (T3N0M0) 4 -
33 РТК IV (T4N1M1) 4 -
34 РЖ II (T3N0M0t 3 + (6)
Таблица 3
Сравнение данных табл. 1 с данными литературы для карцином ЖКТ с разным уровнем MSI (MSS, MSI-L и MSI-H): повреждения микросателлитов в сайтах BA Т, генах-мишенях дефектной работы системы КНО,
а также повреждения гена р53
ВАТ-сайты, Процент карцином с данным уровнем М51, несущих мутацию в указанных микросателлитах*
гены MSS MS1-L MSI-H
и микросателлиты по данным:
в них табл. 1 литературы табл. 1 литературы табл. 1 литературы
ВАТ26 (А26) 0(14) 0 [13] 0(7) 0 [13] 92(13) 97 [13]
ВАТ40 (А40) 0(14) 3 [21] 86(7) - 100(13) 98 [21]
тсррип (А10) 0(14) 0-0,3 [8. 19, 20] 0(7) [П] 0 54(13) [3, 5, 12, 19, 28] 60-90
ВАХ (С8) 0(14) 0-0,3 [8, 20] 0(7) [25] 0 38 (13) ' [5, 8, 20, 25] 13-61
ЫУКНб (С8) 0(14) 0-0,5 [20] 0(7) - 31 (13) [5, 20] 16-38
ЬМ8Н_3 (А8) 0(14) 0 [20] 0(7) — 15(13) 13-39 [3, 5, 12, 16, 20]
гетгк (о8) 0(14) 0 [20] 0(7) 0 [11] 23 (13) 7-29 [3, 5, 20]
Е2Р4 (САв),-, 0(14) 0 [8] 14(7) - 31 (13) 37-61 [5,8,12]
В1М (А9) 0(14) - 0(7) - 15(13) 9-7 [14, 23]
р53 71 (14) 47-60 [6,8, 11, 19, 20, 24] 85 (7) 55-57 [11, 19, 24] 8(13) 0-20 [6,8, 11,19, 20, 24, 28]
%** карцином с данным уровнем МЭ1 41 60-80 [3, 20, 28] 21 5-15 [11, 12, 13,28] 38 15-30 [3, 12, 13,20]
Примечания: * — в скобках указано количество карцином в выборке с данным уровнем М81;
** — от общего числа исследованных карцином; в настоящей работе проанализировано 34 карциномы; «-» — данные в литературе не найдены.
14 (71%) исследованных образцов MSS, в 6 из 7 образцов MSI-L и только в 1 из 13 образцов MSI-H. Таким образом, MSS, так же как и MSI-L, в карциномах ЖКТ определяют развитие опухоли преимущественно по />55-зависимому, т. е. супрес-сорному пути (р = 0,0001), в то время как в карци-номах MSI-Н с высокой достоверностью (р = 0,0001) ген р53 не повреждается.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Представленные данные согласуются q описанной в литературе обратной корреляцией между MSI-H и нарушениями функций гена р53 (табл. 3). Однако в ряде исследований повреждения гена р53 выявляются в опухолях MSI-H с более высокой частотой, чем описано нами [6, 8, 19, 20, 24, 28]. Это может быть или результатом нестрогого разделения генетических путей развития опухолей, или более оптимальным подбором маркеров, использованных нами для выявления карцином MSI-H. В большин-
стве работ в качестве маркеров MSI применяли либо стандартную панель микросателлитов, расположённых в интронных областях генов: так называемая «панель Bethesda» [4], в которую входят два мононуклеотидных (ВАТ26 и ВАТ25) и три динукле-отидных повтора (D5S346, D2S123, D17S250), либо набор микросателлитов, расположенных в некодирующих областях и включающих от 6 до 10 маркеров [8, 11, 20, 28]. В нашей работе был использован ряд микросателлитов, локализованных в кодирующих последовательностях генов, непосредственно ответственных за нестабильность генома, которые могут регулировать клеточную пролиферацию или репарацию повреждений (т.е. темп мутагенеза). Как видно из табл. 3, повреждения этих генов-мишеней дефектной работы системы КНО чрезвычайно редко выявляются в карциномах MSI-L и MSS [8, 19,
20, 25]. Это свидетельствует об их прямом участии в развитии новообразований с высоким уровнем MSI, инициированных повреждением системы КНО. Кроме того, динуклеотидные повторы (а тем
более три-, тетра- и пента-) оказываются менее чувствительными для выявления М81-Н, чем мононук-леотидные повторы [23], а последние и были преимущественно использованы в нашей работе.
С помощью программы ОгарЬрас! 1ш1а1 мы проанализировали статистическую значимость каждого из исследованных маркеров при определении уровня МБГ С этой целью для каждого маркера были подсчитаны следующие параметры: р — вероятность случайного отнесения карциномы к одному из путей развития, чувствительность, специфичность, позитивные и негативные предсказательные значения (табл. 4). Выяснилось, что ВАТ40является оптималь-
анализе уровня МБ1 также очень высокое; различия же между маркерами состоят в их чувствительности и негативном предсказательном значении.
Предлагаемая нами панель для определения уровня МБГ состоит из двух наборов мононуклео-тидных повторов: основного и дополнительного. В качестве основного набора мы предлагаем использовать два чувствительных повтора ВАТ40 и ВАТ26 и специфичный микросателлит А10 в гене TGF11R.II. Дополнительный набор включает микросателлиты в составе следующих генов: ВАХ, ИМБНб и /С/У/Л. Идентификацию генетического пути развития опухоли проводим по следующей схеме: определяем
Таблица 4
Вероятность случайности, чувствительность, специфичность и предсказательные значения различных маркеров в определении уровня нестабильности микросателлитов генома
Уровни MSI-L и MSI-H MSI-H
Маркеры ВАТ40 В АТ26 TGFpRII ВАХ hMsm IGF1IR E2F4 hMSH3 BLM
Вероятность(р) случайности* < 0,0001 < 0,0001 0,0003 0,0046 0,0154 0,0478 0,0586 0,1390 0,1390
Чувствительность* * 95%-й доверительный интервал 0,9500 0,7513-0,9987 0,8462 0,5458- 0,9808 0,5385 0,2512- 0,8078 0,3846 0,1385- 0,6840 0,3077 0,09099- 0,6140 0,2308 0,05037- 0,5379 0,3077 0,09099- 0,6140 0,1538 0,01921- 0,4542 0,1.538 0,01921 0,4542
Специфичность*** 95%-й доверительный интервал 1,000 0,7682-1,000 ’ 1,000 0,8390- 1,000 1,000 0,8390- 1,000 1,000 0,8390- 1,000 1,000 0,8390- 1,000 1,000 0,8390- 1,000 0,9524 0,7617- 0,9988 1,000 0,8390- 1,000 1,000 0,8390- 1,000
Позитивное предсказательное значение**** 1,000 0,8237- 1,000 1,000 0,7152- 1,000 1,000 0,5903- 1,000 1,000 0,4783- 1,000 1,000 0,3976- 1,000 1,000 0,2924- 1,000 0,8000 0,2835- 0,9949 1,000 0,1581- 1,000 1,000 0,1581- 1,000
Негативное предсказательное значение***** 0,9333 0,6806- 0,9983 0,9130 0,7194- 0,9893 0,7778 0,5770- 0,9137 0,7241 0,5275- 0,8725 0,7000 0,5059- 0,8529 0,6774 0,4859- 0,8331 0,6897 0,4918- 0,8473 0,6563 0,4681- 0,8142 0,6563 0,4681- 0,8142
Примечания:
* — определена с использованием точного метода Фишера;
** — доля позитивных по данному маркеру тестов, правильно идентифицировавших карциномы MSI-H (или MSI-H и MSI-L);
*** — доля негативных по данному маркеру тестов, правильно идентифицировавших карциномы MSS (или MSS и MSI-L);
**** — доля позитивных по данному маркеру тестов, правильно идентифицировавших карциномы MSI-H (или MSI-H и MSI-L), от общего числа позитивных тестов;
***** —доля негативных по данному маркеру тестов, правильно идентифицировавших карциномы MSS (или MSS и MSI-L), от общего числа негативных тестов.
ным маркером для отделения карцином MSS от MSI-L и MSI-H (р < 0,0001), а ВАТ26 эффективно выделяет карциномы MSI-H (р < 0,0001). С уровнем статистической достоверности более 95% оказались пригодными для выявления карцином MSI-H и четыре микросателлита в составе генов TGFpRII(р = 0,0003), ВАХ (р = 0,0046), hMSH6 (р = 0,0154) и 1GFIIR (р = 0,0478). Результаты данного исследо-вания не позволяют однозначно определить пригод-ность микросателлитов в генах E2F4 (р = 0,0586), BLM и hMSH3 (р = 0,1390) для анализа уровня MSI.
Отметим, что все маркеры являются высокоспецифичными, за исключением микросателлита в составе E2F4, специфичность остальных составляет
1,000. Позитивное предсказательное значение при
уровень MSI в карциноме с помощью основного набора. Если все три микросателлита этого набора оказываются стабильными, карциному относим к классу MSS. Если два или три из них нестабильны — это карцинома MSI-H. Если нестабилен лишь один из этих маркеров, привлекаем к анализу дополнительный набор. В случае стабильности микросателлитов и в этом наборе карцинома относится к классу MSI-L и с большой вероятностью, подобно карциномам MSS, развивается по супрессорному пути. Если же выявляется изменение длины еще хотя бы одного микросателлита, то значительна вероятность принадлежности карциномы к классу MSI-H и развитию опухоли по мутаторному пути. Подчеркнем, что предлагаемый набор маркеров MSI для опреде-
ления путей развития опухолей ЖКТ отличен от того, который использован в панели Bethesda.Mbi используем гены, вовлеченные в карциногднез му-таторного типа и только мононуклеотидные микро-сателлитные повторы.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта СПбНЦ 2004.
Принятые сокращения:
ЖКТ — желудочно-кишечный тракт;
КНО — коррекция неспаренных оснований ДНК; MSI — микросателлитная нестабильность генома; MSS — микросателлитная стабильность генома; SSCP — конформационный полиморфизм одно-нитевых молекул ДНК;
ЭФДУ — электрофорез в денатурирующих условиях.
Литература
1. Гублер Е.В., Генкин А. А. Применение непараметрических критериев статистики в медико-биологических исследованиях. — Л.: Медицина, 1973.
2. Boland С., Thibodeau S., Hamilton S. et al. A National cancer institute workshop on microsatellite instability for cancer detection and familial predisposition: development of international criteria for the determination of microsatellite instability in colorectal cancer II Cancer Res. — 1998. — Vol. 58. — P. 5248-5257.
3. Calin G., Ranzani G., Amadori D. et al. Somatic frameshift mutations in the Bloom syndrome BLM gene are frequent in sporadic gastric carcinomas with microsatellite mutator phenotype // BMC Genet. — 2001, — Vol. 2.— P. 14.
4. Chung D., Rustgi A. The hereditary nonpolyposis colorectal cancer syndrome: genetics and clinical implications // Ann. Intern. Med. — 2003. — Vol. 138. — P. 560-570.
5. Duval A., Hamelin R. Mutations at coding repeat sequences in mismatch repair-deficient human cancer: toward a new concept of target genes for instability // Cancer Res. — 2002. — Vol. 62. — P. 2447-2454.
6. Elsaleh H., Powell B., McCaul K. et al. P53 alteration and microsatellite instability have predictive value for survival benefit from chemotherapy in stage III colorectal carcinoma // Clin. Cancer Res. — 2001, —Vol. 7.— P. 1343-1349.
7. Fink D., Nebel S., Norris P.S. et al. The affect of different chemotherapeutic agents on the enrichment of DNA mismatch repair-deficient tumour cells II Br. J. Cancer. — 1998. — Vol. 77. — P. 703-708.
8. Fujiwara Т., Stolker J., Watanabe T. et al. Accumulated clonal genetic alterations in familial and sporadic colorectal carcinomas with widespread instability in microsatellite sequences // Am. J. Pathol. — 1998. — Vol. 153. — P. 1063-1078.
9. Goelz S., Hamilton S., Vogelstein B. Purification of DNA from formaldehyde fixed and paraffin embedded human tissue II Biochem. Biophys. Res. Commun. — 1985. — Vol. 130. — P. 118-126.
10. Ilyas М., Tomlinson I.P.M. Genetic pathways in colorectal cancer // Histopathology. — 1996. — Vol. 28. — P. 389-399.
11. Jass J.R., Biden K.G., Cummings M.C. et al. Characterization of a subtype of colorectal cancer combining features of the suppressor and mild mutator pathways II J. Clin. Pathol. — 1999. — Vol. 52. — P. 455-460.
12. Kim J., Baek М., Kim L. et al. Accumulated frameshift mutations at coding nucleotide repeats during the progression of gastric carcinoma with microsatellite instability // Lab. Invest. — 1999. — Vol. 79. — P. 1113-1120.
13. Loukola A., Eklin K, Laiho P. et at. Microsatellite marker analysis in screening for hereditary nonpolyposis colorectal cancer (HNPCC) // Cancer Res. — 2001. — Vol. 61. — P. 4545-4549.
14. Manic S., Gatti L., Carenini N. et al. Mechanisms controlling sensivity to platinum complexes: p53 and DNA mismatch repair II Curr. Cancer Drug Targets. — 2003. — Vol. 3. — P. 21-29.
15. Olivier М., Eeles R., Hollstein M. et al. The IARC TP53 Database: new online mutation analysis and recommendations to users // Hum. Mutat. — 2002. — Vol. 19. — P. 607-614.
16. Peltomaki P. Deficient DNA mismatch repair: a common etiology factor for colon cancer II Hum Mol Genetics. — 2001. — Vol. 10. — P. 735-740.
17. Pestell K., Hobbs S., Titley J. et al. Effect of p53 status on sensivity to platinum complexes ir^a human ovarian cancer cell line // Molecular Pharmacol. — 2000. — Vol. 57. — P. 503-509.
18. Redston M. Carcinogenesis in the GI tract: from morphology to genetics and back again II Mod. Pathol. — 2001. — Vol. 14. — P. 236-245.
19. Salahshor S., Kressner U., Glimelius B. et al. Colorectal cancer with and without microsatellite instability involves different genes / / Genes Chromosomes Cancer. — 1999. — Vol. 26. — P. 247-252.
20. Samowitz W., Holden J., Curtin K.et al. Inverse relationship between microsatellite instability and k-ras and p53 gene alterations in colon cancer II Am. J. Pathol. — 2001. — Vol. 158. — P. 1517^1524.
21. Samowitz IV.S., Slattery M.L., Potter J.D. et al. BAT-26 and BAT-40 Instability in Colorectal Adenomas and Carcinomas and Germline Polymorphism//Am. J. Pathol. — 1999. — Vol. 154, —P. 1637-1641.
22. Steingrimsdottir H., Penhallow J., Farzaneh F. et al. Detection of p53 mutations in oral cancer samples using a sensitive PCR-based method II Biochem. Soc. Trans. — 1997. — Vol. 25. — P. 315-318.
23. Umar A., Boland C.R., Terdiman J.P. et al. Revised Bethesda Guidelines for hereditary nonpolyposis colorectal cancer (Lynch syndrome) and microsatellite instability // J. Natl. Cancer Inst. — 2004. — Vol. 96. — P. 261-268.
24. Ward R., Meagher A., Tomlinson /. et al. Microsatellite instability and the clinicopathological features of sporadic colorectal cancer // Gut. — 2001. — Vol. 48. — P. 821-829.
25. Yamamoto H., Itoh F., Fukushima H. et al. Frequent Bax frameshift mutations in gastric cancer with high but not low microsatellite instability II J. Exp. Clin. Cancer Res. — 1999. — Vol. 18. — P. 103-106.
26. Yan Т., Berry S.E., Desai A.B., Kinsella T.J. DNA mismatch repair (MMR) mediates 6-thioguanine genotoxicity by introducing singlestrand breaks to signal a G2-M arrest in MMR-proficient RKO cells // Clin. Cancer. Res. — 2003. — Vol. 9. — P. 2327-2334.
27. Yoshitaka Т., Matsubara N., Ikeda M. et al. Mutations of E2F4 trinucleotide repeats in colorectal cancer with microsatellite instability // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 1996. — Vol. 227. — P. 553-557.
28. Young J., Simms L., Biden K. et al. Features of colorectal cancers with high-level microsatellite instability occurring in familial and sporadic setting // Am, J. Pathol. — 2001. — Vol. 159. — P. 2107-2116.
Microsatellite instability level and p53 gene mutations in human carcinomas of gastrointestinal tract
Vostrukhina O.A., Shtam T.A., Mokhova N.V. , Gulyaev A.V. , Chepick O.F., Lanzov V.A.
B.P. Konstantinov Nuclear Physics Institute, Russian Academy of Sciences; Prof. N.N. Petrov Research Institute of Oncology, Russia
SUMMARY: The human carcinomas of gastrointestinal tract (GIT) are developed via "suppressor" (p5J-dependent) or "mutator" (with deficiency in DNA mismatch repair) pathways. These pathways are known to be accompanies by variations in both clinicopathological and therapeutic characteristics. The mutator pathway manifests in genome microsatellite instability (MSI). All GIT carcinomas can be subdivided in three classes, with high (MSI-H), low (MSI-L) and zero (MSS) level of MSI. 34 DNA samples from GIT carcinomas were analyzed with 9 microsatellites and 5 exones of p53 gene in searching for correlation between the level of MSI and mutations in pS3. The MSI-H carcinomas appeared to be of mutator type whereas both MSI-L and MSS were of suppressor type.
KEY WORDS: human gastrointestinal tract carcinomas; mismatch repair system; genomic microsatellite instability; single-strand conformation polymorphism; denaturing electrophoresis.
