CC BY
30
http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2226-7425-2018-20-2-98-102
УДК 577.27:612.12:616.5-085:615.36:57.089.24:615.811-092.9
УРОВЕНЬ НЕКОТОРЫХ ЦИТОКИНОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ИНТРАДЕРМАЛЬНОМ ВВЕДЕНИИ ПРЕПАРАТА НЕРЕКОНСТРУИРОВАННОГО БЫЧЬЕГО КОЛЛАГЕНА
Сельская1 Б.Н., Капулер2 О.М., Камилов1 Ф.Х.
ФГБОУ ВО «Башкирский государственный медицинский университет», г. Уфа, Российская Федерация 2ЗАО «Косметологическая лечебница», г. Уфа, Российская Федерация
Аннотация. Изучена динамика изменений содержания в сыворотки крови интерлейкина-1 бета (1Ь-1Р), фактора некроза опухолей-альфа (ТМЕ-а), инсулиноподобного фактора роста-1 (1ОЕ-1) и трансформирующего фактора роста- бета1 (ТОЕ-в1) при внутридермальном введении самкам белых крыс зрелого (12-13 месяцев) возраста препарата бычьего коллагена «Кол-лост® гель» (Россия). Животным опытной группы под эфирным рауш-наркозом интрадермально техникой мезотерапии дважды на 1-е и 6-е сутки эксперимента вводили препарат коллагена на боковые поверхности туловища после удаления шерстяного покрова из расчёта 0,06 мл/100 г массы. На 2-е, 4-е, 7-е, 21-е и 37-е сутки эксперимента в сыворотке крови определяли содержание цитокинов и факторов роста. Результаты исследования показали, что в первые дни (2-е, 4-е и 7-е сутки) после проведения инъекции препарата наблюдается повышение уровней 1Ь-1р, ТМЕ-а и ТОЕ-1, что может отражать воспалительную ответную реакцию тканей кожи на процедуру внутридермального введения нереконструированного коллагена. В более отдалённые сроки (21-е и 37-е сутки) уровень провоспалительных цитокинов (1Ь-1р и ТМЕ-а) снижается, увеличивается содержание 1ОЕ-1, а ТОЕ-^1 остаётся повышенным, свидетельствуя об усилении процессов пролиферации и активации биосинтетических функций клеток дермы в зоне введения препарата бычьего коллагена.
Ключевые слова: нереконструированный бычий коллаген; интрадермальное введение; интерлейкин-1-бета; фактор некроза опухолей- альфа; инсулиноподобный фактор роста-1; трансформирующий фактор роста- бета1.
Биологическое старение - закономерный процесс развития живых организмов во времени, проявляющийся изменениями метаболизма, структуры и функции. Старение населения отмечается во всех экономически развитых странах мира. Согласно заключению экспертов, ВОЗ в 1950 г. в возрасте старше 60 лет было лишь 8% мирового населения, в 2000 г. их доля составила 10%, а к 2050 г. - они составят уже 21% [1], и в этих условиях важным становится не столько продолжительность жизни, сколько её содержание или качество жизни. Особое влияние на качество жизни человека имеет состояние кожных покровов, имеющее и эстетическое, и биологическое значение [2]. Старение кожи подчинено общим закономерностям, начинает проявляться в зрелом возрасте (после 35 лет) и вызывается комбинированным воздействием возраста и факторов внешней среды [3]. Внешние признаки старения кожи связаны со снижением количества и функциональных возможностей клеток кожи, дезорганизацией компонентов внеклеточного матрикса, прежде всего коллагенового каркаса и гликозаминогликанов дермы. Коллагеновые волокна формируют остов, каркас дермы, обеспечивая прочность и эластичность
кожи, осуществляют информационно-регуляторную функцию, участвуя в морфогенезе и дифференцировке фибробластов, взаимодействуют со всеми компонентами внеклеточного матрикса дермы [4].
Для коррекции возрастных изменений кожи имеется значительный арсенал инъекционных методик и широкий спектр препаратов, однако основная их доля приходится на средства, содержащие коллаген и гиа-луронан [5]. Препараты коллагена являются перспективным материалом особенно в репаративных процессах как естественный субстрат для адгезии, дифферен-цировки, роста и миграции клеток соединительной ткани [6]. Однако остаётся много нерешённых вопросов, касающиеся применения коллагенотерапии в комплексной программе коррекции инволюционных изменений кожи, механизмов их фармакологического эффекта.
Цель исследования. Изучить динамику изменений некоторых провоспалительных цитокинов и факторов роста в сыворотке крови при интрадермальном введении самкам белых крыс зрелого возраста нереконстру-ированного бычьего коллагена.
Материал и методы исследования. Эксперименты проведены на 62 самках белых крыс зрелого возраста (12-13 месяцев) массой 280-320 г с соблюдением международных требований этических норм и рекомендаций по гуманному отношению к животным, используемым в экспериментальных и других научных целях, и приказа Минздрава России №708Н от 28.08.2010 г. «Об утверждении правил лабораторной практики».
Животным опытной группы под лёгким эфирным наркозом вводили препарат «Коллост® гель» (ООО «Ниарбмедик плюс», Россия), содержащий 7% коллагена в изотоническом растворе глюкозы, из расчёта 0,06 мл на 100 г массы крысы интрадермально техникой мезотерапии на боковые поверхности туловища (площадь 3x3 см) после предварительного удаления шерсти. Препарат вводили дважды на 1-е и 6-е сутки эксперимента. Контрольной группе крыс вводили стерильный изотонический раствор глюкозы. На 2-е, 4-е, 7-е, 21-е и 37-е сутки после первой инъекции животных выводили из эксперимента под рауш-наркозом. В сыворотке крови определяли содержание 1Ь-1р, Т№-а с использованием наборов реагентов «ИФА - ИЛ- Р1»
и «ИФА-ФНО-альфа» ТОО «Протеиновый контур, IGF-1» (реагенты «IGF ELISA», Mediagnost) и TGF-ß1 (реагенты «TGF-ß1 ELISA», Affimetrixe Biosiense) методом твёрдофазного иммуноферментного анализа на анализаторе Stat Fox 2100 согласно протокола производителя.
Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием пакета программы Statistica 6 for Windows с расчётом медианы, верхнего и нижнего квартилей. Межгрупповые различия показателей оценивали по U-критерию Манна-Уитни.
Результаты и их обсуждение. Содержание в сыворотке крови изучаемых цитокинов представлено в таблице 1. Уровень провоспалительных цитокинов IL-1ß, TNF-a в первую неделю опыта на ближайшие дни после введения препарата коллагена повышался. Так, содержание IL-1ß на 2-е и 7-е сутки эксперимента составляло 136,4-141,8%, а содержание TNF-a в эти же сроки -140,7-186,6% по сравнению с показателями контрольной группы. В более отдалённые сроки наблюдения уровень указанных провоспалительных цитокинов снижался и статистически значимо не отличался от контроля.
Таблица 1
Содержание цитокинов в сыворотке крови самок крыс зрелого возраста при интрадермальном введении
препарата нереконструированного бычьего коллагена
Цитокины пг/мл Группа животных
Контрольная n=10 2-е сутки n=10 4-е сутки n=12 7-е сутки n=10 21-е сутки n=10 37-е сутки n=10
IL-1ß 25,3 [22,6-33,2] 35,4 [25,3-39,7] Р<0,001 34,5 [26,3-38,5] Р<0,001 37,4 [29,3-38,4] Р<0,001 25,9 [20,2-33,2] Р=0,912 26,5 [19,9-33,2] Р=0,802
TNF-a 11,8 [10,2-13,5] 16,6 [11,8-19,6] Р=0,007 19,9 [14,5-24,7] Р=0,001 17,6 [11,9-19,4] Р=0,003 12,9 [9,9-13,4] Р=0,701 12,8 [9,9-19,4] Р=0,911
IGF-1 152 [142-171] 163 [143-175] Р=0,393 168 [142-184] Р=0,314 186 [162-185] Р=0,014 204 [169-198] Р<0,001 214 [172-226] Р<0,001
TGF-ß1 3093 [2563-3296] 3212 [30933648] Р=0,475 3733 [30944005] Р<0,001 4091 [36934993] Р<0,001 3478 [38923906] Р=0,001 3682 [3193-4080] Р<0,001
Иная динамика содержания в сыворотке крови опытной группы животных наблюдалось при изучении факторов роста. Концентрация ЮБ-1 увеличивалась, начиная с 7-х суток опыта, и оставалась на достоверно высоком уровне и в отдалённые сроки (21-е и 37-е сутки) после интрадермального введения препарата коллагена. Содержание TGF-P1 было повышено во все сроки исследования кроме 2-х суток.
Повышение содержания 1Ь-1р, Т№-а в первые дни эксперимента возможно связано с воспалительным ответом ткани кожи на процедуру внутридермального введения коллагенсодержащего препарата техникой мезотерапии. Данные цитокины являются плейотроп-ными медиаторами воспаления, обладающие синер-гичным эффектом [7,8]. Интерлекин-1р относится к важным факторам формирования цитокиновой сети на повреждение тканей. Он вырабатывается фибробла-
—---
Журнал включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК
стами, кератиноцитами, NK-лимфоцитами, дендритными и эндотелиальными клетками, но главными его продуцентами являются макрофаги/моноциты. Мишенями для IL-1ß являются эндотелиальные и эпителиальные клетки, фибробласты, иммунокомпонентные и другие клетки. Он участвует в инициации и регуляции иммунных и воспалительных процессов, активирует продукцию IL-2, IL-3,IL-6, TNF-a, простагландинов, молекул адгезии, белков острой фазы, активных форм кислорода, стимулирует фагоцитоз [6,7]. Фактор некроза опухолей - альфа также интенсивно продуцируется активированными макрофагами/моноцитами, хотя его могут вырабатывать дендритные, гемопоэти-ческие и эндотелиальные клетки, фибробласты, Т-лим-фоциты [8]. Рецепторы TNF-a экспрессируют большинство клеток организма. В результате он участвует в регуляции значительного ряда биологических процессов: пролиферации, дифференцировки и апоптоза клеток, врождённом и приобретённом иммунитете, воспалении и др. Связываясь с рецептором TNF-a индуцирует сигнальные внутриклеточные каскады, вызывающие экспрессию генов-регуляторов воспаления -синтез и секрецию IL-2, IL-6, IL-8, мембранно-ассоци-ированного IL-1, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора, моноцитарного хе-мотаксического белка, молекул межклеточной адгезии (ELAM-1, ICAM-1), простациклина (PGI2) и др.[8,10]. TNF-a относится к основным цитокинам, индуцирующим формирование М1-фенотип макрофагов, продуцирующие воспалительные сигнальные молекулы и активные формы кислорода [11].
Инсулиноподобный фактор роста-1 и трансформирующий фактор роста - ß1 относится к группе системных сигнальных цитокинов, основное действие которых связано со стимуляцией процессов пролиферации и роста клеток. IFG-1 имеет 43% гомологии первичной структуры с инсулином, синтезируется гепатоцитами, клетками соединительной ткани (фибробластами, хон-дробластами и др.), оказывает своё действие, связываясь с рецепторами IGFR-1 и частично с рецептором инсулина и включая тирозинкиназный путь внутриклеточного распространения сигналов[12]. Увеличение IFG-1 в сыворотке крови животных опытной группы в более отдалённые сроки после внутридермального введения коллагенсодержащего препарата, вероятнее всего, косвенно отражает стимуляцию процессов пролиферации и роста клеток кожи в зонах инъекции.
Динамика изменений содержания другого цито-кина в сыворотке крови экспериментальных животных TGF-ß1 не противоречит этому предположению. TGF-ß1 усиливает в соединительной ткани биосинтез компонентов внеклеточного матрикса, стимулирует ангио-генез, заживление ран. Он продуцируется многими
клетками - активированными макрофагами/моноцитами, фибробластами, фиброцитами, Т-лимфоцитами, эпителиальными клетками. Обращает внимание тот факт, что клетки соединительной ткани не только способны секретировать TGF-ß1, но под его влиянием возможна активная дифференцировка циркулирующих фиброцитов в репаративные фибробласты [13], а также трансдифференциация (эпителиально-мезенхималь-ный переход) клеток эктодермального происхождения в репаративные фибробласты [14], интенсивно продуцирующие коллаген и экспрессирующие ростовые сигнальные молекулы [12]. Кроме того, TGF-ß1 оказывает и противовоспалительный эффект, подавляя синтез провоспалительных цитокинов и ответ лимфоцитов на действие IL-2, IL-4, IL-7, снижая цитотоксическую и цитокинпродуцирующую активность макрофагов. Он индуцирует формирование макрофагов М2-фенотипа, экспрессирующие ростовые факторы и ингибиторы воспаления, необходимые для разрешения воспаления, восстановления и заживления [11,15]. Увеличение уровня TGF-ß1 в первые дни эксперимента (4-е и 7-е сутки) после начала внутридермального введения кол-лагенового препарата возможно связано с усилением его продукции как противовоспалительного регуля-торного фактора в ответ на развитие воспалительной реакции ткани кожи на процедуру инъекций.
Заключение. Интрадермальное введение препарата нереконструированного бычьего коллагена методом мезотерапии приводит у животных зрелого возраста в первые дни после процедуры инъекций к усилению секреции IL-1ß, TNF-a и TGF-ß1, что может отражать воспалительную ответную реакцию ткани кожи на саму процедуру инъецирования. В отдалённые сроки через 3-5 недель уровень провоспалительных цитокинов в сыворотке крови снижается, увеличивается продукция IGF-1, TGF-ß1 сохраняется повышенным, характеризуя активацию пролиферативных и биосинтетических процессов в коже в области введения коллагенсодержащего препарата.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
[1] World population aging 1950-2050, Executive Summary. -New York: United Nations Population Division, 2013.
[2] Калинченко С.Ю., Ворслов Л.О., Тюзанов И.А., Титова Ю.А. Окислительный стресс как причина старения. Роль препаратов a - липоевый кислоты (эспали-пон) в лечении и профилактике возрастзависимых заболеваний. //Фарматека. - 2014. - №6. - С. 43-55.
[3] Радионов А.Н. Поражения кожи. Диагностика. Лечение. Профилактика. - СПБ.: Наука и техника, 2012. -912 с.
[4] Кубанова А.А., Смольников В.А., Служаева Н.Г. Старение кожи и возможности коррекции препаратом коллагена. // Вестник дерматологии и венерологии. - 2007. - №5. - С. 70-73.
5 Омельяненко Н.П., Слуцкий Л.И. Соединительная ткань (гистофизиология и биохимия). Том 1. / Под ред. академика РАН С.П. Миронова. - М.: Издательство «Известия», 2009. - 380 с.
[6] Капулер О.М., Курамшина Е.Р. Прикладные аспекты коллагенотерапии в эстетической медицине. // Экспериментальная и клиническая дерматокосметология. -2013. - №5. - С. 40-43.
[7] Симбирцев А.С. Цитокины: классификация и биологическая функция. // Цитокины и воспаления. - 2004. Т. 3, №2. - С. 16-23.
[8] Ярилин Д.А. Роль фактора некроза опухолей в регуляции воспалительного ответа моноцитов и макрофагов. // Иммунология. - 2014. - №4. - С. 195-201.
[9] Сибиряк С.В., Черешнев А.А., Симбирцев А.С. и др. Цитокиновая регуляция биотрансформации ксенобиотиков и эндогенных соединений. - Екатеринбург: УрО РАН, 2006. - 160с.
[10] Blume S. Schlimicker C., Smolen J.S., Redlich K. Targeting TNF receptors in rheumatoid arthritis. //Int. Immunol.-2012.-vol.24.-P.275-281.
[11] Ivashkiv L.V. Epigenetic regulation of macrophage polarization and function. // Trends Immunol. 2013. Vol.34/-P.216-223.
[12] Monzani R., Cohen P. IGF and IGFBPs: role in health and disease. // Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab.-2002.-vol.16, №3.- P.443-447.
[13] Hong K.M., Belperlo J.A., Keano M.P. Differentiation of human circulating fibrocites as mediated by transforming growth factor-P and peroxisome proliferations - activated receptor y. //Y. Biol. chem. - 2007. - vol.282, №31. - P. 22910-22920.
[14] Fan L., Sebe A., Peterfi Z. etal. Cell contract - dependent regulation of epithelial - mesenchimal transition via Rha-Rhakinase - phosphomyosin pathway. // Mol. biol. CM. -2007. - vol. 18, №3. - P. 1083-1097.
[15] Sica A., Mantovani A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas // Y. Clin. Invest. - 2012. - vol.122, №3. - P. 787-795.
THE LEVEL OF SOME CYTOKINES IN THE SERUM OF EXPERIMENTAL ANIMALS WITH INTRADERMAL ADMINISTRATION OF A DRUG OF UNRECONSTRUCTED
BOVINE COLLAGEN
Selskaya1 B.N., Kapuler2 O.M., Kamilov1 F.Kh.
1Bashkir state medical university, Ufa, Russian Federation 2ZAO «Cosmetic clinic», Ufa, Russian Federation
Annotation. The dynamics of changes in the content ofserum interleukin-1 beta (IL-1 ft), tumor necrosis factor -alpha (TNF-a), insulinlike growth factor-1 (IGF-1) and transforming growth factor-betal (TGF-ft1) with intradermal introduction to the female of white rats mature (12-13 months) age of the preparation of bovine collagen "Collost® gel" (Russia). The animals of the experimental group under an etheric anesthetic raush-narcosis intradermally with mesotherapy techniques were injected twice on the 1st and 6th day of the experiment with a collagen preparation on the lateral surfaces of the trunk after removal of the wool cover from the calculation of 0.06 ml /100 g of weight. On the 2nd, 4th, 7th, 21st and 37th day of the experiment, the serum content of the cytokines and growth factors was determined. The results of the study showed that in the first days (2nd, 4th and 7th days), after the injection of the drug, there was an increase in the levels of IL-1 ft, TNF-a and TGF-1, which could reflect the inflammatory response of tissues skin on the procedure of intradermal administration of unreconstructed collagen. In the more distant periods (21st and 37th days) the level of proinflammatory cytokines (IL-1 ft and TNF-a) decreases, the content of IGF-1 increases, and TGF-ft1 remains elevated, on the enhancement ofproliferation and activation of the biosynthetic functions of cells q Yerma in the zone ofadministration of the preparation of bovine collagen.
Key words: unreconstructed bovine collagen; intradermal administration; interleukin-1-beta; tumor necrosis factor-alpha; insulinlike growth factor-1; transforming growth factor-beta1.
REFERENCES
[1] World population aging 1950-2050, Executive Summary. -New York: United Nations Population Division, 2013.
[2] Kalinchenko S.Yu., Vorslov L.O., Tyuzanov I.A., Tishova Yu.A. Okislitel'nyj stress kak prichina stareniya. Rol' pre-paratov a - lipoevyj kisloty (ehspalipon) v lechenii i profil-aktike vozrastzavisimykh zabolevanij.Farmateka, 2014, №6.pp. 43-55 (in Russian)
[3] Radionov A.N. Porazheniya kozhi. Diagnostika. Lechenie. Profilaktika.SPB.Nauka i tekhnika, 2012, 912 p (in Russian)
[4] Kubanova A.A., Smol'nikov V.A., Sluzhaeva N.G. Starenie kozhi i vozmozhnosti korrektsii preparatom kolla-gena.Vestnik dermatologii i venerologii, 2007, №5, pp. 7073 (in Russian)
[5] Omel'yanenko N.P., Slutskij L.I. Soedinitel'naya tkan' (gistofiziologiya i biokhimiya).vol.1.Pod red. akademika RAN S.P. Mironova. - M.: Izdatel'stvo «Izvestiya», 2009, 380 p. (in Russian)
[6] Kapuler O.M., Kuramshina E.R. Prikladnye aspekty kolla-genoterapii v ehsteticheskoj meditsine.EHksperi-mental'naya i klinicheskaya dermatokosmetologiya, 2013, №5, pp. 40-43 (in Russian)
[7] Simbirtsev A.S. TSitokiny: klassifikatsiya i biolog-icheskaya funktsiya.TSitokiny i vospaleniya, 2004, vol. 3, №2, pp. 16-23 (in Russian)
8 Yarilin D.A. Rol' faktora nekroza opukholej v regulyatsii vospalitel'nogo otveta monotsitov i makrofagov. Immu-nologiya, 2014, №4, pp. 195-201 (in Russian)
[9] Sibiryak S.V., Chereshnev A.A., Simbirtsev A.S. i dr. Tsitokinovaya regulyatsiya biotransformatsii ksenobi-otikov i ehndogennykh soedinenij. Ekaterinburg: UrO RAN, pp.2006. - 160 (in Rissian)
[10] Blume S., Schlimicker C., Smolen J.S., Redlich K. Targeting TNF receptors in rheumatoid arthritis. //Int. Immunol.-2012.-vol.24.-P.275-281.
[11] Ivashkiv L.V. Epigenetic regulation of macrophage polarization and function. // Trends Immunol. 2013. Vol.34/-P.216-223.
[12] Monzani R., Cohen P. IGF and IGFBPs: role in health and disease. // Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab.-2002.-vol.16, №3.- P.443-447.
[13] Hong K.M., Belperlo J.A., Keano M.P. Differentiation of human circulating fibrocites as mediated by transforming growth factor-P and peroxisome proliferations - activated receptor y. //Y. Biol. chem. - 2007. - vol.282, №31. - P. 22910-22920.
[14] Fan L., Sebe A., Peterfi Z. etal. Cell contract - dependent regulation of epithelial - mesenchimal transition via Rha-Rha kinase - phosphomyosin pathway. // Mol. biol. CM. -2007. - vol. 18, №3. - P. 1083-1097.
[15] Sica A., Mantovani A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas // Y. Clin. Invest. - 2012. - vol.122, №3. - P. 787-795.
