CC BY
88
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА
УДК 616.33/.34-002.2-018.2:582.273]-074
УРОВЕНЬ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ АЛЬФА И АКТИВНОСТЬ МАТРИКСНОЙ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗЫ-2 ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ КАРРАГЕНАН-ИНДУЦИРОВАННОМ ГАСТРОЭНТЕРОКОЛИТЕ
В эксперименте на крысах изучено содержание уровня ФНО-а, активность матриксной маталлопротеиназы-2 (ММР-2) в сыворотке крови крыс с хроническим каррагенан-индуцированным гастроэнтероколитом. Установлено, что данное заболевание сопровождается повышением уровня ФНО-а и активацией ММР-2. Обнаружена однонаправленность повышения уровня ФНО-а и активности ММР-2 на ранних стадиях хрониза-ции воспаления.
Ключевые слова: гастроэнтероколит, каррагенан, ФНО-а,
ММР-2.
В.И. ЖУКОВ А.С. ТКАЧЕНКО
Харьковский национальный медицинский университет
Введение. В последние годы воспалительные заболевания кишечника привлекают внимание к себе внимание в силу нарастающей распространенности, сохраняющейся высокой частоты хирургических вмешательств, и, следовательно, серьезной медико-социальной значимости. По прогнозам экспертов ВОЗ в XXI веке патология системы пищеварения, наравне с сердечно-сосудистой патологией, в структуре заболеваемости населения будет занимать одно из ведущих мест. Уже сегодня в Украине заболевания желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) по распространенности среди всех заболеваний занимают 3-е место (9,3%), а в структуре заболеваемости - 7-е (4,2%). С каждым годом отмечается четкая тенденция к увеличению этих показателей [1]. При этом в структуре заболеваемости населения за последние годы намечается увеличение случаев возникновения хронических воспалительных заболеваний кишечника [2-4]. Стало ясно, что характерные особенности диеты могут рассматриваться в качестве возможного источника развития воспалительных заболеваний кишечника. В связи с этим в настоящее время интенсивные усилия направлены на изучение вклада различных специфических компонентов питания [5, 6]. Особое внимание уделяется изучению роли различных пищевых добавок в развитие воспалительных заболеваний ЖКТ, которые могут провоцировать развитие патологических состояний. В обширном ряду всевозможных пищевых добавок, наше внимание привлекла пищевая добавка Е407, известная как каррагенан. Влияние каррагенана как на организм человека в целом, так и на состояние ЖКТ в частности изучается уже на протяжении последних 50 лет. Карраге-наны представляют собой сульфатированные полисахариды красных водорослей, в основе химической структуры которых находится дисахаридное повторяющееся звено, состоящее из остатков Б-галактозы, соединенных регулярно чередующимися бета-1,4- и альфа-1,з-гликозидными связями (КЬодорЬуееае) [7]. В патологической физиологии каррагенан используют для моделирования перитонита, плеврита, артрита и каррагенан-индуцированного отека лап у крыс, при этом введение происходит путем инъекции [8, 9] Известна также модель язвенно-некротического каррагенан-индуцированного гастроэнтероколита (ГЭК), который развивается при добавлении 2% раствора лямбда-каррагенана в питьевую воду [10]. В Харьковском национальном медицинском университете на базе модели язвенно-некротического каррагенан-индуцированного гастроэнтероколита разработана модель хронического каррагенанового гастроэнтероколита средней степени тяжести, без язвенно-некротического процесса, путем использования более низких доз каррагенана (Патент на изобретение № 97322 от 25.01.12 «Споаб моделювання хротчного гастроентероколггу»), что позволяет изу-
чать особенности каррагенанового воспаления в кишечнике. Механизмы развития данного заболевания изучены недостаточно.
Некоторые авторы считают, что фактор некроза опухолей альфа (ФНО-а) является центральным фактором, повреждающим эпителий кишечника при воспалительных процессах. В частности, важность ФНО-а очевидна в инициации воспаления при болезни Крона и язвенном колите. [11, 12]. Поэтому интерес представляет изучение содержания ФНО-а при каррагенан-индуцированном ГЭКе и его возможная роль в патогенезе данного заболевания. Также наше внимание было сфокусировано на особенности ответа внеклеточного матрикса на хроническое каррагенановое воспаление и возможную роль матриксной металлопротеиназы-2 (ММР-2) в ремоделировании внеклеточного матрикса, так как влияние каррагенана на активность металлопротеиназ и связь между уровнем ФНО-а и активностью ММР-2 изучены недостаточно.
Целью работы явилось изучение уровня ФНО-а и активности ММР-2 в сыворотке крови крыс с экспериментальным хроническим гастроэнтероколитом.
Материалы и методы. Эксперимент проводили на половозрелых крысах-самках линии Ви-стар, которые содержались в стандартных условиях вивария. Животные были разделены на 3 группы. Первая группа состояла из животных, принимавших пищевую добавку каррагенан в течение 2 недель. Вторая группа включала в себя крыс, которые употребляли каррагенан в течение 4 недель. Контрольная группа состояла из интактных здоровых животных. Моделирование заболевания осуществлялось путем свободного доступа экспериментальных животных к 1% раствору каррагенана в питьевой воде. Установлено с помощью биохимических и морфологических методов исследования (Патент на изобретение № 97322 от 25.01.12 «Споаб моделювання хротчного гастроентероттту»), что развитие ГЭКа начинается через 2 недели с момента начала приема раствора и прогрессирует в дальнейшем. Содержание животных и манипуляции над ними проводили в соответствии с положениями Европейской конвенции «О защите позвоночных животных, которые используются для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1986). Уровень ФНО-а определяли иммунофер-ментным методом с помощью набора реактивов фирмы «Вектор БЕСТ» (Новосибирск, Российская Федерация). Активность ММР-2 определяли иммуноферментным методом с помощью набора реактивов фирмы «Quantikine» (Миннеаполис, США). Статистическую обработку данных проводили с помощью пакетов программы GraphPad Prism 5. Для выявления различий между независимыми группами нормально распределенных величин использовали t-критерий Стьюдента-Фишера; различия между группами считали статистически достоверными при р<0,05.
Результаты и их обсуждение. При развитии хронического каррагенан-индуцированного воспаления кишечника уровень ФНО-а в крови экспериментальных животных повышается в 5,7 раз через две недели после начала приема данной пищевой добавки, а через 4 недели - в 7,1 раза по сравнению с аналогичным показателем у крыс группы контроля (табл. 1). Следовательно, прогрессирова-ние заболевания, сопровождается медленным нарастанием уровня ФНО-а, играющего важную роль в хронизации каррагенанового воспаления. Механизмы ФНО-зависимой инициации и амплификации воспаления в кишечнике являются комплексными и до сих пор изучены недостаточно. В частности, доминирующая роль ФНО-а может быть обусловлена развитием нерегулируемой реакции на люми-нальные антигены и бактерии-комменсалы [13], что приводит к развитию разрушительного воспалительного ответа в слизистой оболочке кишечника. ФНО-индуцированная потеря энтероцитов может приводить к повышенной проницаемости эпителия и ускоренного тока люминальных антигенов. Вдобавок к этим прямым эффектам на целостность эпителиального барьера, ФНО-а действует косвенно, индуцируя процессы, активирующие воспалительн ые процессы в собственной пластинке кишечника. Каррагенин-индуцированное хроническое воспаление кишечника может быть обусловлено повышением проницаемости слизистой оболочки для люминальных антигенов, которые не могут элиминироваться клетками иммунной системы с достаточной эффективностью [13].
Таблица 1
Показатели уровня ФНО-а в сыворотке крови экспериментальных животных
Группы животных ФНО-а (пг/мл)
Контрольная(п=10) 4,135±0,7041
Гастроэнтероколит 2 недели (п=10) 23,55±3,661 р<0,001
Гастроэнтероколит 4 недели (п=10) 29,47±5,235 р<0,001
Эффекты ФНО-а при каррагенановом воспалении могут быть также опосредованы активацией матричных металлопротеиназ. ФНО-а является мощным индуктором матричных металлопротеиназ в
стромальных клетках собственной пластинке кишечника, что было показано на культуре фетальных клеток кишечника ЫопеШ с соавторами [14]. ММР-2, также известная как желатиназа А или коллаге-наза IV типа, является наиболее экспрессируемой матричной металлопротеиназой, встречающаяся практически во всех тканях и клетках, хотя ММР-2 все-таки более известна как фермент принимающий участие в деградации внеклеточного матрикса.
Таблица 2
Показатели функции эндотелия кишечника экспериментальных животных
Группы животных MMP-2 (нг/мл)
Контрольная(n=l0) 7,287±0,2l0l
Гастроэнтероколит 2 недели (n=l0) 22,8l±l,212 р<0,0001
Гастроэнтероколит 4 недели (n=l0) ll,43±o,3252 р<0,0001
При хроническом каррагенан-индуцированном ГЭКе наблюдается повышение активности MPP-2 в сыворотке крови через 2 недели после начала приема пищевой добавки в три раза. Дальнейшее прогрессирование заболевания сопровождается снижением активности MPP-2, однако активность фермента все равно в 1,5 раза повышена по сравнению с контрольной группой (табл. 2).
MMP-2 разрушает коллаген IV типа, являющийся основным компонентом базальных мембран [15]. Обнаруженное нами истончение базальной мембраны и исчезновение ее в некоторых участках при морфологическом исследовании препаратов тонкого кишечника может быть обусловлено активацией MMP-2. MMP-2 экспрессируется в основном в мезенхимальных клетках (преимущественно фибробласты) во время развития тканевой регенерации. ФНО-a стимулирует секрецию MMP-2, что позволяет предположить важную роль данного цитокина в ремоделировании внеклеточного матрикса при хронических воспалительных процессах [16]. ФНО-a активирует экспрессию ядерного фактора транскрипции NF-kB фактор. Активация NF-kB необходима для индукции экспрессии MTl-MMP (матриксная металлопротеиназа мембранного типа) в фибробластах, которая в свою очередь принимает участие в активации про-MMP^ [16]. ФНО-индуцируемая продукции MMP-2 приводит, таким образом, к ускорению деградации и ремоделированию внеклеточного матрикса.
Выводы:
1. Увеличение уровня ФНО-a при развитие хронического каррагенан-индуцированного га-строэнтеролита свидетельствует о его значительной роли в механизмах патогенетического процесса.
2. Mеханизм ФНО-зависимой инициации и амплификации воспаления в кишечнике является комплексным, в частности установленное нами повышение активности MMP-2, имеющим однонаправленный характер с изменениями уровня ФНО-a на ранней стадии хронизации интестинального воспаления, свидетельствует о влиянии ФНО-a на ответ внеклеточного матрикса при хроническом воспалении.
3. Увеличение активности MMP-2 на начальных стадиях каррагенан-индуцированного гастро-энтероколита и снижение в более поздние сроки свидетельствует об участии данного фермента в ремоделировании внеклеточного матрикса.
Литература
1. Ткач, CM. Настоящее и будущее гастроэнтерологии / CM. Ткач // Здоров'я Украши. - 2008. -
C. 33-34.
2. Загорский, С.Э. Хронические воспалительные заболевания у детей и подростков (современный подход) / С.Э. Загорский, ЛЖ Беляева || Mинск: БелMAПO. - 2007. - С. 4-28.
3. Ekbom A. The epidemiology of IBD / A. Ekbom || Inflamm. Bowel. Dis. - 2004. - Vol. lo (Suppl. l). -
P. 32-43.
4. Насыхова, Ю.А. Mолекулярно-генетические аспекты развития воспалительных заболеваний кишечника: болезни Крона и язвенного колита | Ю.А. Насыхова || Автореф. дис. канд. мед. наук Ю.А. Насыхова -Санкт-Петербург - 20l2. — 18 с.
5. Ries L.A.G. SEER Cancer Statistics Review l973-l996. Bethesda / L.A.G. Ries, C.L. Kosary, B.F. Hankey // National Cancer Institute. - l999. - 60 p.
6. Schottenfeld D. Cancers of the large intestine / D. Schottenfeld, S.J. Winawer // Cancer Epidemiology and Prevention 2nd ed. New York:Oxford University Press. - l996. - P. 8l3 840.
7. Соколова, E. В. Изучение in vitro и ex vivo антиоксидантной активности каррагинанов - сульфати-рованных полисахаридов красных водорослей / Е.В. Соколова, А.О. Барабанова, В.А.Хоменко // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 20l0. - Т. 150. - № 10. - С. 398-40!.
8. Nicklin S. Effect of orally administered foodgrade carrageenans on antibody-mediated and cellmediated immunity in the inbred rat / Nicklin S., Miller K. // Food. Chem. Toxicol. - l984. - Vol. 22. - P. 6l5-62l.
9. Di Rosa M. Review: Biological properties of carrageenan / Di Rosa M. // J. Pharm. Pharmacol. - 1972. -Vol. 24. - P. 89-102.
10. Pricolo V.E. Effects of lambda-carrageenan induced experimental enterocolitis on splenocyte function and nitric oxide production / V.E. Pricolo, S.M. Madhere, S.D. Finkelstein // J. Surg. Res. - 1996. - Vol. 66, № 1. -P. 6-11.
11. Neurath M.F. Predominant pathogenic role of tumor necrosis factor in experimental colitis in mice / Neurath M.F., Fuss I., Pasparakis M., Alexopoulou L. [et al.] // Eur. J. Immunol. - 1997. - Vol. 27. - P. 1743-1750.
12. Ricart E. Infliximab for Crohn's disease in clinical practice at the Mayo Clinic: the first 100 patients / Ri-cart E., Panaccione R., Loftus E.V. [et al.] // Am. J. Gastroenterol. - 2001. - Vol. 96. - P. 722-728.
13. Corazza N.S. Nonlymphocyte-derived tumor necrosis factor is required for induction of colitis in recombination activating gene (RAG)2-/-mice upon transfer of CD4+CD45RBhi T cells / Corazza N.S., Eichenberger, H.P. Eugster, C. Mueller // J. Exp. Med. - 1999. - Vol. 190. - P. 1479-1492.
14. Lionetti P. T-cell activation can induce either mucosal destruction or adaptation in cultured human fetal small intestine / Lionetti P, Breese E, Braegger C.P. [et al.] // Gastroenterology. - 1993. - Vol. 105. - P. 373-381.
15. C. B. Basbaum. Focalized proteolysis: spatial and temporal regulation of extracellular matrix degradation at the cell surface / C. B. Basbaum, Z. Werb // Cell Biol. - 1996. - Vol. 8. - P. 731.
16. Han Y.P. TNF-alpha stimulates activation of pro-MMP2 in human skin through NF-(kappa)B mediated induction of MT1-MMP / Han Y.P., Tuan T.L., Wu H. [et al.] // J. Cell Sci. - 2001. - Vol. 114. - P. 131-139.
LEVEL OF TNF- n AND ACTIVITY OF MMP-2 IN CHRONIC CARRAGEENAN-INDUCED GASTROENTEROCOLITIS
Kharkiv National Medical University
V. ZHUKOV A. TKACHENKO
The level of TNF-a and activity of MMP-2 were investigated in blood serum of rats with chronic carrageenan-induced gastroentero-colitis. It was found that this disease was accompanied by increased level of TNF-a and activation of MMP-2. Unidirectional increase of TNF-a concentration and MMP-2activity was observed in the earlier stages of chronic inflammation.
Keywords: gastroenterocolitis, carrageenan, TNF-a, MMP-2.
