Уровень эндотоксемии и цитокиновый статус у пациентов с сахарным диабетом 2 типа и неалкогольной жировой болезнью печени Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Оригинальные исследования

УДК 616.379-008.64+616.36:612.352.2

УРОВЕНЬ ЭНДОТОКСЕМИИ И ЦИТОКИНОВЫЙ СТАТУС У ПАЦИЕНТОВ С САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 2 ТИПА И НЕАЛКОГОЛЬНОЙ ЖИРОВОЙ БОЛЕЗНЬЮ

ПЕЧЕНИ

1 Литвиненко Е.А, 1 Боднар П.Н, 2 Лисяний НИ, 2Бельська Л. Н . ''Национальный медицинский университет им. А.А. Богомольца, Киев, Украина 2'ГУ «Институт нейрохирургии им. академика А.П. Ромоданова НАМН Украины»

В статье изложены результаты изучения уровней провоспалительных цитокинов и эндотоксемии у пациентов СД2 и НАЖБП. У пациентов СД2 и НАЖБП или при их сочетании отмечается увеличение сывороточной концентрации ФНО-а, ИНФ-у, ИЛ-6 и ИЛ- 8. Наибольшее увеличение содержания провоспалительных цитокинов и С-реактивного белка у пациентов СД2 и НАЖБП по сравнению с пациентами с СД2 или НАЖБП свидетельствует о более выраженной воспалительной и иммунопатологической реакции. Установлено повышение уровня антител IgG к ЛПС и МСМу пациентов СД2 с НАЖБП и выявлена корреляция с уровнями провоспалительных цитокинов, что свидетельствует о патогенетической роли эндотоксинов грамотрицательной микрофлоры кишечника в индукции системного воспаления у этих пациентов.

Ключевые слова: цитокины, эндотоксемия, сахарный диабет, неалкогольная жировая болезнь печени.

Неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП), являющаяся компонентом сахарного диабета (СД), метаболического синдрома, ожирения, в настоящее время широко распространена в развитых странах. Данные заболевания имеют общие патогенетические факторы, предопределяющие их потенцирование, развитие и прогрессирование. Сочетание НАЖБП с СД2 вдвое увеличивает риск гепатоцеллюлярной карциномы и цирроза печени [1].

Центральную роль в механизме развития НАЖБП играет инсулинорезистентность, активация глюко-неогенеза и жировая инфильтрация гепатоцитов. Определенная роль в развитии стеатогепатита принадлежит индукции оксидативного стресса [2]. В результате перекисного окисления липидов ПОЛ вырабатывается значительное количество свободных радикалов, которые стимулируют повышенный синтез провоспалительных цитокинов (фактор некроза опухоли а (ФНО-а), интерлейкины (ИЛ) ф, 6, 8, матриксные металлопротеиназы). Гиперпродукция цитокинов приводит к развитию воспалительного процесса и некротическим изменениям в печеночных клетках [3]. Важную роль в развитии воспалительного компонента при НАЖБП отводят бактериальной эндотоксемии, связанной с дисбиозом кишечника. Проникновение в кровь и в печень кишечных эндотоксинов способствует усилению синтеза провоспалительных цитокинов. Эндотоксины и цитокины вовлекаются в патогенез стеатогепатита и приводят к дальнейшему циррозу [4, 5].

В то же время многие вопросы развития воспалительной реакции и роли эндотоксемии при НАЖБП и СД2 остаются до конца не изученными.

Цель работы - изучить уровни провоспалительных цитокинов и эндотоксемии у пациентов с СД2 и НАЖБП.

Материалы и методы. Под наблюдением находились 118 пациентов, среди которых: 64 пациента с СД-2 типа и НАЖБП (I группа), 26 пациентов - с СД-2 (II группа) и 28 пациентов с НАЖБП (III группа). Контрольную группу составили 25 здоровых лиц.

Оценку эндогенной интоксикации в сыворотке крови проводили по спектру молекул средней массы (МСМ) с помощью метода [6]. Принцип метода основан: на освобождении сыворотки крови от высокомолекулярных пептидов и белков с использованием трихлоруксусной кислоты; на количественном определении полученной после центрифугирования

надосадочной жидкости; определении уровня МСМ по поглощению в монохроматическом световом потоке при длине волн 254 и 280 нм. Выделяли две фракции МСМ при 254 нм - токсическая фракция (гидрофобные токсины и продукты неполного распада белков) и 280 нм - ароматическая фракция (ароматические аминокислоты). Результаты представлены в условных единицах экстинкции, соответственно, E254 и E 280; кроме того, вычислили коэффициент распределения КР=Е 280/Е 254.

Концентрацию цитокинов (интерлейкин 6,8, ИНФ-у, ФНО-а) и СРБ (С- реактивный белок) определяли в сыворотке периферической крови методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием наборов «Вектор-Бест» (Россия), основанного на твердофазном «сэндвич»-варианте согласно инструкции фирмы производителя. На первой стадии анализа исследуемые и контрольные образцы инкубировали с иммобилизированными в лунках специфическими против определенного цитокина антителами. Имеющийся в образцах цитокин связывается с иммобилизированными антителами, затем связавшийся цитокин взаимодействует с вторичными антителами. Завершение реакции осуществляли путем внесения субстратной смеси. Интенсивность желтого окрашивания, которая пропорциональна концентрации содержащегося в образце определенного цитокина, учитывали на спектрофотометре «Immunochem» при длине волны 540 нм.

Определение циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотке периферической крови проводили по методу [7], который основывается на селективной преципитации комплексов антиген-антитело в 3,75% полиэтиленгликоле с последующим фотометрическим определением плотности преципитации.

Определение уровня антител к липополисахаридам (ЛПС). В основу метода положен метод ИФА. К иммобилизованным ЛПС добавляли сыворотки и после инкубации и удаления несвязавшихся компонентов выявляли иммунные комплексы с помощью меченых пероксидазой хрена антител против Ig G человека ЗАО «Вектор-Бест», Россия. Индикаторная система в ИФА АТ к ЛПС грамотрицательных энтеробактерий состояла из Н2О2 и ортофенилдиамина. Результаты регистрировали на спектрофотометре Immunochem при длине волны 540 нм.

Статистическую обработку полученных результатов проводили на персональном компьютере с

86 Журнал Гродненского государственного медицинского университета № 4, 2014 г.

Оригинальные исследов

использованием пакета программ «Statistica 6,0». Для оценки корреляционных взаимосвязей между показателями использовали коэффициент корреляции Спирмена. При величине коэффициента корреляции менее 0,3 связь оценивалась как слабая, от 0,31-0,5 - умеренная, выше 0,5 - значительная.

Результаты и обсуждение. Содержание цитокинов ФНО-а и ИНФ- у, ИЛ 6, ИЛ-8 было повышено у пациентов с СД2, НАЖБП, а также при их сочетании (табл. 1). У пациентов с СД2 выявлено двукратное повышение ФНО-а и ИНФ-у. Концентрации цитокинов в группе пациентов с НАЖБП составили (2,19±0,49) пг/мл для ФНО-а и (4,45±0,42) пг/мл для ИНФ-у, что статистически достоверно (р<0,001) превышало контрольные показатели. Таблица 1 - Содержание цитокинов (пг/мл) и СРБ (мг/мл) в сыворотке крови у обследованных пациентов

Показатели Группы, количество обследованных

НАЖБП+СД2 (n=64) НАЖБП (n=28) СД2 ( n=26) контроль ( n=25)

ФНО-а 4,21±0,60*#& 2,19±0,49”» 1,37±0,45*# 0,56±0,047

ИЛ-6 5,02± 0,48*# 3,96±0,26* 2,76±0,44# 1,98±0,15

ИЛ-8 4,55±0,49*# 3,66±0,31* 2,55±0,39# 1,90±0,13

ИНФ-у 4,82±0,37*# 4,45±0,42* 1,97±0,25# 0,84±0,06

СРБ 17,38±1,68*#& 12,11±1,09*#& 7,66±2,72*# 3,43±0,17

Примечание: * — р <0,001 — достоверность различий с аналогичными показателями контроля; # — р<0,05 — достоверность различий группы СД2 и НАЖБП с аналогичными показателями группы СД2; & — р<0,05 — достоверность различий группы СД2 и НАЖБП с аналогичными показателями группы НАЖБП

У пациентов с СД2 и НАЖБП выявлено наибольшее повышение содержания ФНО-а и ИНФ-у в сыворотке крови. Среди пациентов данной группы в 65,6% случаев мы выявили значительное повышение уровней ФНО-а и ИНФ-у (в 5-8 раз по сравнению со значениями контрольной группы), а в 12,5% случаев наблюдалось умеренное повышение (значения превышали контрольный уровень не более чем в 2 раза) данных цитокинов. У пациентов с НАЖБП значительное повышение содержания ФНО-а в сыворотке крови (в 4-5 раз) отмечено только в 35,7% случаев, ИНФ-у - у 28,6% исследуемых.

Средний уровень других цитокинов, в частности ИЛ-6 и ИЛ-8, был повышен в 1,5 раза у пациентов с СД2 и в среднем в 2 раза у пациентов с НАЖБП по сравнению с контрольной группой. При сочетании данных патологий (СД2+НАЖБП) уровень данных цитокинов превышал контрольные показатели в 3 раза, что, по-видимому, свидетельствует о более интенсивной воспалительной реакции в организме у пациентов этой группы.

О более выраженном системном воспалительном процессе при сочетании СД2+НАЖБП свидетельствует статистически достоверное (р<0,05) повышение уровня сывороточного СРБ не только по сравнению с контролем, но и по сравнению с соответствующими показателями у пациентов только с СД2 или только с НАЖБП (см. табл. 1).

Значительное повышение уровней ФНО-а, ИНФ-у, ИЛ-6, ИЛ-8 у пациентов с СД 2+НАЖБП отражает прогрессирующий характер воспаления и свидетельствует о роли цитокинов в патогенезе данной патологии. Активация макрофагов под влиянием ФНО-а сопровождается выработкой избыточных количеств реактивных форм кислорода и оксида азота, обладающих прямым цитотоксическим эффектом на гепатоциты. ФНО-а также активирует внутриклеточ-

ные сигнальные молекулы, в том числе стресс-киназы и ингибитор каппа-киназы-бета, что делает клетки устойчивыми к действию инсулина и нарушает его связи с рецептором. Воздействие ФНО-а на инсулиновый рецептор типа 1 проявляется в его фосфорилировании, уменьшении сродства к инсулину, снижении количества транспортерного белка ГЛЮТ4, уменьшении захвата и утилизации глюкозы клетками, нарастании гипергликемии, повреждении сосудов и развитии СД2 [8]. С другой стороны, ФНО-а стимулирует синтез жирных кислот в печени, повышает уровень сывороточных триглицеридов [9], стимулирует продукцию липопротеидов очень низкой плотности. ФНО-а при участии ИНФ-у оказывает прямое цитотоксическое действие на гепато-циты и участвует в патогенезе фиброза печени [10].

Индукторами повышенной секреции провоспалительных цитокинов - ФНО-а, ИНФ-у, ИЛ-6, ИЛ-8 -могут служить эндотоксин (ЭТ) грамотрицательной микрофлоры кишечника [11], реактивные формы кислорода и продукты перекисного окисления липидов [3]. В связи с этим в ходе исследования было проведено изучение в сыворотке пациентов уровня антител IgG к ЛПС и содержания МСМ как показателя эндогенной интоксикации. Мы обнаружили двукратное повышение уровня антител Ig класса G к ЛПС у пациентов с СД2 и 3-4-кратное его повышение у 35,7% пациентов с НАЖБП. При сочетании СД2+НАЖБП уровень антител IgG к ЛПС статистически достоверно (р<0,05) превышал контрольные значения. У 67,2% исследуемых пациентов нами выявлено значительное (в 6-7 раз) повышение данного показателя (таблица 2).

Таблица 2 - Содержание молекул средней массы и антител к ЛПС в сыворотке крови у обследованных пациентов

Показатели Группы, количество обследованных

НАЖБП+СД2 (n=64) НАЖБП (n=28) СД2 (n=26) Контроль (n=25)

МСМ 254, (усл. ед.) 0,272±0,02б* 0,220±0,017 0,224±0,016* 0,134±0,011

МСМ 280, (усл. ед.) 0,466±0,029*#& 0,311±0,015* 0,366±0,019*# 0,219±0,017

280/254 1,72±0,12 1,42±0,11 1,63±0,09 1,63±0,079

IgG к ЛПС (усл. ед. опт. плотн.) 0,668±0,179*# (0,39-1,080) 0,437±0,101* (0,190-0,720) 0,240±0,056# (0,170-0,427 0,156±0,007

Примечание: * — р<0,05 — достоверность различий с аналогичными показателями контроля; # — р<0,05 — достоверность различий группы НАЖБП+СД2 с аналогичными показателями группы только СД2; & — р<0,05 — достоверность различий группы СД2 и НАЖБП с аналогичными показателями группы НАЖБП

Анализ уровней изучаемых цитокинов позволил выявить прямую корреляцию между уровнем ФНО-а, ИЛ-6 и уровнем антител IgG к ЛПС у пациентов с НАБЖП (ФНО-а и уровень антител IgG к ЛПС, R=0,68; ИЛ-6 и уровень антител IgG к ЛПС, R=0,63), и у пациентов с сочетанной патологией СД2+НАЖБП (ФНО-а и уровень антител IgG к ЛПС, R=0,64; ИЛ-6 и уровень антител IgG к ЛПС, R=0,52) что, по-видимому, свидетельствует о роли эндотоксинов грамотрицательной микрофлоры в индукции системного воспаления при данных патологиях.

Исследование уровней МСМ в сыворотке у пациентов всех групп выявило повышение содержания молекул средней массы как токсической, так и ароматической фракции по сравнению с показателями контроля.

Содержание токсической фракции МСМ254 в сыворотке у пациентов СД2 и НАЖБП составило 0,272±0,026 усл. ед. при контроле 0,134±0,011

Журнал Гродненского государственного медицинского университета № 4, 2014 г. 87

гинальные исследования

усл. ед., при этом показатели МСМ254 у пациентов только с СД2 или только с НАЖБП были несколько ниже - 0,224±0,016 усл. ед. и 0,220±0,017 усл. ед., соответственно. Содержание ароматической фракции МСМ280 в 1,5 раза превышали показатели контроля у пациентов с СД2 или НАЖБП и более чем в 2 раза при сочетании данных патологий. Значительное повышение концентрации молекул средней массы отражало повышенный уровень эндотоксемии как при СД2, так и при НАЖБП.

Таким образом, мы установили, что сочетание СД2+НАЖБП сопровождается повышением уровня провоспалительных цитокинов (ФНО-а, ИНФ-у, ИЛ-6 и 8) и увеличением уровня СРБ в сыворотке крови по сравнению с пациентами только с СД2 или НАЖБП, что свидетельствует о более выраженном воспалительном процессе в печени. Повышение уровней антител IgG к ЛПС и МСМ у пациентов с СД2 и НАЖБП и их корреляция с уровнями провоспалительных цитокинов свидетельствует о патогенетической роли эндотоксинов грамотрицательной микрофлоры ки-

Литература

1. Боднар П.М., Михальчишин Г.П., Кобиляк Н.М. Неалкогольна жирова хвороба печшки у хворих на цукро-вий д1абет типу 2: патогенез, д1агностика та лжування. // Ендокринолопя. - 2012. - Т.17, №1. - с.94-101.

2. Хворостшка В.М., Лавриненко О.В., Журавльов Патогенетичш аспекти жирово! дистрофи печшки при цу-кровому д1абет! 2 типу // Сучасна гастроентеролопя - 2009.

- №3. - с. 91-97.

3. Маммаев С.Н., Багомедова Н.В., Богомолов П.О. Цитокиновая система при неалкогольном стеатогепатите // РЖГГН. - 2007. - №4.- с.35-39.

4. Кляритська 1.Л., Стшщ О.1. Система ниток1н1в при неалкогольному стеатогепатил // Арх1в клшчно! та експе-риментально! медицини. - 2010 -Т.19.- №2. - с.167-192

5. MieeabilityleL., ValenzaV., LaTorreG. Increasedintestin alpermeabilityandtightjunctionalterationsinnonalcoholicfattyliv erdisease. //Hepatology .- 2009. - V.49. - р.1877-1887.

6. Громошевская Л.Л. Средние молекулы как один из показателей «метаболической интоксикации» в организме // Лаб. диагностика. - 1997. -№1.- с.11-16.

7. Гашкова В., Мате Н. // Чехословацкая медицина. -1978. - №2. - с.117.

8. Буеверов А.О., Маевская М.В. Некоторые патогенетические и клинические вопросы неалкогольного стеатоге-патита // Клин. персп. гастроэнтеролог. и гепатол .- 2008.

- №3. - с.2-9.

9. Орловський В.Ф., Муренець Н.О. Хрошчне запален-ня при неалкогольнш жировш хвороб1 печшки // Патолог1я.

- 2010 - Т.7. - №3. - с.99-102

10. Корншчук 1.Ю. Особливост цитокшово! регуляци та кооперацп при неалкогольнш жировш хвороб1 печшки на фош ожиршня. // Буковинський медичний вгсник. - 2011.

- Т.15. - №2. - с. 214-216.

11. Белоглазов В.А., Гордиенко А.И. , Ильченко Ф.Н. Роль эндотоксина грамотрицательной микрофлоры кишечника в патогенезе системного хронического воспаления у больных при ожирении, метаболическом синдроме и сахарном диабете 2 типа // Клиническая хирургия. - 2012 - №8. -С.4-5.

шечника в индукции системного воспаления, что необходимо учитывать при разработке патогенетически обоснованных подходов к лечению данной патологии.

Выводы

1. У пациентов с СД2 и НАЖБП или при их сочетании отмечается увеличение сывороточной концентрации ФНО-а, ИНФ-у, ИЛ-6 и ИЛ-8.

2. Наибольшее увеличение содержания провоспалительных цитокинов и С-реактивного белка у пациентов с СД2 и НАЖБП по сравнению с пациентами с СД2 или НАЖБП свидетельствует о более выраженной воспалительной и иммунопатологической реакции.

3. Установлено повышение уровня антител IgG к ЛПС и МСМ у пациентов с СД2 с НАЖБП и выявлена корреляция с уровнями провоспалительных цитокинов, что свидетельствует о патогенетической роли эндотоксинов грамотрицательной микрофлоры кишечника в индукции системного воспаления у данных пациентов.

Literatura

1. Bodnar P.M., Mixal’chishin G.P., Kobilyak N.M. Nealkogol’na zhirova xvoroba pechinki u xvorix na cukrovij diabet tipu 2: patogenez, diagnostika ta likuvannya. // Endokrinologiya. - 2012. - T.17, №1. - s.94-101.

2. Xvorostinka V.M., Lavrinenko O.V., Zhuravl’ov Patogenetichni aspekti zhirovo1 distrofi1 pechinki pri cukrovomu diabeti 2 tipu // Suchasna gastroenterologiya - 2009. - №3. - s. 91-97.

3. Mammaev S.N., Bagomedova N.V., Bogomolov P.O. Citokinovaya sistema pri nealkogol’nom steatogepatite // RZhGGN. - 2007. - №4.- s. 35-39.

4. Klyarits’ka I.L., Stilidi O.I. Sistema citokiniv pri nealkogol’nomu steatogepatiti // Arxiv klinichno! ta eksperimental’no! medicini. - 2010 -T.19.- №2. - s. 167-192

5. MieeabilityleL., ValenzaV., LaTorreG. Increasedintestin alpermeabilityandtightjunctionalterationsinnonalcoholicfattyliv erdisease. //Hepatology .- 2009. - V. 49. - p. 1877-1887.

6. Gromoshevskaya L.L. Srednie molekuly’ kak odin iz pokazatelej «metabolicheskoj intoksikacii» v organizme // Lab. diagnostika. - 1997. -№ 1.-s. 11-16.

7. Gashkova V., Mate N. // Chexoslovackaya medicina. -1978. - № 2. - s. 117.

8. Bueverov A.O., Maevskaya M.V. Nekotory’e patogeneticheskie i klinicheskie voprosy’ nealkogol’nogo steatogepatita // Klin. persp. gastroe’nterolog. i gepatol .- 2008.

- № 3. - s. 2-9.

9. Orlovs’kij V.F., Murenec’ N.O. Xronichne zapalennya pri nealkogol’nij zhirovij xvorobi pechinki // Patologiya. - 2010

- T. 7. - № 3. - s. 99-102.

10. Kornijchuk I.Yu. Osoblivosti citokinovo! regulyaci! ta kooperaci! pri nealkogol’nij zhirovij xvorobi pechinki na foni ozhirinnya. // Bukovins’kij medichnij visnik. - 2011. - T.15. - № 2. - s. 214-216.

11. Beloglazov V.A., Gordienko A.I. , Il’chenko F.N. Rol’ e’ndotoksina gramotricatel’noj mikroflory’ kishechnika v patogeneze sistemnogo xronicheskogo vospaleniya u bol’ny’x pri ozhirenii, metabolicheskom sindrome i saxarnom diabete 2 tipa // Klinicheskaya xirurgiya. - 2012 - № 8. - S.4-5.

88 Журнал Гродненского государственного медицинского университета № 4, 2014 г.

Оригинальные исследомни

LEVEL OF ENDOTOXEMIA AND STATUS OF CYTOKINES IN PATIENTS WITH TYPE 2 DIABETES

AND NON-ALCOHOLIC FATTY LIVER DISEASE

1 Lytvynenko E.A, 1 Bodnar P. N. , 2'Lysianuy N.l, 2-L.N Belska ''Educational Establishment "Bohomolets National Medical University", Kiev, Ukraine 2'State Institution "Institute of neurosurgery named after A.P. Romodanov of the Academy of Medical

Sciences of Ukraine"

The article presents the results of a study ofproinflammatory cytokines and endotoxemia in patients with type 2 diabetes and NAFLD. Patients with type 2 diabetes and NAFLD or their combination have increased serum concentration of TNF -a, IFN -y, IL -6 and IL -8. The greatest increase of proinflammatory cytokines and C-reactive protein in patients with type 2 diabetes and NAFLD compared with patients with type 2 diabetes or NAFLD indicates more severe inflammatory and immunopathological reaction. We found an increased level of IgG antibodies to LPS and HMM in patients with type 2 diabetes and NAFLD which correlates with the levels of proinflammatory cytokines, indicating the pathogenic role of endotoxin of gram-negative intestinal microflora in the induction of systemic inflammation in these patients.

Key words: cytokines, endotoxemia, diabetes, nonalcoholic fatty liver disease.

Адрес для корреспонденции: kondratiuk_valentina@mail.ru

Поступила 16.10.2014

Журнал Гродненского государственного медицинского университета № 4, 2014 г. 89