CC BY
55
УДК 597-113.32:597.554.3
А. Н. Неваленный, Д. А. Бедняков*
Кафедра гидробиологии и общей экологии Кафедра прикладной биологии и микробиологии
УРОВЕНЬ АКТИВНОСТИ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ, ОСУЩЕСТВЛЯЮЩИХ МЕМБРАННОЕ ПИЩЕВАРЕНИЕ У КАРПА, ПРИ ДЕЙСТВИИ РАЗЛИЧНЫ1Х МОДИФИКАТОРОВ
В настоящее время достоверно известно, что многие ферменты, обеспечивающие процессы мембранного гидролиза в кишечнике различных животных, являются регулируемыми (Уголев, 1972; Кушак, 1983; Уголев, Кузьмина, 1993; Неваленный и др., 1996). Показано, что на каталитические свойства ряда ферментов оказывают влияние вещества, не являющиеся субстратом для исследуемого фермента, названные модификаторами. Данная регуляция осуществляется благодаря связыванию модификатора с активным центром фермента, вследствие чего наблюдается изменение конфигурации, а следовательно, и активности фермента (Калоус, Павличек, 1985). Эти обстоятельства делают понятным интерес к изучению взаимодействия различных веществ и ферментов, участвующих в процессе пищеварения, поскольку знание этих закономерностей позволит приблизиться к истинному пониманию взаимодействий, протекающих в организме, а также к созданию производственных биотехнологий (Уголев, 1972). Необходимо также отметить, что если регуляторные свойства пищеварительных ферментов, функционирующих у высших позвоночных, исследованы довольно подробно (Кушак, 1983; Уголев, 1972; Die regulatorischen Eigenscholten ... ,1979 и др.), у рыб они изучены в меньшей степени (Уголев, Кузьмина, 1993; Неваленный, Коростелев, 2002; Неваленный, Бедняков, 2002).
В связи с этим целью данной работы являлось исследование моди-фикационного вздействияуглеводов, аминокислот, белков и жиров на уровень активности мальтозы, щелочной фосфатазы и суммарной протеазы слизистой оболочки кишечника карпа.
Материал и методика
Работа выполнена на сеголетках карпа (Cyprinus carpió L.). В качестве модификаторов использовали: 10 мМ растворы глюкозы, фруктозы, глицина, L-глутамина, L-лейцина, ^L-^-фенила-а-аланина, 5 мМ растворы мальтозы, сахарозы, глицил-глицина, смесь глюкозы и фруктозы с концентрацией каждого из модификаторов в 5 мМ, крахмал, казеин, желатин, масло кукурузное и подсолнечное в концентрации 2 г/л.
Уровень активности мальтозы в слизистой кишечника определяли модифицированным глюкозооксидазным методом (Балаховский, 1987), щелочной фосфатазы - по степени гидролиза n-нитрофенилфосфата Na, активность суммарной протеазы - модифицированным методом Лоури (Алейникова, Руб-
цова, 1988). В качестве субстрата при определении уровня активности мальтозы использовали 2 %-й раствор мальтозы, щелочной фосфатазы - 0,6 мМ раствор и-нитрофенилфосфата Na, суммарной протеазы - 1 % раствор казеина.
Результаты обрабатывали методами вариационной статистики (Лакин, 1990). Достоверность различий определялась с помощью критериев Стьюдента. Основная часть статистической обработки выполнена с использованием пакетов статистической обработки информации STATGRAPHICS for WINDOWS 5.0.
Результаты исследований
В результате проведенной работы (табл.) установлено, что глюкоза вызывает статистически достоверное (р < 0,05) ингибирование уровня активности мальтозы (на 85 %), смесь глюкозы и фруктозы также приводит к достоверному ингибированию уровня активности данного фермента (на 80 %) в слизистой оболочке кишечника карпа. Фруктоза, сахароза и крахмал, напротив, вызывают достоверное (р < 0,05) увеличение уровня активности мальтозы в среднем на 26 %. Ранее подобные результаты на крысах получили Де Лей (De Laey, 1966) и Еггермонт (Eggermont, 1986), которые высказали предположение о тормозящем действии продуктов гидролиза углеводов на их ферментативное расщепление.
Влияние модификаторов различной природы на уровень активности некоторых мембранно-связанных ферментов в слизистой оболочке кишечника карпа
Модификатор Уровень активности фермента (мкмоль/гхмин)
Мальтоза Щелочная фосфатаза Суммарная протеаза
Контроль 4,44 ± 0,16 0,99 ± 0,01 0,78 ± 0,02
Глюкоза 10 мМ 0,69 ± 0,07* 0,99 ± 0,01 0,74 ± 0,02
Фруктоза 10 мМ 5,45 ± 0,34* 0,96 ± 0,02 0,79 ± 0,04
Глюкоза 5 мМ + фруктоза 5 мМ 0,92 ± 0,09* 0,98 ± 0,01 0,71 ± 0,03*
Сахароза 5 мМ 5,94 ± 0,13* 1,06 ± 0,01* 0,77 ± 0,04
Мальтоза 5 мМ - 1,01 ± 0,02* 0,73 ± 0,04
Крахмал 2 г/л 5,50 ± 0,18* 0,85 ± 0,01* 0,71 ± 0,05
Г лицин 10 мМ 5,23 ± 0,16* 0,94 ± 0,01* 0,77 ± 0,04
Глицил-глицин 5 мМ 4,91 ± 0,10* 1,09 ± 0,02* 0,77 ± 0,04
¿-глутамин 10 мМ 5,50 ± 0,11* 1,07 ± 0,02* 0,76 ± 0,02
¿-лейцин 10 мМ 5,21 ± 0,15* 0,93 ± 0,01* 0,74 ± 0,01*
Д£-З-фенил-а-аланин 10 мМ 5,78 ± 0,13* 0,96 ± 0,01* 0,80 ± 0,03
Казеин 2 г/л 6,10 ± 0,21* 1,11 ± 0,03* -
Желатин 2 г/л 5,36 ± 0,25* 0,98 ± 0,01 -
Масло подсолнечное 2 г/л 5,57 ± 0,21* 1,12 ± 0,03* 0,76 ± 0,04
Масло кукурузное 2 г/л 5,09 ± 0,24* 0,98 ± 0,01 0,71 ± 0,03*
* Достоверное (р < 0,05) отличие по сравнению с контролем.
При исследовании влияния аминокислот, белков и жиров на уровень активности мальтозы слизистой оболочки кишечника карпа установлено
достоверное (р < 0,05) увеличение уровня активности фермента. При этом следует отметить, что наиболее сильно активирует уровень активности мальтозы раствор казеина (на 38 %).
При исследовании влияния различных модификаторов на уровень активности щелочной фосфатазы слизистой оболочки кишечника карпа было выявлено, что моносахариды не вызывают статистически достоверных изменений в уровне активности фермента, в то время как дисахариды приводят к незначительному, но статистически достоверному (р < 0,05) увеличению уровня активности щелочной фосфатазы (в среднем на 5 %), а полимер крахмал, напротив, ингибирует уровень активности фермента на 14 %. Аминокислоты действовали на скорость гидролиза эфира фосфорной кислоты разнонаправленно: так, присутствие глицина, ¿-лейцина, ^¿-^-фенил-а-аланина в инкубационной среде привело к ингибированию уровня активности щелочной фосфатазы на 5 %, присутствие глицил-глицина и ¿-лейцина, напротив, привело к увеличению уровня активности фермента на 9 %. Белок казеин, присутствуя в инкубационной среде, вызвал статистически достоверное (р < 0,05) увеличение уровня активности щелочной фосфатазы на 13 %, желатин не вызвал статистически значимых изменений в уровне активности данного фермента. Присутствие в инкубационной среде подсолнечного масла привело к увеличению скорости гидролиза эфира фосфорной кислоты на 14 %.
Изменение уровня активности суммарной протеазы слизистой оболочки кишечника карпа в присутствии различных модификаторов выражено лишь в единичных случаях. Так, продукты гидролиза мальтозы, ¿-лейцин и кукурузное масло, ингибировали уровень активности суммарной протеа-зы в среднем на 9 %. Остальные модификаторы не вызвали статистически значимых изменений в уровне активности фермента. Такая слабая алло-стерическая регуляция данного фермента объясняется, скорее всего, тем, что суммарная протеаза - это комплекс ферментов, состоящий не только из собственно кишечных ферментов, но и из ферментов панкреатического происхождения, которые не имеют амфипатической структуры и, следовательно, в меньшей степени подвержены субстратному регулированию (Кушак, 1983; Уголев, Кузьмина, 1993).
Так, представленные выше данные характеризуют взаимодействие между углеводами и липидами, углеводами и пептидами, углеводами и аминокислотами, т. е. соединениями, принадлежащими к различным классам пищевых веществ. Такие взаимодействия, согласно классификации А. М. Уголева (Уголев, 1972), являются межцепными, так как ассимиляция субстрата и модификатора осуществляется в различных метаболических путях. Однако данные по исследованию влияния углеводов на гидролиз мальтозы свидетельствуют о существовании определенных взаимоотношений и в пределах одной группы пищевых веществ, переваривание которых может быть взаимосвязанным. Таким образом, установлено, что гидролиз мальтозы, так же как и эфира фосфорной кислоты, существенно меняется в присутствии ряда пищевых веществ, относящихся к различным
классам соединений. Наиболее мощными ингибиторами переваривания углеводов оказались вещества одноименной природы.
Некоторые закономерности аллостерического регулирования имеют определенное значение для понимания механизма реализации пищеварительной функции in situ. Полисубстратное усвоение пищи обеспечивает тесное сопряжение работы различных ферментативных цепей в кишечнике рыб, чем достигается определённый автоматизм в работе пищеварительной системы. Путем регуляции на уровне активности пищеварительных ферментов осуществляется определённая последовательность обработки пищи и, по-видимому, интеграция пищеварительных и транспортных процессов.
СПИСОК ЛИТЕРА ТУРЫ
1. Алейникова Т. Л., Рубцова Г. В. Биохимия. Руководство к практическим занятиям по биологической химии. - М.: Высш. шк., 1988. - 239 с.
2. Балаховский И. С. Лабораторные методы исследования в клинике / Под ред.
В. В. Меньшикова. - М.: Медицина, 1987. - С. 230-234.
3. КалоусВ., ПавличекЗ. Биофизическая химия / Пер. с чеш. - М.: Мир, 1985. - 446 с.
4. Кушак Р. И. Пищеварительно-транспортная система энтероцитов. - Рига: Зинатне, 1983. - 304 с.
5. Лакин Г. Ф. Биометрия. - М.: Высш. шк., 1990. - 370 с.
6. Неваленный А. Н., Бедняков Д. А. Взаимодействие пищевых модификаторов
с мембранно-связанными ферментами в кишечнике белуги и белорыбицы // Естественные науки. - 2002 - № 5. - Астрахань: Изд-во АГПУ. - С. 66-69.
7. Неваленный А. Н., Коростелев С. Г. Влияние модификаторов на процесс мембранного пищеварения у сибирского осетра Acipenser baeri // Журнал эволюц. биохимии и физиологии. - 2002. - 38, № 2. - С. 185-187.
8. Неваленный А. Н., Егоров С. Н., Коростелев С. Г. Взаимодействие пищевых
веществ в процессе пищеварения у рыб на примере карпа Cyprinus carpio // Журнал эволюц. биохимии и физиологии. - 1996. - Т. 32, № 2. - С. 156-159.
9. Уголев А. М. Мембранное пищеварение и процессы усвоения пищи в мире животных // Журнал эволюц. биохимии и физиологии. - 1972. - Т. 8, № 3. - С. 269-278.
10. Уголев А. М., Кузьмина В. В. Пищеварительные процессы и адаптации у рыб. -СПб: Гидрометеоиздат, 1993. - 239 с.
11. Die regula-torischen Eigenschaften der Darmenzyme höherer und niederer Tiere als Adaptations mechanismus der Verdauung and der Resorption / Ugolev A. M., Egorova V. V., Iezuitova N. N., Mityushova N. M. // Die Nahrung. - 1979. - Bd. 23.
12. De Laye P. Membranverdauung der Stärke. 2 Mitt. Der Einfluss von Mucinen auf die Membranverdauung der Stärke // Die Nahrung. - 1966. - Bd. 10, N 8. - S. 649-653.
13. Eggermont E. The biochemical defects in sucrose intolerance and in glucose-galactose malabsorption. These, 1968.
Получено 20.01.04
ACTIVITY OF DIGESTIVE ENZYMES HELPING MEMBRANE DIGESTION OF A CARP UNDER THE INFLUENCE OF VARIOUS MODIFICATORS
A. N. Nevalenniy, D. A. Bednyakhov
There is given data about influence of different modifica-tors (carbohydrates, amino acids, albumens) on the activity of some membrane-connected enzymes in mucous membrane of carp’s intestine. It’s proved that both maltose hydrolysis and phosphoric acid change greatly under influence of a number of food products of different class components. The strongest inhibitors of digesting hydrocarbons happened to be substances of the same nature. Changing activity of total protease in mucous membrane of carp’s intestine in presence of modificators appears not often.
