CC BY
76
УРЕАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ ОРАЛЬНОЙ МИКРОФЛОРЫ
Быков С. Э., Быков А. С.
A STUDY OF UREASE ACTIVITY OF MOUTH CAVITY MICROFLORA
Bykov S. E., Bykov A. S.
Быков С. Э. ООО «Ассоциация Медицины и Аналитики». Ведущий специалист.
Быков А. С. Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет). Кафедра молекулярной биотехнологии. Аспирант.
Bykov S. E. "Association of Medicine and Analytics". Leading Specialist
Bykov A. S., Saint-Petersburg State Institute of Technology (Technical University). Department of Molecular Biotechnology. Graduate student.
Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет). Кафедра молекулярной биотехнологии.
Общество с ограниченной ответственностью «Ассоциация Медицины и Аналитики».
Быков
Сергей Эдуардович Bykov S. E. E-mail:
bse_mail@mail.ru
Резюме
Цель исследования. Изучение степени распространенности уреалитической микрофлоры оральной локализации, и определение уровня ее ферментативной активности в зависимости от концентрации и количества принимаемого в качестве субстрата раствора мочевины.
Материалы и методы. В исследовании участвовали 62 случайно отобранных пациента в возрасте от 5 до 64 лет. Каждый из них ополаскивал рот 1 % раствором мочевины в объеме 50 мл. До ополаскивания и после него производилось измерение концентрации аммиака в воздухе ротовой полости. Для пациента с максимальной активностью оральной уреалитической микрофлоры проводилась серия экспериментов с ополаскиванием ротовой полости при различных концентрациях и объемах раствора мочевины с измерением базальной и нагрузочной концентрации аммиака. Полученные результаты обработаны с помощью методов математической статистики.
Результаты. Установлено, что 91 %±1.8 % пациентов (p<0.05) из числа случайно выбранных, обладают выраженной уреазной активностью оральной микрофлоры. Получены оценки минимальных значений концентрации (0,0625 % в 50 мл) и объема (0.5 мл при 1 %) раствора мочевины, способные оказывать негативное влияние на результаты диагностики хеликобактериоза при анализе пробы воздуха из ротовой полости.
Заключение. Уреазная микрофлора оральной локализации имеет широкое распространение и может быть фактором, негативно влияющим на специфичность диагностики хеликобактериоза методами, основанными на определении показателей присутствия газовых метаболитов ферментативной реакции в пробах воздуха, взятых из ротовой полости после перорального приема мочевины.
Ключевые слова: уреазная микрофлора, ротовая полость, Helicobacter pylory, диагностика хеликобактериоза. Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология 2014; 103 (3):61-66
Summary
Study objective. Analysis of the prevalence of mouth cavity urealytic microflora and determination of the level of its enzymatic activity depending on concentration and amount of urea solution taken as a substrate.
Materials and methods. 62 randomly chosen patients at the age of 5-64 took part in the study. Each of them rinsed the mouth with 50 ml of 1 % urea solution. Before and after rinsing the concentration of ammonia in the mouth cavity air was measured. In patients with highest and lowest activity of mouth cavity urealytic microflora a series of tests was carried out including mouth rinsing with urea solution in various concentrations and amounts and measuring ammonia concentration before and after rinsing. Obtained results were analyzed using mathematical statistics methods.
Results. It was found that in 91 %±1.8 % of randomly chosen patients (p<0.05) mouth cavity microflora showed apparent urease activity. The lowest concentration (0.0625 % in 50 ml) and volume (0.5 ml of 1 % solution) levels of urea solution were obtained that can exert negative influence on the results of helicobacteriosis diagnosis by means of mouth cavity air analysis.
Conclusion. Urealytic microflora in the mouth cavity is very common and may constitute a factor that decreases the specificity of helicobacteriosis diagnosis by means of the methods based on detection of indicators of gas metabolites resulting from the enzymatic reaction in air samples taken from the mouth cavity after oral administration of urea.
Keywords: urease microflora, oral cavity, Helicobacter pylori, helicobacteriosis diagnosis.
Eksperimental'naya i Klinicheskaya Gastroenterologiya 2014; 103 (3):61-66
Введение
Наш интерес к уреалитической активности микрофлоры ротовой полости обусловлен стремлением оценить возможность ее влияния на результаты неинвазивной диагностики хеликобактериоза методами, основанными на определении изменений показателей присутствия газовых метаболитов в пробах выдыхаемого воздуха и воздуха ротовой полости в результате протекания в желудке
реакции гидролиза карбамида в присутствии га-стральной уреазы. К таким методам относятся известный уреазный тест, основанный на анализе прироста содержания изотопа 13С в составе выдыхаемого С02 [1] и уреазный аммиачный тест, основанный на определении прироста концентрации ЫН3 в воздухе ротовой полости [2]. Оба метода предполагают пероральный прием раствора
мочевины в качестве субстрата каталитической реакции, и оба не предусматривают использование мер, направленных на ингибирование активности оральной бактериальной уреазы.
Состав уреазной микрофлоры ротовой полости не велик. В него входят такие микроорганизмы как Proteus mirabilis, Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae и Staphylococcus aureus [3]. Особая роль по объему производимой уреазы и по степени ее активности принадлежит Helicobacter Pylori, которая также контаминиру-ет ротовую полость и оказывает доминирующее влияние на изменение состава воздуха в сторону повышения концентрации газовых метаболитов при гидролизе мочевины.
Гидролиз мочевины в области непосредственного отбора аналитической пробы воздуха, где потери ее концентрации и изменение состава минимальны, априори являются фактором, способным оказывать влияние на результаты диагностики хелико-бактериоза.
Наше исследование уреалитической активности бактериальной флоры ротовой полости построено на изучении изменений концентрации NH3 — одного из метаболитов ферментативной реакции. Такой подход требует минимум затрат на техническое и организационное обеспечение, сохраняя при этом полную информативность относительно продуцирования второго метаболита — двуокиси углерода.
Материал и методы исследования
Для исследования была образована группа из 62 случайно отобранных лиц в возрасте от 5 до 64 лет с неустановленным HP статусом, 42 из которых были добровольцами. Каждый из пациентов прополаскивал ротовую полость 50 мл 1% раствора мочевины нормального изотопного состава 12OH4 14N2 16O без проглатывания с последующим измерением динамики концентрации NH3 в воздухе ротовой полости при назальном дыхании. Измерение концентрации NH3 проводилось с помощью Хелик — аппарата [ООО «АМА», Россия], использующего электрохимический датчик с пределами чувствительности от 0 до 100 ppm. Каждый сеанс измерений состоял из двух периодов по 9 минут каждый с двухминутным перерывом. Концентрация NH3 в периоды измерений фиксировалась дискретно каждую секунду, образуя, таким образом, выборку из 540 значений. Значение концентрации представлялось в условных единицах (у. е.). Согласно градуировочной зависимости 32 у. е. соответствовали нулевой концентрации NH3, а 255 у. е. соответствовали концентрации в 24.85 ppm. Факт наличия уреазной активности определялся по достоверному (p<0.001) отличию эмпирических распределений измеренных концентраций NH3 до и после принятия нагрузки.
Результаты исследования
В группе из 62 лиц 57 человек ответили значимым повышением концентрации аммиака после полоскания ротовой полости 1% раствором мочевины
Мочевина, как известно, содержится во всех биологических жидкостях организма человека. В ротовой жидкости ее содержание составляет 200 мг на один литр [4]. Соотношение концентраций мочевины в слюне и нагрузках для различных методов, приведено на рисунке 1.
Из приведенной диаграммы видно, что количество мочевины, используемой в качестве субстрата ферментативной реакции, для различных тестов отличается примерно на порядок. Это предопределяет различие, как в скорости ферментативной реакции, так и в концентрации продуктов гидролиза при прочих равных условиях (концентрации фермента, температуры и pH среды). В связи с последним замечанием, а также с учетом цели настоящей статьи, представляется важным получение ответов на следующие вопросы:
1. Какова степень распространенности в группе случайно отобранных лиц оральной уреалити-ческой микрофлоры.
2. Какова степень активности оральной уреалити-ческой микрофлоры при различных концентрациях и количествах принимаемого в качестве нагрузки субстрата, и каковы минимальные пороговые значения этих величин.
3. Существуют ли доступные, надежные и эффективные немедикоментозные методы ингибиро-вания уреазной активности оральной микрофлоры.
Для пациента с максимальной установленной уреазной активностью микрофлоры ротовой полости, определяемой по величине достигнутого максимума концентрации NH3, проводилась серия экспериментов по оценке минимальных значений концентрации и объема раствора мочевины, при которых сохранялись проявления уреазной активности. Для определения пороговых концентраций мочевины пациенту предлагалось прополаскивать рот растворами мочевины с концентрациями из ряда 1 /16,1/ 8,1 /4,1 /2,1,2 ,3,4, где за 1 принимался раствор 1% концентрации. Для концентрации 0.1% — рабочей концентрации мочевины при проведении 13С-теста, проводилось дополнительное исследование с помощью инфракрасного спектрометра IR-force 200 (Richen-Force, China) с меченной изотопом 13С мочевиной того же производства. Исследованию подвергался состава воздуха, выдыхаемого через ротовую полость на наличие в нем диагностического прироста изотопа 13C. Для определения пороговых объемов нагрузки, пациенту вводились в ротовую полость растворы мочевины концентрации 1% в объемах 0 (плацебо), 0.5, 1, 2 мл с последующим определением наличия уреазной активности оральной микрофлоры по изложенной выше методике. Все эксперименты проводились утром, натощак, примерно в одно и то же время.
в объеме 50 мл. Доверительные пределы для параметра биномиального распределения в этом случае составили 91 ±1.8%, при доверительной
Рисунок 1.
Концентрация мочевины в слюне и в нагрузочных растворах, используемых в различных методах диагностики хеликобактериоза.
1,80 1,60 1,40 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00
1,67
минимально ■ максимально
0,02
Аммиачный тест
Слюна
13С-Тест
Рисунок 2.
Изменение средней концентрации МИ3 в воздухе ротовой полости в зависимости от концентрации мочевины в ополаскивающем растворе.
250
3" *
S. s
х 2
аммиачным тест
209
□ Первые 9 минут наблюдений ■ Вторые 9 минут наблюдений
100 -
0.0625
0.125 0.25 0.5 1,0 2,0 Концентрация раствора мочевины, %
Рисунок 3.
Влияние остаточных объемов 1% раствора мочевины
на степень уреалитической активности микрофлоры ротовой
полости.
£ 120 z 100
п: s zr
S 80
I Ol ZT
15 60
40 20
□ Первые 9 минут измерения ■ Вторые 9 минут измерения
0 0,5 1 2
Объемы 1% раствора мочевины, вливаемые в подъязычный бассейн, мл
220
200
150
50
0
140
Интервалы концентрации NH3 (у.е.) Частота случаев Номер полоскания (вода 50 мл) Невозвращенный объем воды, мл
не более 50 0,05 1 4,3
51-100 0,19 2 2,1
101-150 0,20 3 2,1
151-200 0,12 4 2,1
более 200 0,44 5 1,5
6 1,7
7 1,3
Таблица 1.
Распределение значений максимума концентрации ЫИЗ в воздухе ротовой полости после ополаскивания ее 1% раствором мочевины.
Таблица 3.
Невозвращаемые объемы воды в серии ополаскиваний ротовой полости.
Вид измерения Время начала измерения (час:мин) Средняя концентрация NH3 (у.е.) Доверительная граница (p<0.05) (у.е.)
Базальный 8:43 33,1 ±0,06
9:02 34,9 ±0,13
9:13 35,1 ±0,19
н г о 9:24 36,3 ±0,35
й. 9:39 37,8 ±0,24
[и а щ
11:02 44,3 ±0,40
Таблица 2.
Динамика изменения концентрации ЫИЗ в воздухе ротовой полости после полоскания рта 0.1% раствором мочевины.
вероятности не менее 95%. Это результат означает, что в группе из 100 случайно отобранных лиц с вероятностью не менее 95% от 89 до 93 человек будут иметь в ротовой полости уреалитически активную микрофлору. Распределение максимумов концентрации ЫН3, достигнутой за два периода последовательных наблюдений приведено в таблице 1.
Из таблицы следует, что степень уреалитиче-ской активности микрофлоры ротовой полости, как правило, весьма высока. Более чем в 75% случаев значения достигнутых максимумов концентрации ЫН3 превосходило 100 у. е. (примерно 9.75 ррт).
Изменение уреазной активности оральной микрофлоры в зависимости от концентрации принимаемой мочевины и определение минимальных пороговых ее значений проводилось на добровольце, обнаруживающим при ополаскивании рта 1% раствором мочевины, наиболее высокое значение концентрации ЫН3 более 255 у. е. (более 25 ррт). Результаты проведенных измерений приведены на рисунке 2.
Из рисунка видно, что с увеличением концентрации принимаемой мочевины растет значение средней концентрации индуцируемого ЫН3 (а, следовательно, и С02), что полностью соответствует теории ферментативных процессов при положительном катализе [5]. Обращает на себя внимание два важных обстоятельства. Первое, при концентрации мочевины в 2% происходит резкое снижение концентрации продуцируемого ЫН3, что объясняется развитием процесса автоингибирования фермента субстратом при избытке субстата [5]. Второе, при концентрации мочевины в 0.0625%, которая значительно меньше, чем рабочая концентрация мочевины 13С-теста, сохраняется достоверный прирост индуцированного аммиака (и, следовательно, С02) в воздухе ротовой полости, что потенциально может влиять на результаты диагностики хелико-бактериоза при использовании «дыхательного» метода. В силу особой важности этого обстоятельства, мы специально изучили динамику ферментативной активности уреалитической микрофлоры ротовой полости при использовании 0.1% раствора меченной углеродом 13С мочевины параллельно
двумя методами: с помощью Хелик-аппарата, регистрирующего прирост концентрации NH3, и с помощью ИК спектрометра IR-force 200, регистрирующего прирост изотопа 13С в составе воздуха ротовой полости.
По данным ИК спектроскопии, полученным на 15 и 30 минуте после приема нагрузки, прирост изотопа 13С относительно базального уровня составил 000.2 и 000.8 DOB. Несмотря на видимую положительную динамику, оба результата тестирования были признаны отрицательными. Концентрация NH3, измеренная в течение первых 40 минут нагрузочного периода и далее через 2 часа, монотонно и достоверно (p<0.05) росла (см. таблицу 2).
В практике применения обоих тестов нет процедуры ополаскивания растворами мочевины ротовой полости, поэтому полученные нами результаты относятся к предельным случаям ее воздействия на оральную бактериальную уреазу. Однако, при перораль-ном приеме жидкости, часть ее объема неминуемо остается в ротовой полости, заполняя имеющиеся ямки, подъязычный бассейн, увлажняя слизистую поверхность. Для оценки этих объемов мы провели последовательную серию экспериментов с набором в рот жидкости объемом 50 мл с немедленным возвратом ее в мерный сосуд для измерения возвращенного объема. Результаты этого теста приведены в таблице 3.
Из таблицы видно, что величина удерживаемых объемов определяется исходным состоянием увлажнения слизистой оболочки ротовой полости и имеет тенденцию к уменьшению.
Для оценки степени влияния невозвращенных объемов раствора карбамида на уреалитическую активность микрофлоры ротовой полости мы последовательно вводили пациенту с высокой степенью оральной уреазной активностью вливанием через пипетку 1% раствор мочевины в подъязычный бассейн в объемах 0.5, 1 и 2 мл. Перед вливанием и после него измерялась средняя концентрация NH3 в воздухе ротовой полости за период измерения. Достоверный (p<0.001) прирост концентрации аммиака отмечался во всех случаях вливания мочевины. Результаты приведены на рисунке 3.
Обсуждение полученных результатов
В ходе исследования установлено, что перораль-ный прием мочевины при диагностике хеликобактериоза методами, основанными на изменении состава выдыхаемого воздуха и воздуха ротовой полости, может сопровождаться развитием параллельного процесса гидролиза мочевины уреазапродуцентами ротовой полости. Этот побочный эффект способен возникать при очень низких концентрациях раствора мочевины (0.0625 %), значительно более низких, чем рабочие концентрации тестовых наборов углеродных (0.1%) и аммиачных диагностических тестов (1%). При высоких концентрациях мочевины ферментативный процесс в ротовой полости может начинаться при малых объемах субстрата (0.5 мл) сравнимых или даже меньших, чем остаточные объемы жидкости, расходуемые на увлажнение слизистой оболочки ротовой полости при перо-ральном приеме жидкости (2-4 мл). Поскольку распространение уреалитической микрофлоры велико и составляет порядка 90%, то достижение высокой специфичности диагностики хеликобактериоза указанными методами представляет собой проблему. Обращает на себя внимание то обстоятельство, что, несмотря на протекание гидролиза мочевины в ротовой полости, установленное по достоверному (p<0.001) приросту аммиака, мы не смогли обнаружить этого факта с помощью 13С-теста. Причиной этому, как нам представляется, является не слабая чувствительность теста, а существенные различия способов отбора пробы в том и другом случае.
Анализ этих различий привел нас к заключению о том, что в случае отбора пробы воздуха для углеродного теста, в ротовой полости пациента в каждый момент времени присутствует минимальное количество продукта оральной ферментативной реакции. Действительно, если непосредственно перед взятием пробы воздуха рот пациента закрыт, то свободный внутренний объем ротовой полости близок к нулю, так как язык заполняет практически все внутреннее пространство. Следовательно, объем продуктов гидролиза мочевины, также минимален. Непосредственно в момент взятия пробы воздуха, пациент делает вдох через рот и дополнительно разбавляет незначительное газовое содержимое ротовой полости атмосферным воздухом, сводя присутствие газовых метаболитов в пробе практически к нулю. Если перед взятием пробы рот пациента был открыт, то, вероятнее всего, дыхание
Выводы
было также оральным, поскольку пневматическое сопротивление ротовой полости меньше, чем пневматическое сопротивление носовых ворот. В этом случае ротовая полость просто подвергается вентиляции атмосферным воздухом, что также сводит присутствие газовых метаболитов в пробе воздуха практически к нулю. Таким образом, способ подготовки аналитической пробы воздуха для применения углеводного теста препятствует влиянию побочного ферментативного процесса в ротовой полости на результат диагностики хеликобактериоза с помощью 13С-теста.
В случае аммиачного теста, отбор пробы воздуха осуществляется принудительно с помощью вакуумного насоса из открытой ротовой полости при назальном дыхании пациента и в течение продолжительного времени. Накапливаемый объем максимален и не подвергается активному разбавлению атмосферным воздухом. Этот способ обеспечивает бережное формирование к сохранению состава воздуха ротовой полости и максимальную чувствительность к его изменению, но, в силу этих же особенностей, может приводить к негативному влиянию побочных эффектов, протекающих в ротовой полости.
В наших исследованиях мы пытались использовать доступные на рынке бактерицидные ополаскивающие растворы («Стоматидин», «Лесной бальзам», «32 Бинорма»), а также чистую воду для уменьшения или хотя бы отсрочивания проявлений уреалитической активности оральной микрофлоры, но к практически значимому эффекту это не привело.
В связи с изложенным возникает вопрос о целесообразности использования аммиачных методов в диагностике хеликобактериоза. Этот вопрос мы считаем неправомерным. Последние исследования по реконструкции процессов транспорта аммиака из желудка в ротовую полость [6], эксперименты, проведенные в клинике, а так же теоретические разработки, показали, что, несмотря на потери, связанные с высокими абсорбционными свойствами, продуцированный под действием гастральной уреазы аммиак легко детектируется в воздухе ротовой полости. При этом разработанные к настоящему времени методы анализа, позволяют однозначно определить наличие или отсутствие в воздухе ротовой полости аммиака гастрального происхождения. Результаты этих исследований находятся в настоящее время на стадии патентования.
1. Получена оценка распространенности оральной уреалитической микрофлоры. Она составляет более 89%.
2. Уреазная активность оральной микрофлоры весьма высока. Даже при малых концентрациях перорально принимаемого раствора мочевины (0.065%), в ротовой полости развивается процесс ее гидролиза, который детектируется газоанализатором на NH3.
3. При 1% концентрации перорально принимаемого раствора мочевины, процесс ее гидролиза детектируется по NH3 при сверхмалых объемах субстрата (от 0.5 мл).
4. При диагностике хеликобактериоза аммиачными тестами следует принимать во внимание возможное развитие побочных процессов гидролиза мочевины за счет оральной уреазной микрофлоры.
