УНИВЕРСАЛЬНАЯ БИОРЕАКТОРНАЯ СИСТЕМА МАЛОГО ОБЪЕМА С ПЕРКОЛЯЦИОННЫМ ПЕРЕМЕШИВАНИЕМ ЛБ-1 ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ, ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ К МЕХАНИЧЕСКОМУ ПОВРЕЖДЕНИЮ Текст научной статьи по специальности «Электротехника, электронная техника, информационные технологии»

ISSN 0868-5886

НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2024, том 34, № 1, c. 62-80

ПРИБОРОСТРОЕНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ -БИОЛОГИИ

УДК 57.083.132

© Т. С. Тихомирова, Ю. А. Лепехин, М. Р. Тараскевич, 2024

УНИВЕРСАЛЬНАЯ БИОРЕАКТОРНАЯ СИСТЕМА МАЛОГО ОБЪЕМА С ПЕРКОЛЯЦИОННЫМ ПЕРЕМЕШИВАНИЕМ ЛБ-1 ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ, ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ К МЕХАНИЧЕСКОМУ ПОВРЕЖДЕНИЮ

Лабораторные биореакторы малого объема (до 5 л) являются удобным и эффективным инструментом для проведения биотехнологических процессов, тематика которых весьма разнообразна. Главной целью их использования являются углубленное изучение особенностей процессов, проводимых в контролируемых условиях, а также их дальнейшая оптимизация и масштабирование. В данной работе предложен лабораторный биореактор малого объема ЛБ-1 (1.5 л), перемешивание в котором осуществляется за счет возвратного тока жидкой фазы между двумя цилиндрическими емкостями под действием сжатого воздуха (перколяция). При этом насыщение питательной среды газами происходит в пленке жидкости на поверхности емкостей и твердотельных носителей. Массообменные характеристики позволяют классифицировать ЛБ-1 как пленочный биореактор колонного типа, который может быть использован для культивирования микроорганизмов, чувствительных к механическому воздействию, а также для иммобилизованных омываемых культур. Кроме того, был разработан погружной теплообменник, особенности работы которого выявлены с помощью численного моделирования процесса термостатирования. На основе результатов гидродинамического моделирования был разработан паростерилизуемый крестообразный разъем с перегородкой для асептического отбора проб.

Кл. сл.: лабораторный биореактор малого объема, колонный биореактор, биопленки, масштабирование, биотехнологический процесс, перколяционное перемешивание

ВВЕДЕНИЕ

Биореакторы малого объема являются лабораторным оборудованием, которое используют для проведения различных биотехнологических процессов. При этом тематика данных исследований довольно разнообразна. Помимо одностадийного культивирования продуцентов, лабораторные биореакторы могут быть использованы для отработки процессов очистки сточных вод [1, 2], биокаталитической трансформации субстратов [3, 4], получения вакцин [5, 6], вирусной трансформации клеток [7] и т.д. Целью их использования являются исследование особенностей процессов, проводимых в контролируемых условиях [8, 9], дальнейшая их оптимизация [10, 11] и масштабирование [12, 13].

Существует несколько подходов к классификации биореакторов, основанных на их конструкции, режимах работы, способах подвода энергии, а также типах осуществляемых процессов [14-17]. Поэтому при постановке биотехнологического эксперимента следует учитывать множество параметров для выбора адекватной модели биореакторной системы. Реакторы колонного типа и реак-

торы с мешалкой являются наиболее популярными конструкциями, обеспечивающими необходимый минимум биотехнологического процесса. Колонные биореакторы обеспечивают мягкое перемешивание за счет барботажа. При этом не возникает напряжений сдвига, которые могут негативно влиять на рост и развитие культуры [18, 19]. Недостатком данной конструкции является низкое значение коэффициента массопереноса kLa до 320 ч-1 [20, 21]. Данный показатель можно повысить путем увеличения объемного расхода перемешивающего газа [20] или за счет изменения линейных размеров колонны [22]. В свою очередь, биореактор с мешалкой характеризуется более высокими показателями массопереноса (50-550 ч-1 [23-25]), что повышает его спрос на рынке.

Вышеперечисленные типы биореакторов активно используются в процедурах как прямого, так и обратного масштабирования. Прямое масштабирование процессов культивирования или биокатализа является важным этапом биотехнологических исследований. Оно включает в себя перенос лабораторного эксперимента в контролируемые условия биореактора с последующим поэтапным увеличением объемов. Результаты пря-

мого масштабирования позволяют судить о рентабельности исследуемого процесса [11, 26-28]. Тем не менее увеличение объемов также повышает риск возникновения градиента скорости и концентрации в реакционной зоне, что ведет к снижению эффективности процесса. В таких случаях целесообразно проводить обратное масштабирование. Суть данного метода состоит в симуляции процессов, происходящих в определенных зонах промышленных биореакторов (пристеночных, центральных, придонных и т.д.) [8, 29, 30].

Как видно, прямое и обратное масштабирование осуществляются с помощью лабораторных биореакторов малого объема (0.1-5 л), которые позволяют оптимизировать условия проведения микробиологических и ферментационных процессов и произвести сбор данных о влиянии различных факторов (способ перемешивания, увеличение реакционного объема, температурный и кислородный режимы и т.д.) на конечный результат. В на-

стоящий момент конструкция коммерческих лабораторных биореакторов представлена в виде реактора с лопастной мешалкой (турбина Раштона) с различным числом лопастей (табл. 1).

Данный тип мешалок обеспечивает в основном радиальное (от центра к стенке) течение жидкости. Мешалки с наклонным расположением лопастей создают также и слабые осевые (вдоль вала) токи. При этом при перемешивании возникает напряжение сдвига, что может повлиять на рост и развитие чувствительных к механическому повреждению микроорганизмов [31-34]. Эффективность данной конструкции также может быть снижена, поскольку перемешивание жидкости происходит только в области, прилегающей непосредственно к лопастям. Поэтому при перемешивании лопастными мешалками в высоком слое жидкости их выполняют многоярусными, что создает еще больше сдвиговых напряжений.

Табл. 1. Коммерческие лабораторные биореакторы малого объема с мешалкой

Название Производитель Объем, л Тип перемешивания Ссылка

BIOSTAT® Cplus Sartorius staedium biotech 5, 10, 15, 20, 30 Мешалка (турбина Раштона, 6 лопастей) [35]

BIOSTAT® B Sartorius staedium biotech 1, 2, 5, 10 Мешалка (турбина Раштона, 3 лопасти) [36, 37]

BIOSTAT® Bplus Sartorius staedium biotech 1, 2, 5, 10 Мешалка (турбина Раштона, 2 лопасти) [5, 6, 38, 39]

Braun airlift fermen-tor (BIOSTAT® B-DCU II) Sartorius staedium biotech 2, 5 Мешалка (турбина Раштона), эрлифтный [37, 40]

Ambr®250 Sartorius staedium biotech 0.25 Мешалка (турбина Раш-тона, 2 лопасти) [41]

New Brunswick FS300, baffled fermenter® New Brunswick Scientific 3.5, 5, 7.5, 14, 20 Мешалка (турбина Раш-тона, 6 лопастей) [11]

BioFlo 3000 New Brunswick Scientific 1.6, 3.3, 6.6 Мешалка (турбина Раш-тона, 6 лопастей) [42]

New Brunswick BioFlo 110 Fermen-tor New Brunswick Scientific 1.3, 3, 7.5, 14 Мешалка (турбина Раш-тона, 2 лопасти) [27]

Multifors INFORS AG 0.25, 0.5, 0.75, 1 Мешалка (турбина Раш-тона, 2 лопасти) [43]

Ralf Plus-System Bioengineering inc. 2, 3.7, 5, 6.7 Мешалка (турбина Раш-тона, 6 лопастей) [44]

BIOTECH-3BG Shanghai BaoXing Bio-Engineering Equipment Co., Ltd 3, 5, 7 Мешалка (турбина Раш-тона, 6 лопастей) [45]

Continuous stirred tank reactors (CSTR) Nano-Mag Technologies Pvt. Ltd 1, 2, 5, 10, 20, 25 Мешалка (турбина Раш-тона, 6 лопастей) [46]

Подобная стандартная конструкция лабораторного биореактора ограничивает использование твердых субстратов, агрессивных или взрывоопасных сред, что сокращает область их применения. Поэтому целью данной работы являлась разработка альтернативных конструкций лабораторных биореакторов, основанных на пневматическом перемешивании, что является перспективным направлением инженерных исследований.

применимо для процесса термостатирования в реакционной емкости в режиме покоя.

В процессе моделирования термостатирования на верхней и внешней поверхностях использовалось граничное условие конвективного теплового потока, основанное на разнице температур между рабочей поверхностью (стеклянной стенкой царги и стальным основанием емкости) и окружающей атмосферой.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Численное моделирование процесса термостатирования

Моделирование теплопередачи в процессе тер-мостатирования жидкости в реакционной емкости ЛБ-1 в покое и при перемешивании необходимо для понимания особенностей работы разработанного погружного теплообменника. В неподвижном слое жидкости перенос тепла в реакционной емкости ЛБ-1 реализуется посредством свободной конвекции и теплопроводности. Теплопередача здесь рассчитывается по следующему уравнению сохранения энергии (1):

РСр дТ + рCpUVT + Vq = Q + Qp + Qvd, (1)

где р — плотность среды, кг/м3; Ср — удельная теплоемкость при постоянном давлении, Дж/(кг-К); Т — абсолютная температура, К; и — вектор скорости, м/с; q — тепловой поток посредством теплопроводности, Вт/м2; Q — источники тепла, отличные от вязкого рассеяния, Вт/м3; Qp — работа, совершаемая за счет изменения давления, Вт/м3; Qvd — вязкое рассеяние, Вт/м3.

Параметры Qp и Qvd определяются по следующим уравнениям (2, 3):

Q = а Т\др + uVp 0« = т: Vu,

(2) (3)

q = -^Т,

(4)

Модель Кейса - Кроуфорда

Для теоретических предсказаний турбулентного теплообмена в пограничных слоях и потоках в каналах знание турбулентного числа Прандтля РгТ имеет решающее значение. Для расчета данного критерия использовалась модель Кейса -Кроуфорда (5) [47]:

(

РгТ =

2Рг.

0.3С ц.

рГ-Т

0.3СрЦт ^

Лд/рт

—

л

( ( 1 - ехр

л

^Т1

0.3Ср^Тл/Р1Т

(5)

где ар — коэффициент термического расширения, К-1; т — тензор вязких напряжений, Па.

Для стационарной задачи теплопроводности (когда система находится в равновесии) уравнение скорости известно как закон Фурье и описывается как уравнение (4):

где число Прандтля в бесконечности РгТш = 0.85; X — проводимость.

Модель Кейса - Кроуфорда является относительно точной моделью для расчета РгТ с достаточной аппроксимацией для большинства видов турбулентных течений, ограниченных стенками, за исключением турбулентного течения жидких металлов [48].

Гидродинамическое моделирование течения жидкости и уравнения Навье - Стокса

Движение вязких жидких веществ можно описать некоторыми дифференциальными уравнениями в частных производных, называемыми уравнениями Навье - Стокса. Для движения несжимаемой вязкой жидкости с постоянной плотностью уравнение Навье - Стокса и совместное с ним уравнение непрерывности имеют вид (6):

ди

дt

рV•( и) = 0:

ди / т \

р— + р (и •V) и ^ -р1 + /и\Уи + ^и) )

+ F,

(6)

где к — коэффициент теплопроводности материала, Вт/(м-К). Уравнение (4) широко используется для квазиравновесных процессов, где важно распределение температуры в системе. Поэтому оно

где и — вектор скорости жидкой фазы, м/с; р1 — объемное напряжение; ц — динамическая вязкость жидкости, Па с; F — совокупность внешних сил, приложенных к жидкости.

1

X

X

Уравнения Навье - Стокса используются для описания физики многих явлений. Они широко применяются для решения инженерных задач, таких как течение воды в трубах и теплообменниках, обтекание тел различной геометрии, а также для научно-исследовательских целей (океанские течения, моделирование погоды, движение воздушных масс, движение жидкостей в биореакторах).

Для численного моделирования турбулентных течений использовались модель турбулентности k-s и уравнения RANS (Reynolds-Averaged Navier-Stokes), в основу которых положены уравнения Навье - Стокса, осредненные по Рейнольдсу. При этом масштаб пульсаций вычислялся как 0.038-^г, где dz — гидравлический диаметр, мм.

Объемный коэффициент массопередачи kLa

Объемный коэффициент массопередачи kLa [ч-1] является основной массообменной характеристикой биореакторов, отображающей скорость переноса кислорода через границу раздела фаз. Для определения kLa широко применяется метод вытеснения с последующей газацией ("gassing out") [49]. Данный метод предполагает удаление растворенного кислорода из жидкой фазы путем бар-ботирования азотом до тех пор, пока концентрация кислорода в жидкой фазе не достигнет нуля. Затем снова вводится воздух или кислород и измеряется изменение концентрации кислорода в жидкости с помощью полярографических или оптических электродов. Изменение концентрации кислорода в жидкости происходит до достижения равновесной концентрации согласно уравнению (7):

^ = kLa(C* - C), (7)

где kL — коэффициент массопередачи, отображающий скорость диффузии вещества на границе раздела фаз, м/с; a — удельная площадь раздела фаз, м /м ; С и С — равновесная и текущая концентрации растворенного кислорода, мг/л. Интегрирование уравнения (7) позволяет описать связь между концентрацией кислорода и временем, предполагая, что kL a остается постоянным (8):

ln (C* - C) = -kLat. (8)

Таким образом, график зависимости ln(C - C) от времени дает прямую линию, тангенс угла наклона которой равен (-kL a). Этот метод имеет преимущество перед химическим методом сульфитного окисления, т.к. может быть использован для ферментационной среды, в которой могут присутствовать мертвые клетки или мицелий в концентрации, равной той, которая образуется во время ферментации.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Конструкция биореактора с перколяционным перемешиванием

Одним из критериев выбора биореакторного оборудования для масштабирования процессов культивирования микроорганизмов, чувствительных к механическому повреждению, является отсутствие напряжений сдвига при перемешивании [43, 50]. На базе опытного производства Института биологического приборостроения РАН (ИБП РАН) был разработан способ реализации подобных процессов, а также макет лабораторного биореактора для их реализации [51-54]. Перемешивание здесь осуществляется за счет возвратного тока жидкой фазы между двумя вертикально закрепленными цилиндрическими емкостями под действием сжатого газа (воздуха). При этом насыщение питательной среды газами происходит в пленке жидкости на внутренней стенке емкостей и на поверхности твердотельных носителей, а также частично за счет барботажа. Данный способ перемешивания получил название перколяционного, поскольку в емкости может быть загружен твердый субстрат.

Таким образом, согласно классификации биореакторов по типу конструкции, лабораторный биореактор (1.5 л) с перколяционным перемешиванием является биореактором колонного типа, предназначенного для погруженного и твердофазного культивирования. Упрощенная схема биореактора с перколяционным перемешиванием представлена на рис. 1.

Биореактор ЛБ-1 состоит из реакционного блока, клапанного блока и станции управления. Детали и узлы реакционных емкостей были изготовлены из нержавеющей стали методами механической обработки. Сборка компонентов биореактора осуществлялась с помощью резьбового соединения с использованием уплотнительных колец. Данный тип соединения являлся предпочтительным, т.к. сварное соединение может проявлять повышенную склонность к образованию очагов коррозии в агрессивных условиях биотехнологического процесса [55, 56]. Уплотнительные кольца также использовались между стеклянной царгой и крышками емкостей для обеспечения герметичности реакционной зоны биореактора. Все материалы являются термически стабильными, что позволяет стерилизовать собранную биореакторную систему острым паром.

При разработке биореактора применялся принцип взаимозаменяемости, при котором элементы конструкции, изготовленные с определенной точностью геометрических параметров, способны выполнять заданные функции вне зависимости от времени и места их изготовления.

Рис. 1. Упрощенная схема лабораторного биореактора (1.5 л) с перколяционным перемешиванием. Ф1 — фильтр-осушитель; Рь Р2 — регулятор давления с манометром; МБР1, МБР2 — реакционная емкость; Н1, Н2 — насос мембранный; ПР — блок пневмораспределителей; ОГ — отходящие газы; К1, ..., К9 — клапаны пережимные нормально закрытые

Движение жидкой и газовой фаз регулируется клапанами пережимными нормально закрытыми К1-К9; направление потоков жидкости и газов указано черными и белыми треугольниками соответственно. Реакционные емкости МБР оснащены датчиками pH, pO2 и температуры; добавление титрантов или питательной среды в реакционную зону осуществляется за счет мембранных насосов-дозаторов с регулируемым объемом мембраны; работа клапанов регулируется 3-линейными 2-позиционными пневмораспределителями нормально закрытыми

Определение объемного коэффициента массопередачи kLa для ЛБ-1

Объемный коэффициент массопередачи kLa для лабораторного биореактора ЛБ-1 зависит от скорости перетока жидкой фазы между реакционными емкостями, регулируемой объемным расходом перемешивающего воздуха. Повысить данный показатель можно за счет добавления в систему принудительной аэрации жидкой фазы в протоке и использования твердотельных насадок (рис. 2).

Без использования дополнительных инструментов для увеличения массопереноса коэффициент kLa для ЛБ-1 составил 4.5 ±0.1 ч-1, что соответствует показателям для барботажной колонны с низким объемным расходом аэрирующего воз-

духа [57-59]. Добавление твердотельных насадок седловидной формы общей площадью 0.037 м2 в реакционную емкость способствовало повышению коэффициента массопередачи до 7.1 ±0.7 ч-1 (рис. 2). В свою очередь, принудительная аэрация жидкой фазы в протоке с помощью эжекторного разъема значительно меньше влияет на kLa по сравнению с насадками и достигает 6.0 ±0.1 ч-1. Следует также отметить, что в данном режиме работы наблюдается прямая зависимость коэффициента массопередачи от объемного расхода перемешивающего воздуха. Наибольшее значение kLa, которое составило 8.4 ±0.3 ч-1, было достигнуто при одновременном использовании твердотельных насадок и принудительной аэрации в режиме интенсивного перемешивания.

--О--- 40 л/ч —•— 50 л/ч • 60 л/ч

Рис. 2. Зависимость объемного коэффициента массопередачи кьс от условий перемешивания в лабораторном биореакторе ЛБ-1

Таким образом, лабораторный биореактор ЛБ-1 в своей базовой комплектации, являясь биореактором колонного типа, обеспечивает довольно низкий коэффициент массопередачи. Однако добавление в конструкцию дополнительных поверхностей или мембранных элементов, а также повышение скорости перемешивания и принудительная аэрация способствуют увеличению значений кЬс1. Следует отметить, что использование подвижной жидкой фазы и неподвижных твердотельных носителей характерно для пленочных биореакторов, широко применяемых для культивирования иммобилизованных культур [60-62].

Погружной теплообменник с жидкостным нагревом

Для обеспечения заданных условий культивирования реакционные емкости лабораторного биореактора ЛБ-1 оснащены теплообменниками погружного типа с жидкостным нагревом (рис. 3).

Как видно из рис. 3, погружной теплообменник представляет собой сборочный узел с разъемным соединением и возможностью промывки деталей отдельно.

Эффективная площадь теплообменной поверхности стакана составляет 35 ±0.5 см2, которая

а

б

Рис. 3. Модель теплообменника погружного типа с жидкостным нагревом. а — изометрическая проекция модели; б — сечение модели.

1 — стакан, 2 — корпус, 3 — удлинитель потока, 4 — входной штуцер, 5 — выходной штуцер, 6 — сливное отверстие, 7 — сливной штуцер. Стрелками отображено направление потока теплоносителя

может быть расширена до 63 ±0.5 см2 за счет добавления в конструкцию вставок. Предпочтительным вариантом монтажа погружного теплообменника является резьбовое соединение с основанием биореакторной емкости, что обеспечивает наибольшую площадь контакта теплообменной поверхности и жидкой фазы в реакционной зоне.

Для изучения поведения системы в процессе термостатирования было проведено численное моделирование теплопередачи в реакционной емкости ЛБ-1 в статическом режиме (рис. 4).

Число Рэлея для слоя воздуха над поверхностью жидкости составило 4.36-10-6, что соответствует ламинарному потоку, в котором теплопередача осуществляется за счет теплопроводности, а не конвекции. Поэтому коэффициент теплопередачи k (4), используемый при моделировании, был принят равным 2.5 Вт/(м2К), что соответствует тепловому сопротивлению в тонком слое воздуха при температуре 20 °С [63]. Из-за низких значений коэффициентов теплопередачи воздушной пленки на поверхности жидкой фазы большая часть тепла

поступает через эффективную поверхность погружного теплообменника.

Согласно результатам численного моделирования, в статичном режиме требуемая температура жидкой среды в 28 °С может быть достигнута в течение часа. Кроме того, следует отметить выраженный тепловой градиент, при котором разница температур в объеме реакционной емкости может достигать 3 °С (рис. 4, а). Данная неоднородность распределения тепла обусловлена наличием удлиненного штуцера, предназначенного для поддержания заданного уровня жидкости в реакционной емкости во время перемешивания (рис. 1, МБР1, магистраль К8).

Для проверки полученной модели были проведены лабораторные испытания, в ходе которых было определено изменение температуры в центре верхнего слоя модельной жидкости и в наименее нагретой области на входе в удлиненный штуцер (рис. 4, б). Полученные данные согласуются с результатами численного моделирования.

а

б

т|П: 28.0720

4000 Время, сек

Центр (измерение) -Центр (модель)

Вход а штуцер (измерение) — Вход в штуцер (модель)

Температура, С

Рис. 4. Модель процесса термостатирования с использованием погружного теплообменника в реакционной емкости лабораторного биореактора ЛБ-1 в статическом режиме.

а — профиль градиента температуры; б — изменение температуры модельной жидкости в центральной точке поверхностного слоя жидкости и на входе в удлиненный штуцер уровня.

Объем реакционной емкости 1.42 л; коэффициент заполнения 75%; в качестве модельной нагреваемой жидкости — вода (18 °С); области измерения температуры указаны метками; температура окружающей среды 20 °С; температура теплоносителя 31 °С; требуемая температура нагрева 28 °С; эффективная площадь поверхности теплообменника 62.3 см2; время нагрева 6000 с.

Измерение проводилось с помощью термометра сопротивления ДТС 214-Pt100.A3.4071 (ОВЕН®)

Время установления требуемой температуры нагреваемой жидкости в 28 °С для модели и лабораторного эксперимента в центральной точке поверхностного слоя составило 2380 ±354 с. Однако следует отметить, что для области на входе в штуцер уровня по достижении температуры 24 °С в условиях лабораторного эксперимента наблюдается замедление процесса нагревания, что может быть обусловлено влиянием окружающей среды. На внешней стороне стенок реакционной емкости образуется пленка конденсата из-за разности температур окружающего воздуха и нагреваемой жидкости, что не было учтено в модели. Время достижения требуемой температуры в данной области в условиях лабораторного эксперимента составило 3655 с против 2550 с для модели.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о достаточной эффективности разработанного погружного теплообменника. Данный рабочий узел может быть использован в составе ла-

бораторного биореактора ЛБ-1 при проведении биотехнологических процессов.

Паростерилизуемый разъем для асептического отбора проб

В биотехнологическом процессе с использованием биореакторов различного объема асептический отбор проб является залогом успеха проводимого эксперимента. Внесение посторонней микрофлоры в биореактор может привести не только к получению некорректных результатов, но и к контаминации рабочих поверхностей.

В лабораторных биореакторах объемом от 3 до 10 л асептический отбор проб осуществляется с помощью специальных портов, расположенных на стенке реакционной емкости [64]. К таким портам могут быть присоединены несколько пробоотборников, стерилизация которых проходит совместно со стерилизацией всей биореакторной установки [65].

а

б

о

глт

10

20

Биореактор

Пробоотборник

0.5 1 1.5 2

Скорость потока стерилизующей среды, м/с

Рис. 5. Стерилизуемый Т-образный разъем для асептического отбора пробы.

а — принципиальная схема узла асептического отбора проб; б — модель потока стерилизующей среды через Т-образный разъем.

1 — биореакторная емкость; 2 — стерилизуемый Т-образный разъем для асептического отбора проб; 3 — пробоотборник; 4 — источник стерилизующей среды; в качестве модельной стерилизующей среды принят пар (120 °С), объемный расход 60 л/ч; диаметр проходного сечения Т-образного стерилизуемого разъема 0 6 мм.

Поток стерилизующей среды (жидкость или пар) и жидкого образца регулируется клапанами К1-К3. Направление потоков жидкости/пара указано черными треугольниками; движение жидкой фазы осуществляется с помощью перистальтических насосов Н1 и Н2; в случае стерилизации острым паром насос Н2 не используется; гидродинамическое моделирование соответствует режиму стерилизации (клапан К1 закрыт)

Для лабораторных биореакторов малого объема (до 3 л) применяются выносные вакуумные пробоотборники [66] или линии герметичных емкостей [67]. Главным недостатком всех перечисленных выше способов отбора проб является невозможность повторной процедуры стерилизации.

В работе [68] данную проблему предлагается решить за счет использования стерилизуемого Т-образного разъема для подключения пробоотборника к биореакторной системе (рис. 5). Согласно предлагаемой схеме (рис. 5, а), к биореакторной емкости 1, через Т-образный разъем 2, подключается пробоотборник 3 и источник стерилизующей среды 4.

В режиме штатной работы биореактора все магистрали системы пробоотборника перекрыты клапанами К1-К3. Отбор пробы осуществляется в два этапа, на первом из которых производится предварительная стерилизация узла при открытых клапанах К2 и КЗ с помощью насоса Н2. После этого клапаны К2 и К3 закрываются, в то время как клапан К1 открывается для отбора образца с помощью насоса Н1. Преимуществом данной системы является возможность не только отбирать

пробы, но и осуществлять подпитку субстратом. Из недостатков следует отметить низкую эффективность стерилизации рабочих поверхностей из-за особенностей потока стерилизующей среды в канале Т-образного разъема (рис. 5, б). В соответствии с результатами гидродинамического моделирования несовершенство конструкции Т-образного разъема характеризуется снижением способности стерилизующей среды проникать в ответвления, расположенные под углом к проточной магистрали стерилизации, что провоцирует образование мертвых зон. При объемном расходе острого пара (120 °С) 60 л/ч минимальная скорость потока 1.3-10-6 м/с наблюдается в месте соединения Т-образного разъема и биореакторной емкости. Кроме того, в ответвлении пробоотборника наблюдается зона пониженной скорости, что может отразиться на эффективности стерилизации.

Использование крестообразного фитинга для подключения проточной вспомогательной магистрали, по которой подается стерилизующая среда, может значительно снизить риск контаминации реакционной среды (рис. 6, а).

а

б

Слив

Стерилизующая среда

0.5 1 1.5 2

Скорость потока стерилизующей среды, м/с

Рис. 6. Стерилизуемый крестообразный разъем для асептического отбора образцов.

а — принципиальная схема узла асептического отбора проб с использованием паростерилизуемого крестообразного разъема; б — модель потока стерилизующей среды через крестообразный разъем.

1 — биореакторная емкость; 2 — стерилизуемый крестообразный разъем для асептического отбора проб; 3 — пробоотборник; 4 — источник стерилизующей среды; в качестве модельной стерилизующей среды принят пар (120 °С), объемный расход 60 л/ч; диаметр проходного сечения крестообразного разъема 0 6 мм. Поток стерилизующей среды (жидкость или пар) и жидкого образца регулируется клапанами К1-К4. Направление потоков жидкости/пара указано черными треугольниками. Движение жидкой фазы осуществляется с помощью перистальтических насосов Н1 и Н2. В случае стерилизации острым паром насос Н2 не используется; гидродинамическое моделирование соответствует режиму стерилизации (клапаны К1 и К2 закрыты)

Согласно предлагаемой схеме (рис. 6, а), к биореакторной емкости 1, через крестообразный разъем 2, подключается пробоотборник 3 и источник стерилизующей среды 4. В режиме штатной работы биореактора все магистрали системы пробоотборника перекрыты клапанами К1-К4. Отбор пробы осуществляется в два этапа, на первом из которых производится предварительная стерилизация узла при открытых клапанах К3 и К4 с помощью насоса Н2. После этого клапаны КЗ и К4 закрываются, в то время как клапаны К1 и К2 открываются для отбора образца с помощью насоса Н1. Следует отметить, что, в отличие от системы с Т-образным разъемом (рис. 5, а), в данной системе емкость для отбора проб присоединяется до начала процедуры стерилизации, что значительно снижает риск контаминации. Тем не менее, как и в случае с Т-образным разъемом (рис. 5, б), крестообразный разъем является неэффективным, т.к. присутствуют зоны нулевой скорости жидкой фазы (5.810-6 м/с).

Для решения данной проблемы был разработан стерилизуемый крестообразный разъем особого сечения, который обеспечивает увеличение проникающей способности стерилизующей среды (рис. 7) [69].

Данный подход подразумевает наличие перегородки внутри крестовины, которая перенаправляет поток в сторону вспомогательной стерилизующей магистрали (рис. 7, а). Согласно результатам гидродинамического моделирования, максимальная скорость стерилизующей среды наблюдается в области поворота потока в каналы основной магистрали и составляет 4.9 м/с, что в два раза больше, чем для Т-образного и крестообразного разъема (рис. 5, б, и 6, б). Данная особенность объясняется двукратным уменьшением диаметра проходного сечения с 6 мм до 3.2 мм. Следует отметить, что область минимальной скорости (7.2-10"4 м/с) расположена в середине перегородки на оси входного потока. Аналогичная конусообразная область наблюдается на противоположной стороне перегородки. Поскольку движение стерилизующей среды в них снижено, данные области составляют "паразитный" объем. За счет того, что крестообразный разъем с перегородкой изготавливается из прокатной нержавеющей стали круглого сечения методами механической обработки, данный объем был замещен конструктивным элементом (рис. 8).

а б

среда

Биореэктор Пробоотборник ь

Рис. 7. Крестообразный разъем с перегородкой для асептического отбора образцов. а — продольное сечение; б — модель потока стерилизующей среды.

1 — корпус; 2 — штуцер основной магистрали (от биореактора к пробоотборнику); 3 — каналы основной магистрали; 4 — каналы вспомогательной стерилизующей магистрали; 5 — направляющая перегородка. Модельная стерилизующая среда — пар (120 °С), объемный расход 60 л/ч.

Диаметры: проходного сечения стерилизующей магистрали 0 6 мм, рабочей магистрали 0 6 мм, направляющих магистралей, разделенных перегородкой, 0 3.2 мм. Гидродинамическое моделирование соответствует режиму стерилизации (рис. 6, а, клапаны К1 и К2 закрыты)

а

б

Стерилизующая среда

Пробоотборник 5

О тгИ

•5 •10

•20

0 тт

20

0.5

1.5 2 2.5 3 3.5 4 Скорость потока стерилизующей среды, м/с

4.5

Рис. 8. Модифицированный крестообразный разъем с перегородкой для асептического отбора образцов. а — продольное сечение; б — модель потока стерилизующей среды.

1 — корпус; 2 — штуцер основной магистрали (от биореактора к пробоотборнику); 3 — каналы основной магистрали; 4 — каналы вспомогательной стерилизующей магистрали; 5 — направляющая перегородка; 6 — трапециевидный делитель потока.

Модельная стерилизующая среда — пар (120 °С), объемный расход 60 л/ч.

Диаметры: проходного сечения стерилизующей магистрали 0 6 мм, рабочей магистрали 0 6 мм, направляющих магистралей, разделенных перегородкой, 0 3.2 мм. Гидродинамическое моделирование соответствует режиму стерилизации (рис. 6, а, клапаны К1 и К2 закрыты)

Трапециевидный элемент расположен в середине направляющей перегородки и выполняет функцию делителя входного потока стерилизующей среды и его равномерное распределение в каналы основной магистрали. При этом минимальная скорость потока составляет 0.001 м/с и наблюдается на площадке делителя (рис. 8, б). Следует также отметить, что добавление данного конструктивного элемента в просвет каналов основной магистрали не влияет на профиль скоростей потока стерилизующей среды.

Как упоминалось выше, данный разъем может быть использован не только для отбора проб, но и для добавления питательных сред и титрантов в реакционную емкость биореактора. Для определения влияния трапециевидного делителя на профиль скоростей потока жидкой фазы в режиме подпитки субстратом было проведено гидродинамическое моделирование (Приложение, рис. П).

Согласно результатам гидродинамического моделирования, глубина проникновения жидкой фазы в ответвление вспомогательной стерилизующей магистрали для разъема с трапециевидным делителем больше, чем для разъема с гладкой перегородкой (Приложение, рис. П). Максимальная скорость потока жидкой фазы при прохождении данного конструктивного элемента составляет 1.37-10-5 м/с, что в 1.4 раза больше, чем для гладкого канала (9.18-10 м/с). Можно сделать вывод, что использование крестообразного разъема с трапециевидным делителем при работе основной ма-

гистрали способствует уменьшению объема застойной зоны, образующейся во вспомогательной стерилизующей магистрали.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе был разработан лабораторный биореактор малого объема ЛБ-1 (1.5 л) с перколя-ционным перемешиванием. Такой тип перемешивания обеспечивает насыщение питательной среды газами, главным образом в пленке жидкости на внутренней поверхности емкостей, а также частично за счет барботажа. Каждый единичный объем перемешиваемой жидкости проходит критические точки турбулентности в соединительной магистрали, что обеспечивает высокую степень гомогенности среды без образования срезающих напряжений, характерных для турбинных и лопастных мешалок. Поэтому данный подход применим при культивировании микроорганизмов, чувствительных к механическому воздействию, а также для иммобилизованных омываемых культур.

Сборка представленного биореактора осуществляется с помощью разъемного резьбового соединения, что позволяет использовать набор необходимых деталей и узлов для выполнения конкретной биотехнологической задачи в научно-практических и образовательных целях, а также дает возможность мобильной замены или добавления элементов конструкции при сохранении текущего функционального уровня.

б

20

6 А

Длина путч, мм

Скорость потока жидкой фазы, н1с 2 _ 3 4

Рис. П. Гидродинамическое моделирование течения жидкой фазы через крестообразный стерилизуемый разъем с перегородкой в режиме подпитки субстратом.

а — разъем с гладкой перегородкой; б — разъем с перегородкой и трапециевидным делителем потока. Профили скоростей жидкой фазы соответствуют сечениям входного потока на расстоянии +4 мм от оси штуцера основной магистрали до плоскости входного отверстия вспомогательной стерилизующей магистрали с шагом в 1 мм. Модельная жидкая фаза — вода (20 °С), объемный расход 10 мл/мин. Гидродинамическое моделирование соответствует режиму отбора проб/подпитки субстратом (рис. 6, а, клапаны К3 и К4 закрыты)

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Alvarado-Gutiérrez M.L., Ruiz-Ordaz N., Galíndez-Mayer J., Santoyo-Tepole F., Curiel-Quesada E., García-Mena J., Ahuatzi-Chacón D. Kinetics of carbendazim degradation in a horizontal tubular biofilm reactor // Biopro-cess Biosyst. Eng. 2017. Vol. 40, no. 4. P. 519-528. DOI: 10.1007/s00449-016-1717-3

2. Yang Y., Zhang L., Cheng J., Zhang S., Li B., Peng Y. Achieve efficient nitrogen removal from real sewage in a plug-flow integrated fixed-film activated sludge (IFAS) reactor via partial nitritation/anammox pathway // Biore-sour. Technol. 2017. Vol. 239. P. 294-301. DOI: 10.1016/j.biortech.2017.05.041

3. Guilherme E.С.X., de Oliveira J.С., de Carvalho L.M., Brandi I.V., Santos S.H.S., de Carvalho G.G.С., Cota J., Mara Aparecida de Carvalho B. Synthesis of superma-croporous cryogel for bioreactors continuous starch hydrolysis // Electrophoresis. 2017. Vol. 38, no. 22-23. P. 2940-2946. DOI: 10.1002/elps.201700208

4. Zhang C., Li J., Wang J., Song X., Zhang J., Wu S., Hu C., Gong Z., Jia L. Antihyperlipidaemic and hepatoprotective activities of acidic and enzymatic hydrolysis exopolysac-charides from Pleurotus eryngii SI-04: 1 // BMC Complement. Altern. Med. 2017. Vol. 17, no. 1. Id. 403. DOI: 10.1186/s12906-017-1892-z

5. Frensing T., Heldt F.S., Pflugmacher A., Behrendt I., Jordan I., Flockerzi D., Genzel Y., Reichl U. Continuous influenza virus production in cell culture shows a periodic accumulation of defective interfering particles // PLoS ONE. 2013. Vol. 8, no. 9. Id. e72288. DOI: 10.1371/journal.pone.0072288

6. Tapia F., Jordan I., Genzel Y., Reichl U. Efficient and stable production of Modified Vaccinia Ankara virus in two-stage semi-continuous and in continuous stirred tank cultivation systems // PLoS ONE. 2017. Vol. 12, no. 8. Id. e0182553. DOI: 10.1371/journal.pone.0182553

7. Wu H.-C., Hu Y.-C., Bentley W.E. Tubular bioreactor for probing baculovirus infection and protein production // Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 2016. Vol. 1350. P. 461-467. DOI: 10.1007/978-1-4939-3043-2_23

8. Xu С., Clark C., Ryder T., Sparks C., Zhou J., Wang M., Russell R., Scott C. Characterization of TAP Ambr 250 disposable bioreactors, as a reliable scale-down model for biologics process development // Biotechnol. Prog. 2017. Vol. 33, no 2. P. 478-489. DOI: 10.1002/btpr.2417

9. Oncel S., Kose A. Comparison of tubular and panel type photobioreactors for biohydrogen production utilizing Chlamydomonas reinhardtii considering mixing time and light intensity // Bioresour. Technol. 2014. Vol. 151. P. 265-270. DOI: 10.1016/j.biortech.2013.10.076

10. Cantera S., Muñoz R., Lebrero R., López J.C., Rodríguez Y., García-Encina СЛ. Technologies for the bioconversion of methane into more valuable products // Curr. Opin. Biotechnol. 2018. Vol. 50. P. 128-135. DOI: 10.1016/j.copbio.2017.12.021

11. Galvagno M.A., Iannone L.J., Bianchi J., Kronberg F., Rost E., Carstens M.R., Cerrutti С. Optimization of bio-

mass production of a mutant of Yarrowia lipolytica with an increased lipase activity using raw glycerol // Rev. Argent. Microbiol. 2011. Vol. 43, no. 3. P. 218-225. DOI: 10.1590/S0325-75412011000300010

12. Raza Z.A., Tariq M.R., MajeedM.I, Banat I.M. Recent developments in bioreactor scale production of bacterial poly-hydroxyalkanoates // Bioprocess Biosyst. Eng. 2019. Vol. 42, no. 6. P. 901-919. DOI: 10.1007/s00449-019-02093-x

13. Asih D.R., Alam M.Z., Alam Z., Salleh M.N., Salleh N., Salihu A. Pilot-scale production of lipase using palm oil mill effluent as a basal medium and its immobilization by selected materials // J. Oleo Sci. 2014. Vol. 63, no. 8. P. 779-785. DOI: 10.5650/jos.ess13187

14. Zhong J.-J. Bioreactor Engineering // Comprehensive Biotechnology (Third Edition) / ed. M. Moo-Young. Oxford: Pergamon, 2019. P. 257-269. DOI: 10.1016/B978-0-444-64046-8.00077-X

15. Shanmugam M.K., Mandari V., Devarai S.K., Gummadi S.N. Types of bioreactors and important design considerations // Current Developments in Biotechnology and Bioengineering / ed. R. Sirohi et al. Elsevier, 2022. P. 3-30. DOI: 10.1016/B978-0-323-91167-2.00008-3

16. De la Fuente Salcido N.M., Andrade A.M.A. Challenges of fermentation engineering // Advances in food bioproducts and bioprocessing technologies. CRC Press, 2019. Ch. 11. P. 233-264. DOI: 10.1201/9780429331817-11

17. Tikhomirova T.S., Taraskevich M.S., Ponomarenko O.V. The role of laboratory-scale bioreactors at the semi-continuous and continuous microbiological and biotech-nological processes // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2018. Vol. 102, no. 17. P. 7293-7308. DOI: 10.1007/s00253-018-9194-z

18. Arrojo B., Mosquera-Corral A., Campos J.L., Méndez R. Effects of mechanical stress on Anammox granules in a sequencing batch reactor (SBR) // J. Biotechnol. 2006. Vol. 123, no. 4. P. 453-463. DOI: 10.1016/j.jbiotec.2005.12.023

19. Cantera S., Sánchez-Andrea I., Lebrero R., García-Encina P.A., Stams A.J.M., Muñoz R. Multi-production of high added market value metabolites from diluted methane emissions via methanotrophic extremophiles // Bio-resour. Technol. 2018. Vol. 267. P. 401-407. DOI: 10.1016/j.biortech.2018.07.057

20. Kumar R.N., Vinod A.V. Oxygen mass transfer in bubble column bioreactor // Period. Polytech. Chem. Eng. 2014. Vol. 58, no. 1. P. 21-30. DOI: 10.3311/PPch.7122

21. Doig S.D., Ortiz-Ochoa K., Ward J.M., Baganz F. Characterization of oxygen transfer in miniature and lab-scale bubble column bioreactors and comparison of microbial growth performance based on constant k(L)a // Biotechnol. Prog. 2005. Vol. 21, no. 4. P. 1175-1182. DOI: 10.1021/bp050064j

22. Chaumat H., Billet-Duquenne A.M., Augier F., Mathieu C., Delmas H. Mass transfer in bubble column for industrial conditions - effects of organic medium, gas and liquid flow rates and column design // Chem. Eng. Sci. 2005. Vol. 60, no. 22. P. 5930-5936. DOI: 10.1016/j.ces.2005.04.026

23. Liu B., Zheng Y., Cheng R., Xu Z., Wang M., Jin Z. Experimental study on gas-liquid dispersion and mass transfer in shear-thinning system with coaxial mixer // Chin. J. Chem. Eng. 2018. Vol. 26, no. 9. P. 1785-1791. DOI: 10.1016/j.cjche.2018.02.009

24. Aroniada M., Maina S., Koutinas A., Kookos I.K. Estimation of volumetric mass transfer coefficient (kLa) - Review of classical approaches and contribution of a novel methodology // Biochem. Eng. J. 2020. Vol. 155. Id. 107458. DOI: 10.1016/j.bej.2019.107458

25. Yawalkar A.A., Heesink A.B.M., Versteeg G.F., Pangar-kar V.G. Gas-liquid mass transfer coefficient in stirred tank reactors // Can. J. Chem. Eng. 2002. Vol. 80, no. 5. P. 840-848. DOI: 10.1002/cjce.5450800507

26. Xu S., Gavin J., Jiang R., Chen H. Bioreactor productivity and media cost comparison for different intensified cell culture processes // Biotechnol. Prog. 2017. Vol. 33, no. 4. P. 867-878. DOI: 10.1002/btpr.2415

27. Rioseras B., López-García M.T., Yagüe C., Sánchez J., Manteca A. Mycelium differentiation and development of Streptomyces coelicolor in lab-scale bioreactors: programmed cell death, differentiation, and lysis are closely linked to undecylprodigiosin and actinorhodin production // Bioresour. Technol. 2014. Vol. 151. P. 191-198. DOI: 10.1016/j.biortech.2013.10.068

28. Steger F., Rachbauer L., Windhagauer M., Montgomery L.F.R., Bochmann G. Optimisation of continuous gas fermentation by immobilisation of acetate-producing Ace-tobacterium woodii // Anaerobe. 2017. Vol. 46. P. 96103. DOI: 10.1016/j.anaerobe.2017.06.010

29. Brand E., Junne S., Anane E., Cruz-Bournazou M.N., Neubauer C. Importance of the cultivation history for the response of Escherichia coli to oscillations in scale-down experiments // Bioprocess Biosyst. Eng. 2018. Vol. 41, no. 9. P. 1305-1313. DOI: 10.1007/s00449-018-1958-4

30. Sandner V., Pybus L.C., McCreath G., Glassey J. Scale-down model development in ambrTM systems: An industrial perspective // Biotechnol. J. 2018. Vol. 14, no. 4. DOI: 10.1002/biot.201700766

31. Jonczyk C., Takenberg M., Hartwig S., Beutel S., Berger R.G., Scheper T. Cultivation of shear stress sensitive microorganisms in disposable bag reactor systems // J. Biotechnol. 2013. Vol. 167, no. 4. P. 370-376. DOI: 10.1016/j.jbiotec.2013.07.018

32. Michels M.H.A., van der Goot A.J., Vermue M.H., Wijf-fels R.H. Cultivation of shear stress sensitive and tolerant microalgal species in a tubular photobioreactor equipped with a centrifugal pump // J. Appl. Phycol. 2016. Vol. 28, no. 1. P. 53-62. DOI: 10.1007/s10811-015-0559-8

33. Verkholaz Y., Lavrov C., Guseva E., Menshutina N., Bou-drant J. Simulations of hydrodynamic stress in stirred-tank bioreactors using CFD technology // Computer Aided Chemical Engineering / eds. E.N. Pistikopoulos, M.C. Georgiadis, A.C. Kokossis. Elsevier, 2011. Vol. 29. P. 1451-1454. DOI: 10.1016/B978-0-444-54298-4.50069-6

34. Merchuk J.C. Shear effects on suspended cells // Bioreac-tor Systems and Effects. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 1991. Vol. 44. P. 65-95. DOI: 10.1007/BFb0000748

35. Fazenda M.L., Harvey L.M., McNeil B. Effects of dissolved oxygen on fungal morphology and process rheolo-

gy during fed-batch processing of Ganoderma lucidum // J. Microbiol. Biotechnol. 2010. Vol. 20, no 4. P. 844-851. DOI: 10.4014/jmb.0911.11020

36. Zheng Y.-X., Wang Y.-L., Pan J., Zhang J.-R., Dai Y., Chen K.-Y. Semi-continuous production of high-activity pectinases by immobilized Rhizopus oryzae using tobacco wastewater as substrate and their utilization in the hydrolysis of pectin-containing lignocellulosic biomass at high solid content // Bioresour. Technol. 2017. Vol. 241. P. 1138-1144. DOI: 10.1016/j.biortech.2017.06.066

37. Orr D, Zheng W, Campbell B.S., McDougall B.M, Se-viour R.J. Culture conditions affect the chemical composition of the exopolysaccharide synthesized by the fungus Aureobasidium pullulans // J. Appl. Microbiol. 2009. Vol. 107, no. 2. P. 691-698. DOI: 10.1111/j.1365-2672.2009.04247.x

38. Timoumi A., Bideaux C., Guillouet S.E., Allouche Y., Mo-lina-Jouve C., Fillaudeau L., Gorret N. Influence of oxygen availability on the metabolism and morphology of Yarrowia lipolytica: insights into the impact of glucose levels on dimorphism // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2017. Vol. 101, no. 19. P. 7317-7333. DOI: 10.1007/s00253-017-8446-7

39. Timoumi A., Cleret M., Bideaux C., Guillouet S.E., Allouche Y., Molina-Jouve C., Fillaudeau L., Gorret N. Dynamic behavior of Yarrowia lipolytica in response to pH perturbations: dependence of the stress response on the culture mode // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2017. Vol. 101, no. 1. P. 351-366. DOI: 10.1007/s00253-016-7856-2

40. Cobas M., Danko A.S., Pazos M., Sanroman M.A. Removal of metal and organic pollutants from wastewater by a sequential selective technique // Bioresour. Technol. 2016. Vol. 213. P. 2-10.

DOI: 10.1016/j.biortech.2016.02.036

41. Moore R.L.L., Worrallo M.J., Mitchell C.D., Harriman J., Glen K.E., Thomas R.J. Immobilisation of Delta-like 1 li-gand for the scalable and controlled manufacture of hema-topoietic progenitor cells in a stirred bioreactor // BMC Biotechnol. 2017. Vol. 17, iss. 1. Art. 65. DOI: 10.1186/s12896-017-0383-0

42. Nitsche B.M., J0rgensen T.R., Akeroyd M., Meyer V., Ram A.F. The carbon starvation response of Aspergillus niger during submerged cultivation: Insights from the transcriptome and secretome // BMC Genomics. 2012. Vol. 13. Art. 380. DOI: 10.1186/1471-2164-13-380

43. Jost B., Holz M., Aurich A., Barth G., Bley T., Müller R.A. The influence of oxygen limitation for the production of succinic acid with recombinant strains of Yarrowia lipolytica // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2015. Vol. 99, no. 4. P. 1675-1686. DOI: 10.1007/s00253-014-6252-z

44. Bellou S., Makri A., Triantaphyllidou I.-E., Papaniko-laou S., Aggelis G. Morphological and metabolic shifts of Yarrowia lipolytica induced by alteration of the dissolved oxygen concentration in the growth environment // Mi-crobiol. Read. Engl. 2014. Vol. 160, no. 4. P. 807-817. DOI: 10.1099/mic.0.074302-0

45. Chen C.-C., Zha X.-H., Zheng C. Construction of fibrous bed bioreactor for enhanced succinic acid production using wastewater of dextran fermentation // Bioprocess

76

Т. С. ТИХОМИРОВА, Ю. А. ЛЕПЕХИН, М. Р. ТАРАСКЕВИЧ

Biosyst. Eng. 2017. Vol. 40, no. 12. P. 1859-1866. DOI: 10.1007/s00449-017-1839-2

46. Zhao L., Cao G.-L., Sheng Т., Ren H.-Y., Wang A.-J., Zhang J., Zhong Y.-J., Ren N.-Q. Bio-immobilization of dark fermentative bacteria for enhancing continuous hydrogen production from cornstalk hydrolysate // Biore-sour. Techno 1. 2017. Vol. 243. P. 548-555. DOI: 10.1016/j.biortech.2017.06.161

47. Kays W.M., Crawford M.E. Convective heat and mass transfer. 3rd ed. NY, USA, McGraw-Hill Science, 1993. 480 p.

48. Kavs W.M. Turbulent Prandtl number. Where are we? // ASME J. Heat Transf. 1994. Vol. 116, iss. 2. P. 284-295. DOI: 10.1115/1.2911398

49. Cerri M.O., Esperanqa M.N., Badino A.C., de Arruda Ri-beiro M.P. A new approach for kLa determination by gassing-out method in pneumatic bioreactors // J. Chem. Technol. Biotechnol. 2016. Vol. 91, no. 12. P. 3061-3069. DOI: 10.1002/jctb.4937

50. Dos Santos M.C., Cerri M.O., Bicas J.L. Relation of shear stress and kLa on bikaverin production by Fusarium oxysporum CCT7620 in a bioreactor // Bioprocess Biosyst. Eng. 2022. Vol. 45, no. 4. P. 733-740. DOI: 10.1007/s00449-022-02693-0

51. Редикульцев Ю.В., Зиновьев M.A., Кудряшов В.К., Малышев P.M., Наумов В.Н., Уграицкий А.А. Аппарат для культивирования клеток и микроорганизмов. Патент RU106899U1. 07.27.2011. URL: https://yandex.ru/patents/doc/RU 106899U1 _20110727

52. Редикульцев Ю.В., Кудряшов В.К, Зиновьев М.А., Уг-раицкий А.А., Голиченков B.C., Безручко В.В., Сизов А.Н., Шевелев Д.А., Семенович Е.А., Тараскевич М.Р. Аппарат для совмещенного культивирования микроорганизмов. Патент RU93394U1. 04.27.2010. URL: https://yandex.ru/patents/doc/RU93394U 1 _20100427

53. Редикульцев Ю.В., Ширшиков Н.В., Гаврилов А.Б., Хо-даков Е.В. Способ реализации ферментационных процессов и аппарат для его осуществления. Патент RU2596924C1. 09.10.2016. URL: https://yandex.ru/patents/doc/RU2596924C 1 20160910

54. Редикульцев Ю.В., Зиновьев М.А., Коньков М.А., Кудряшов В.К, Малышев P.M., Наумов В.Н., Тараскевич М.Р., Уграицкий А.А. Установка для совмещенного культивирования микроорганизмов. Патент RU102618U1. 03.10.2011. URL: https://yandex.ru/patents/doc/RU 102618U1 _20110310

55. Borba А.P., de Souza J., Haupt W., de Oliveira de Sou-zaF.R., Sporket F., Rossini E.G., Re is B. P. Microstructur-al analysis of corrosion of welded joints in stainless steel used in manufacture of bioreactors // IJRES. 2016. Vol. 4, iss. 12. P. 37-48. DOI: 10.6084/m9.figsharc. 12317492

56. Yan M., Wei В., Xu J., Li Y, Ни Y., Cai Z, Sun C. Insight into sulfate-reducing bacteria corrosion behavior of X80

pipeline steel welded joint in a soil solution // J. Mater. Res. Technol. 2023. Vol. 24. P. 5839-5863. DOI: 10.1016/j.jmrt.2023.04.163

57. Kadic E., Heindel T.J. Bubble Column Bioreactors // An introduction to bioreactor hydrodynamics and gas-liquid mass transfer. John Wiley & Sons, Ltd, 2014. P. 124-167. DOI: 10.1002/9781118869703

58. Liibbert A. Bubble Column Bioreactors // Bioreaction engineering: modeling and control / ed. K. Schugerl. K.-II. Bellgardt. Berlin, Heidelberg: Springer, 2000. P. 247-273. DOI: 10.1007/978-3-642-59735-0 9

59. Khalil A., Rosso D., DeGroot C.T. Effects of flow velocity and bubble size distribution on oxygen mass transfer in bubble column reactors - A critical evaluation of the computational fluid dynamics-population balance model // Water Environ. Res. 2021. Vol. 93, no. 10. P. 2274-2297. DOI: 10.1002/wer.l604

60. Mahdinia E.. Demirci A., Berenjian A. Biofilm reactors as a promising method for vitamin К (menaquinone-7) production // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2019. Vol. 103, no. 14. P. 5583-5592. DOI: 10.1007/s00253-019-09913-w

61. Ни G., Zhai M., Niu R., Xu X, Liu Q., Jia J. Optimization of culture condition for ganoderic acid production in Ga-noderma lucidum liquid static culture and design of a suitable bioreactor // Molecules. 2018. Vol. 23, no. 10. Id. 2563. DOI: 10.3390/molecules23102563

62. Qureshi N., Annous B.A., Ezeji T.C., Karcher C., Mad-dox I.S. Biofilm reactors for industrial bioconversion processes: employing potential of enhanced reaction rates // Microb. Cell Factories. 2005. Vol. 4, no. 1. Id. 24. DOI: 10.1186/1475-2859-4-24

63. Kosky C., Balmer R., Keat W., Wise G. Mechanical Engineering // Exploring Engineering (Third Edition) / ed. C. Kosky et al. Boston, Academic Press, 2013. Ch. 12. P. 259-281. DOI: 10.1016/B978-0-12-415891-7.00012-1

64. Goodwin M.E. Sampling ports and related container systems. Патент EP1837640B1. 07.01.2020. URL: https://patents.google.com/patent/EP1837640Bl/en

65. Goodwin M.E., Larsen J.K. Tube port and associated container system. Патент JP5265345B2. 08.14.2013.

66. Wang Y., Qin W., Liang Y, Chen Y, Jiang Y. Sampling device of fermentation tank. Патент CN211713089U. 10.20.2020.

67. Lee C.B., Giroux D. Automatable aseptic sample withdrawal system. Патент US8281672B2. 10.09.2012. URL: https://patents.google.com/patent/US8281672B2/en

68. Qian J., Huang G., Wan Z., Gao Y., Xia, Yang S., Wang C., Zhao Y. Sampling port and harvesting port connector for bioreactor. Патент CN203200260U. 09.18.2013.

Вы можете получать по электронной почте уведомления о выходе номера журнала «Научное приборостроение», заполнив форму «Электронная рассылка» на странице http://www.iairas.ru/magazine.php

Доступ к полным текстам статей - бесплатный.

НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2024, том 34, № 1

ISSN 0868-5886

NAUCHNOE PRIBOROSTROENIE, 2024, Vol. 34, No. 1, pp. 62-80

69. Пономаренко О.В., Лепехин Ю.А., Тихомирова Т.С. Фитинг стерилизуемый для гибких трубок. Патент RU2788265C1. 01.17.2023. URL: https://yandex.ru/patents/doc/RU2788265C1_20230117

Федеральный исследовательский центр "Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук", Институт биологического приборостроения с опытным производством РАН, г. Пущино

Контакты: Тихомирова Татьяна Сергеевна, tts05@mail.ru

Материал поступил в редакцию 08.09.2023

A PERCOLATION LAB-SCALE BIOREACTOR SYSTEM LB-1 FOR CULTIVATION OF MICROORGANISMS SENSITIVE TO MECHANICAL DAMAGES

T. S. Tikhomirova, Y. A. Lepekhin, M. S. Taraskevich

Institute for Biological Instrumentation of the Russian Academy of Sciences,

Federal Research Center "Pushchino Scientific Center for Biological Research of the RAS",

Pushchino, Moscow Region, Russia

Lab-scale bioreactors are convenient and efficient equipment for various biotechnological processes. The main purpose of their application is an in-depth study of the properties of processes occurring under controlled conditions, as well as their further optimization and scaling. In this paper, we propose the lab-scale bioreactor (1.5 L), in which mixing is carried out due to a bidirectional flow of liquid between two cylindrical vessels due to compressed gases (percolation). Saturation of liquid media here is performed both in a thin layer of liquid on the surface of vessels and solid carriers. The mass transfer characteristics made it possible to qualify LB-1 as a column film bioreactor, which can be used for cultivating both microorganisms sensitive to mechanical damage and immobilized washed cultures (biofilms). In addition, an immersion heat exchanger and a steam steriliz-able X-shaped connector were developed, the features of which were revealed using numerical simulation of the temperature control process and computational fluid dynamics.

Keywords: lab-scale bioreactor, column bioreactor, scaling, biotechnological process, percolation

REFERENСES

1. Alvarado-Gutiérrez M.L., Ruiz-Ordaz N., Galíndez-Mayer J., Santoyo-Tepole F., Curiel-Quesada E., García-Mena J., Ahuatzi-Chacón D. Kinetics of carbendazim degradation in a horizontal tubular biofilm reactor. Biopro-cess Biosyst. Eng., 2017, vol. 40, no. 4, pp. 519-528. DOI: 10.1007/s00449-016-1717-3

2. Yang Y., Zhang L., Cheng J., Zhang S., Li B., Peng Y. Achieve efficient nitrogen removal from real sewage in a plug-flow integrated fixed-film activated sludge (IFAS)

reactor via partial nitritation/anammox pathway. Biore-sour. Technol, 2017, vol. 239, pp. 294-301. DOI: 10.1016/j.biortech.2017.05.041

3. Guilherme E.C.X., de Oliveira J.C., de Carvalho L.M., Brandi I.V., Santos S.H.S., de Carvalho G.G.C., Cota J., Mara Aparecida de Carvalho B. Synthesis of supermacro-porous cryogel for bioreactors continuous starch hydrolysis. Electrophoresis, 2017, vol. 38, no. 22-23, pp. 29402946. DOI: 10.1002/elps.201700208

4. Zhang C., Li J., Wang J., Song X., Zhang J., Wu S., Hu C., Gong Z., Jia L. Antihyperlipidaemic and hepato-

protective activities of acidic and enzymatic hydrolysis exopolysaccharides from Pleurotus eryngii SI-04: 1. BMC Complement. Altern. Med., 2017, vol. 17, no. 1, id. 403. DOI: 10.1186/s12906-017-1892-z

5. Frensing T., Heidt F.S., Pflugmacher A., Behrendt I., Jordan I., Flockerzi D., Genzel Y., Reichl U. Continuous influenza virus production in cell culture shows a periodic accumulation of defective interfering particles. PLoS ONE, 2013, vol. 8, no. 9, id. e72288. DOI: 10.1371/journal.pone.0072288

6. Tapia F., Jordan I., Genzel Y., Reichl U. Efficient and stable production of Modified Vaccinia Ankara virus in two-stage semi-continuous and in continuous stirred tank cultivation systems. PLoS ONE, 2017, vol. 12, no. 8, id. e0182553. DOI: 10.1371/journal.pone.0182553

7. Wu H.C., Hu Y.C., Bentley W.E. Tubular bioreactor for probing baculovirus infection and protein production. Methods Mol. Biol. Clifton NJ, 2016, vol. 1350, pp. 461-467. DOI: 10.1007/978-1-4939-3043-2_23

8. Xu C., Clark C., Ryder T., Sparks C., Zhou J., Wang M., Russell R., Scott C. Characterization of TAP Ambr 250 disposable bioreactors, as a reliable scale-down model for biologics process development. Biotechnol. Prog., 2017, vol. 33, no. 2, pp. 478-489. DOI: 10.1002/btpr.2417

9. Oncel S., Kose A. Comparison of tubular and panel type photobioreactors for biohydrogen production utilizing Chlamydomonas reinhardtii considering mixing time and light intensity. Bioresour. Technol., 2014, vol. 151, pp. 265-270. DOI: 10.1016/j.biortech.2013.10.076

10. Cantera S., Muñoz R., Lebrero R., López J.C., Rodríguez Y., García-Encina C.A. Technologies for the bioconversion of methane into more valuable products. Curr. Opin. Biotechnol, 2018, vol. 50, pp. 128-135. DOI: 10.1016/j.copbio.2017.12.021

11. Galvagno M.A., Iannone L.J., Bianchi J., Kronberg F., Rost E., Carstens M.R., Cerrutti C. Optimization of biomass production of a mutant of Yarrowia lipolytica with an increased lipase activity using raw glycerol. Rev. Argent. Microbiol, 2011, vol. 43, no. 3, pp. 218-225. DOI: 10.1590/S0325-75412011000300010

12. Raza Z.A., Tariq M.R., Majeed M.I., Banat I.M. Recent developments in bioreactor scale production of bacterial polyhydroxyalkanoates. Bioprocess Biosyst. Eng., 2019, vol. 42, no. 6, pp. 901-919. DOI: 10.1007/s00449-019-02093-x

13. Asih D.R., Alam M.Z., Alam Z., Salleh M.N., Salleh N., Salihu A. Pilot-scale production of lipase using palm oil mill effluent as a basal medium and its immobilization by selected materials. J. Oleo Sci., 2014, vol. 63, no. 8, pp. 779-785. DOI: 10.5650/jos.ess13187

14. Zhong J.-J. Bioreactor Engineering. Comprehensive Biotechnology (Third Edition), ed. M. Moo-Young, Oxford, Pergamon, 2019, pp. 257-269. DOI: 10.1016/B978-0-444-64046-8.00077-X

15. Shanmugam M.K., Mandari V., Devarai S.K., Gumma-di S.N. Types of bioreactors and important design considerations. Current Developments in Biotechnology and Bioengineering, ed. R. Sirohi et al., Elsevier, 2022, pp. 3-30. DOI: 10.1016/B978-0-323-91167-2.00008-3

16. De la Fuente Salcido N.M., Andrade A.M.A. Challenges of fermentation engineering. Advances in food biopro-ducts and bioprocessing technologies, CRC Press, 2019, Ch. 11, pp. 233-264. DOI: 10.1201/9780429331817-11

17. Tikhomirova T.S., Taraskevich M.S., Ponomarenko O.V. The role of laboratory-scale bioreactors at the semi-continuous and continuous microbiological and biotech-nological processes. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2018, vol. 102, no. 17, pp. 7293-7308. DOI: 10.1007/s00253-018-9194-z

18. Arrojo B., Mosquera-Corral A., Campos J.L., Méndez R. Effects of mechanical stress on Anammox granules in a sequencing batch reactor (SBR). J. Biotechnol., 2006, vol. 123, no. 4, pp. 453-463. DOI: 10.1016/j.jbiotec.2005.12.023

19. Cantera S., Sánchez-Andrea I., Lebrero R., García-Encina P.A., Stams A.J.M., Muñoz R. Multi-production of high added market value metabolites from diluted methane emissions via methanotrophic extremophiles. Bioresour. Technol, 2018, vol. 267, pp. 401-407. DOI: 10.1016/j.biortech.2018.07.057

20. Kumar R.N., Vinod A.V. Oxygen mass transfer in bubble column bioreactor. Period. Polytech. Chem. Eng., 2014, vol. 58, no. 1, pp. 21-30. DOI: 10.3311/PPch.7122

21. Doig S.D., Ortiz-Ochoa K., Ward J.M., Baganz F. Characterization of oxygen transfer in miniature and lab-scale bubble column bioreactors and comparison of microbial growth performance based on constant k(L)a. Biotechnol. Prog, 2005, vol. 21, no. 4, pp. 1175-1182. DOI: 10.1021/bp050064j

22. Chaumat H., Billet-Duquenne A.M., Augier F., Mathieu C., Delmas H. Mass transfer in bubble column for industrial conditions - effects of organic medium, gas and liquid flow rates and column design. Chem. Eng. Sci., 2005, vol. 60, no. 22, pp. 5930-5936. DOI: 10.1016/j.ces.2005.04.026

23. Liu B., Zheng Y., Cheng R., Xu Z., Wang M., Jin Z. Experimental study on gas-liquid dispersion and mass transfer in shear-thinning system with coaxial mixer. Chin. J. Chem. Eng., 2018, vol. 26, no. 9, pp. 1785-1791. DOI: 10.1016/j.cjche.2018.02.009

24. Aroniada M., Maina S., Koutinas A., Kookos I.K. Estimation of volumetric mass transfer coefficient (kLa) - Review of classical approaches and contribution of a novel methodology. Biochem. Eng. J., 2020, vol. 155, id. 107458. DOI: 10.1016/j.bej.2019.107458

25. Yawalkar A.A., Heesink A.B.M., Versteeg G.F., Pangar-kar V.G. Gas-liquid mass transfer coefficient in stirred tank reactors. Can. J. Chem. Eng., 2002, vol. 80, no. 5, pp. 840-848. DOI: 10.1002/cjce.5450800507

26. Xu S., Gavin J., Jiang R., Chen H. Bioreactor productivity and media cost comparison for different intensified cell culture processes. Biotechnol. Prog., 2017, vol. 33, no. 4, pp. 867-878. DOI: 10.1002/btpr.2415

27. Rioseras B., López-García M.T., Yagüe C., Sánchez J., Manteca A. Mycelium differentiation and development of Streptomyces coelicolor in lab-scale bioreactors: programmed cell death, differentiation, and lysis are closely linked to undecylprodigiosin and actinorhodin production. Bioresour. Technol, 2014, vol. 151, pp. 191-198. DOI: 10.1016/j.biortech.2013.10.068

28. Steger F., Rachbauer L., Windhagauer M., Montgomery L.F.R., Bochmann G. Optimisation of continuous gas fermentation by immobilisation of acetate-producing Ace-tobacterium woodii. Anaerobe, 2017, vol. 46, pp. 96-103. DOI: 10.1016/j.anaerobe.2017.06.010

29. Brand E., Junne S., Anane E., Cruz-Bournazou M.N., Neubauer C. Importance of the cultivation history for the response of Escherichia coli to oscillations in scale-down experiments. Bioprocess Biosyst. Eng., 2018, vol. 41, no. 9, pp. 1305-1313. DOI: 10.1007/s00449-018-1958-4

30. Sandner V., Pybus L.C., McCreath G., Glassey J. Scale-down model development in ambrTM systems: An industrial perspective. Biotechnol. J., 2018, vol. 14, no. 4, id. 1700766. DOI: 10.1002/biot.201700766

31. Jonczyk C., Takenberg M., Hartwig S., Beutel S., Berger R.G., Scheper T. Cultivation of shear stress sensitive microorganisms in disposable bag reactor systems. J. Biotechnol, 2013, vol. 167, no. 4, pp. 370-376. DOI: 10.1016/j.jbiotec.2013.07.018

32. Michels M.H.A., van der Goot A.J., Vermuë M.H., Wijf-fels R.H. Cultivation of shear stress sensitive and tolerant microalgal species in a tubular photobioreactor equipped with a centrifugal pump. J. Appl. Phycol., 2016, vol. 28, no. 1, pp. 53-62. DOI: 10.1007/s10811-015-0559-8

33. Verkholaz Y., Lavrov C., Guseva E., Menshutina N., Boudrant J. Simulations of hydrodynamic stress in stirred-tank bioreactors using CFD technology. Computer Aided Chemical Engineering, eds. E.N. Pistikopoulos, M.C. Georgiadis, A.C. Kokossis, Elsevier, 2011, vol. 29, pp. 1451-1454. DOI: 10.1016/B978-0-444-54298-4.50069-6

34. Merchuk J.C. Shear effects on suspended cells. Bioreac-tor Systems and Effects. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol, 1991, vol. 44, pp. 65-95. DOI: 10.1007/BFb0000748

35. Fazenda M.L., Harvey L.M., McNeil B. Effects of dissolved oxygen on fungal morphology and process rheolo-gy during fed-batch processing of Ganoderma lucidum. J. Microbiol. Biotechnol, 2010, vol. 20, no 4, pp. 844-851. DOI: 10.4014/jmb.0911.11020

36. Zheng Y.-X., Wang Y.-L., Pan J., Zhang J.-R., Dai Y., Chen K.-Y. Semi-continuous production of high-activity pectinases by immobilized Rhizopus oryzae using tobacco wastewater as substrate and their utilization in the hydrolysis of pectin-containing lignocellulosic biomass at high solid content. Bioresour. Technol., 2017, vol. 241, pp. 1138-1144. DOI: 10.1016/j.biortech.2017.06.066

37. Orr D., Zheng W., Campbell B.S., McDougall B.M., Se-viour R.J. Culture conditions affect the chemical composition of the exopolysaccharide synthesized by the fungus Aureobasidium pullulans. J. Appl. Microbiol., 2009, vol. 107, no. 2, pp. 691-698. DOI: 10.1111/j.1365-2672.2009.04247.x

38. Timoumi A., Bideaux C., Guillouet S.E., Allouche Y., Molina-Jouve C., Fillaudeau L., Gorret N. Influence of oxygen availability on the metabolism and morphology of Yarrowia lipolytica: insights into the impact of glucose levels on dimorphism. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2017, vol. 101, no. 19, pp. 7317-7333. DOI: 10.1007/s00253-017-8446-7

39. Timoumi A., Cléret M., Bideaux C., Guillouet S.E., Al-louche Y., Molina-Jouve C., Fillaudeau L., Gorret N. Dy-

namic behavior of Yarrowia lipolytica in response to pH perturbations: dependence of the stress response on the culture mode. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2017, vol. 101, no. 1, pp. 351-366. DOI: 10.1007/s00253-016-7856-2

40. Cobas M., Danko A.S., Pazos M., Sanroman M.A. Removal of metal and organic pollutants from wastewater by a sequential selective technique. Bioresour. Technol., 2016, vol. 213, pp. 2-10.

DOI: 10.1016/j.biortech.2016.02.036

41. Moore R.L.L., Worrallo M.J., Mitchell C.D., Harriman J., Glen K.E., Thomas R.J. Immobilisation of Delta-like 1 li-gand for the scalable and controlled manufacture of hematopoietic progenitor cells in a stirred bioreactor. BMC Biotechnol, 2017, vol. 17, no. 1, id. 65. DOI: 10.1186/s12896-017-0383-0

42. Nitsche B.M., Jergensen T.R., Akeroyd M., Meyer V., Ram A.F. The carbon starvation response of Aspergillus niger during submerged cultivation: Insights from the transcriptome and secretome. BMC Genomics, 2012, vol. 13, id. 380. DOI: 10.1186/1471-2164-13-380

43. Jost B., Holz M., Aurich A., Barth G., Bley T., Müller R.A. The influence of oxygen limitation for the production of succinic acid with recombinant strains of Yarrowia lipolytica. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2015, vol. 99, no. 4, pp. 1675-1686. DOI: 10.1007/s00253-014-6252-z

44. Bellou S., Makri A., Triantaphyllidou I.-E., Papaniko-laou S., Aggelis G. Morphological and metabolic shifts of Yarrowia lipolytica induced by alteration of the dissolved oxygen concentration in the growth environment. Microbiol. Read. Engl, 2014, vol. 160, no. 4, pp. 807-817. DOI: 10.1099/mic.0.074302-0

45. Chen C.-C., Zha X.-H., Zheng C. Construction of fibrous bed bioreactor for enhanced succinic acid production using wastewater of dextran fermentation. Bioprocess Bio-syst. Eng., 2017, vol. 40, no. 12, pp. 1859-1866. DOI: 10.1007/s00449-017-1839-2

46. Zhao L., Cao G.-L., Sheng T., Ren H.-Y., Wang A.-J., Zhang J., Zhong Y.-J., Ren N.-Q. Bio-immobilization of dark fermentative bacteria for enhancing continuous hydrogen production from cornstalk hydrolysate. Bioresour. Technol, 2017, vol. 243, pp. 548-555. DOI: 10.1016/j.biortech.2017.06.161

47. Kays W.M., Crawford M.E. Convective heat and mass transfer. 3rd ed. NY, USA, McGraw-Hill Science, 1993. 480 p.

48. Kays W.M. Turbulent Prandtl number. Where are we? ASME J. Heat Transf, 1994, vol. 116, no. 2, pp. 284-295. DOI: 10.1115/1.2911398

49. Cerri M.O., Esperança M.N., Badino A.C., de Arruda Ri-beiro M.P. A new approach for kLa determination by gassing-out method in pneumatic bioreactors. J. Chem. Technol. Biotechnol., 2016, vol. 91, no. 12, pp. 30613069. DOI: 10.1002/jctb.4937

50. Dos Santos M.C., Cerri M.O., Bicas J.L. Relation of shear stress and kLa on bikaverin production by Fusarium oxysporum CCT7620 in a bioreactor. Bioprocess Biosyst. Eng., 2022, vol. 45, no. 4, pp. 733-740. DOI: 10.1007/s00449-022-02693-0

51. Redikul'tsev Yu.V., Zinov'ev M.A., Kudryashov V.K., Malyshev R.M., Naumov V.N., Ugraitskii A.A. Apparat dlya kul'tivirovaniya kletok i mikroorganizmov [Cell and microorganism culture apparatus]. Patent RF no. RU106899U1. Prioritet 07.27.2011. (In Russ.). URL: https://yandex.ru/patents/doc/RU106899U1_20110727

52. Redikul'tsev Yu.V., Kudryashov V.K., Zinov'ev M.A., Ugraitskii A.A., Golichenkov V.S., Bezruchko V.V., Si-zov A.N., Shevelev D.A., Semenovich E.A., Taraske-vich M.R. Apparat dlya sovmeshchennogo kul'tiviro-vaniya mikroorganizmov [Apparatus for combined cultivation of microorganisms]. Patent RF no. RU93394U1. Prioritet 04.27.2010. (In Russ.). URL:

https://yandex.ru/patents/doc/RU93394U1_20100427

53. Redikul'tsev Yu.V., Shirshikov N.V., Gavrilov A.B., Khodakov E.V. Sposob realizatsii fermentatsionnykh protsessov i apparat dlya ego osushchestvleniya [Method for implementation of fermentation processes and apparatus for its implementation]. Patent RF no. RU2596924C1. Prioritet 09.10.2016. (In Russ.). URL: https://yandex.ru/patents/doc/RU2596924C 1_20160910

54. Redikul'tsev Yu.V., Zinov'ev M.A., Kon'kov M.A., Kudryashov V.K., Malyshev R.M., Naumov V.N., Taraske-vich M.R., Ugraitskii A.A. Ustanovka dlya sovmeshchennogo kul'tivirovaniya mikroorganizmov [Combined microbial culture plant]. Patent RF no. RU102618U1. Prioritet 03.10.2011. (In Russ.). URL: https://yandex.ru/patents/doc/RU102618U1_20110310

55. Borba A.P., de Souza J., Haupt W., de Oliveira de Sou-za F.R., Sporket F., Rossini E.G., Reis B.P. Microstructural analysis of corrosion of welded joints in stainless steel used in manufacture of bioreactors. IJRES, 2016, vol. 4, no. 12, pp. 37-48. DOI: 10.6084/m9.figshare.12317492

56. Yan M., Wei B., Xu J., Li Y., Hu Y., Cai Z., Sun C. Insight into sulfate-reducing bacteria corrosion behavior of X80 pipeline steel welded joint in a soil solution. J. Mater. Res. Technol, 2023, vol. 24, pp. 5839-5863. DOI: 10.1016/j.jmrt.2023.04.163

57. Kadic E., Heindel T.J. Bubble Column Bioreactors. An introduction to bioreactor hydrodynamics and gas-liquid mass transfer, John Wiley & Sons, Ltd, 2014, pp. 124167. DOI: 10.1002/9781118869703

58. Lübbert A. Bubble Column Bioreactors. Bioreaction engineering: modeling and control, eds. K. Schügerl, K.-H. Bellgardt, Berlin, Heidelberg, Springer, 2000, pp. 247-273. DOI: 10.1007/978-3-642-59735-0_9

59. Khalil A., Rosso D., DeGroot C.T. Effects of flow velocity and bubble size distribution on oxygen mass transfer in bubble column reactors - A critical evaluation of the computational fluid dynamics-population balance model. Water Environ. Res., 2021, vol. 93, no. 10, pp. 22742297. DOI: 10.1002/wer.1604

60. Mahdinia E., Demirci A., Berenjian A. Biofilm reactors as a promising method for vitamin K (menaquinone-7) production. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2019, vol. 103, no. 14, pp. 5583-5592. DOI: 10.1007/s00253-019-09913-w

61. Hu G., Zhai M., Niu R., Xu X., Liu Q., Jia J. Optimization of culture condition for ganoderic acid production in Ga-noderma lucidum liquid static culture and design of a suitable bioreactor. Molecules, 2018, vol. 23, no. 10, id. 2563. DOI: 10.3390/molecules23102563

62. Qureshi N., Annous B.A., Ezeji T.C., Karcher C., Mad-dox I.S. Biofilm reactors for industrial bioconversion processes: employing potential of enhanced reaction rates. Microb. Cell Factories, 2005, vol. 4, no. 1, id. 24. DOI: 10.1186/1475-2859-4-24

63. Kosky C., Balmer R., Keat W., Wise G. Mechanical Engineering. Exploring Engineering (Third Edition), eds. C. Kosky et al., Boston, Academic Press, 2013, Ch. 12, pp. 259-281. DOI: 10.1016/B978-0-12-415891-7.00012-1

64. Goodwin M.E. Sampling ports and related container systems. Patent EP1837640B1. 07.01.2020. URL: https://patents.google.com/patent/EP1837640B1/en

65. Goodwin M.E., Larsen J.K. Tube port and associated container system. Patent JP5265345B2. 08.14.2013.

66. Wang Y., Qin W., Liang Y., Chen Y., Jiang Y. Sampling device of fermentation tank. Patent CN211713089U. 10.20.2020.

67. Lee C.B., Giroux D. Automatable aseptic sample withdrawal system. Patent US8281672B2. 10.09.2012. URL: https://patents.google.com/patent/US8281672B2/en

68. Qian J., Huang G., Wan Z., Gao Y., Xia, Yang S., Wang C., Zhao Y. Sampling port and harvesting port connector for bioreactor. Patent CN203200260U. 09.18.2013.

69. Ponomarenko O.V., Lepekhin Yu.A., Tikhomirova T.S. Fiting sterilizuemyi dlya gibkikh trubok [Sterilizable fitting for flexible tubes]. Patent RF no. RU2788265C1. Prioritet 01.17.2023. (In Russ.). URL: https://yandex.ru/patents/doc/RU2788265C1_20230117

Contacts: Tikhomirova Tatyana Sergeevna, Article received by the editorial office on 08 09 2023

tts05@mail.ru

INTRODUCTION

Small-volume bioreactors are laboratory equipment that is used to carry out various biotechnological processes. At the same time, the topics of these studies are quite diverse. In addition to one-stage cultivation of autotrophs. Laboratory bioreactors can be used to develop wastewater treatment [1, 2], biocatalytic transformation of substrates [3, 4], production of vaccines [5, 6], viral transformation of cells [7] etc. The purpose of their use is to study the features of processes carried out under controlled conditions [8, 9], their further optimization [10, 11] and scaling [12, 13].

There are several approaches to the classification of bioreactors based on their design, operating modes, methods of energy supply, and the types of processes carried out [14-17]. Therefore, when setting up a biotechnological experiment, many parameters should be taken into account to select an adequate model of a bioreactor system. Column-type reactors and stirred tank reactors are the most popular designs, providing the necessary minimum for the biotechnological process. Column bioreactors provide gentle mixing due to sparging. In this case, shear stresses, which can negatively affect the growth and development of the culture, do not arise [18, 19]. The disadvantage of this design is the low value of the mass transfer coefficient kLa up to 320 h-1 [20, 21]. This indicator can be enlarged by increasing the volumetric flow rate of the mixing gas [20] or by changing the linear dimensions of the column [22]. In turn, a bioreactor with a stirrer is characterized by higher mass transfer rates (50-550 h-1 [23-25]), which increases its demand on the market.

The above types of bioreactors are actively used in both forward and reverse scaling procedures. Direct scaling up of cultivation or biocatalysis processes is an important step in bio-technological research. It involves transferring a laboratory experiment to the controlled conditions of a bioreactor with a subsequent gradual increase in volumes. The results of direct scaling allow us to judge the profitability of the process under study [11, 26-28]. However, increasing volumes also increases the risk of rate and concentration gradients in the reaction zone, which leads to a decrease in process efficiency. In such cases, it is advisable to carry out reverse scaling. The essence of this method is to simulate the processes occurring in certain zones of industrial bioreactors (near-wall, central, bottom, etc.) [8, 29, 30].

As you can see, direct and reverse scaling is carried out using small-volume laboratory bioreactors (0.1-5 L), which allow optimizing the conditions for microbiological and fermentation processes and collecting data on the influence of various factors (method stirring, increasing the reaction volume, tempera-

ture and oxygen conditions, etc.) on the final result. Currently, the design of commercial laboratory bioreactors is presented in the form of a reactor with a paddle stirrer (Rushton turbine) and different numbers of blades (Tab. 1).

Tab. 1. Commercial laboratory small volume bioreactors with stirrer

This type of mixer provides a mainly radial (from the center to the wall) flow of liquid. Mixers with inclined blades also create weak axial (along the shaft) currents. In this case, during mixing, shear stress arises, which can affect the growth and development of microorganisms sensitive to mechanical damage [3134]. The efficiency of this design may also be reduced since the liquid is only mixed in the area adjacent directly to the blades. Therefore, paddle mixers are multi-tiered for mixing in a high layer of liquid, which creates even more shear stresses.

Such a standard design of a laboratory bioreactor limits the use of solid substrates, aggressive or explosive environments, and reduces the scope of their application. Therefore, the goal of this work was to develop alternative designs of laboratory bioreactors based on pneumatic mixing, which is a promising area of engineering research.

MATERIALS AND METHODS

Numerical thermostating modeling

Heat transfer modeling during temperature control of liquid in the reaction vessel LB-1 at rest and with stirring is necessary to understand the operating features of the developed submersible heat exchanger. In a stationary layer of liquid, heat transfer in the reaction vessel LB-1 is realized through free convection and thermal conductivity. Heat transfer here is calculated using the following energy conservation equation (1):

PCp + PCpuVT + Vq = Q + Qp + Qvd, (1)

where p is the density of the medium, kg/m3; Cp is specific heat capacity at constant pressure, J/(kg K); T is absolute temperature, K; u is velocity vector, m/s; q is heat flow by means of thermal conductivity, W/m2; Q is heat sources other than viscous dissipation, W/m3; Qp is the work done due to pressure changes, W/m ; Qvd is viscous dissipation, W/m3.

Parameters Qp and Qvd are determined by the following equations (2, 3):

Q, = if + uVp Qvd = t: Vu,

(3)

where ap is the coefficient of thermal expansion, K-1; t is viscous stress tensor, Pa.

For a stationary heat conduction problem (when the system is in equilibrium), the rate equation is known as Fourier's law and is described as equation

(4):

q = -kVT,

(4)

f

PrT =

- +

03Cp^T f 0.3Cp/uT )

2PrT„ XJP7T1

1 - exp

--

p^T

X

X

03Cp^TVPÎT

(5)

where the Prandtl number at infinity is Pr^ = 0.85; X is conductivity.

The Kays - Crawford model is a relatively accurate model for calculating Prr with sufficient approximation for most types of turbulent flows limited by walls, with the exception of turbulent flow of liquid metals [48].

Hydrodynamic modeling of fluid flow and the Navier - Stokes equation

The movement of viscous liquid substances can be described by certain partial differential equations, called the Navier - Stokes equations. For the movement of an incompressible viscous fluid with constant

density, the Navier-Stokes equation and the joint continuity equation have the form (6):

du

dt

pV-( u) = 0:

p— + p(u-V)u = V -pI + /u(vu + (Vu)T)

+ F,

(6)

where k is the thermal conductivity coefficient of the material, W/(m K). Equation (4) is widely used for quasi-equilibrium processes, where the temperature distribution in the system is important. Therefore, it is applicable for the process of thermostating in a reaction vessel in rest mode.

In the process of thermostating modeling on the upper and outer surfaces, the boundary condition of convective heat flow was used, based on the temperature difference between the working surface (the glass wall of the shell and the steel base of the container) and the surrounding atmosphere.

The Kays - Crawford model

For theoretical predictions of turbulent heat transfer in boundary layers and flows in canals, knowledge of the turbulent Prandtl number Prr is critical. To calculate this criterion, the Kays - Crawford model (5) [47] was used:

where u is the velocity vector of the liquid phase, m/s; pI is volume stress; p dynamic viscosity of the liquid, Pa s; F is the set of external forces applied to the fluid.

The Navier - Stokes equations are used to describe the physics of many phenomena. They are widely used to solve engineering problems, such as water flow in pipes and heat exchangers, flow around bodies of various geometries, as well as for scientific research purposes (ocean currents, weather modeling, movement of air masses, movement of liquids in bio-reactors).

For numerical simulation of turbulent flows, a k-s turbulence model and the RANS (Reynolds-Averaged Navier - Stokes) equations were used. The pulsation scale was calculated as 0.038-dz, where ds was the hydraulic diameter, mm.

Volumetric mass transfer coefficient kLa

The volumetric mass transfer coefficient kLa [h-1] is the main mass transfer characteristic of bioreactors, reflecting the rate of oxygen transfer across the phase boundary. The method of displacement followed by gassing out is widely used to determine kLa, [49]. This method involves removing dissolved oxygen from the liquid phase by nitrogen bubbling until the oxygen concentration in the liquid phase reaches zero. Then air or oxygen is reintroduced, and the change in oxygen concentration in the liquid is measured using polarographic or optical electrodes. The change in oxygen concentration in the liquid changes until the equilibrium concentration is reached, according to equation (7):

dC

dt

= kLa (C* - C),

(7)

where kL is the mass transfer coefficient, reflecting the diffusion rate of the substance at the phase boundary, m/s; a is specific phase interface area, m2/m3; C* and C are equilibrium and current concentrations of dissolved oxygen, mg/L. Integrating equation (7) allows us to describe the relationship between oxygen concentration and time, assuming that kL a remains constant (8):

ln (C* - C) = -kLat.

(8)

Thus, the graph of ln(C* - C) versus time gives a straight line, the tangent of the angle of which is equal to (-kL a). This method has an advantage over

2

1

X

X

the chemical method of sulfite oxidation because it can be used for fermentation media where dead cells or mycelium may be present in a concentration equal to that formed during fermentation.

RESULTS AND DISCUSSION

Design of a bioreactor with percolation mixing

One of the criteria for choosing bioreactor equipment for scaling cultivation of microorganisms sensitive to mechanical damage is the absence of shear stresses during mixing [43, 50]. The Institute of Biological Instrumentation of the Russian Academy of Sciences (IBP RAS) and its pilot plant developed a method for implementing such processes as well as a model of a laboratory bioreactor for their implementation [51-54]. Mixing here is carried out due to the return current of the liquid phase between two vertically fixed cylindrical containers under the action of compressed gas (air). In this case, the gas saturation of the nutrient medium occurs in the liquid film on the inner wall of the containers and on the surface of solid carriers, partially due to sparging. This mixing method is called percolation, since a solid substrate can be loaded into the container.

Thus, according to the classification of bioreactors by type of construction, a laboratory bioreactor (1.5 l) with percolation mixing is a column-type bioreactor intended for submerged and solid-phase cultivation. A simplified diagram of a bioreactor with percolation mixing is shown in Fig. 1.

Fig. 1. Simplified diagram of a laboratory bioreactor (1.5 l) with percolation mixing. Ф1 — filter drier; Р1, Р2 — pressure regulator with pressure gauge; МБР1, МБР2 — reaction vessel; Н1, Н2--diaphragm pump; ПР — pneumatic distributor block; ОГ — exhaust gases; К1, ..., К9 — normally closed pinch valves. The movement of the liquid and gas phases is regulated by normally closed pinch valves K1-K9; The direction of liquid and gas flows is indicated by black and white triangles, respectively. МБР reaction vessels are equipped with pH, pO2 and temperature sensors; the addition of titrants or nutrient medium to the reaction zone is carried out using membrane dosing pumps with an adjustable membrane volume; valve operation is regulated by 3-line 2-position normally closed pneumatic valves

The LB-1 bioreactor consists of a reaction block, a valve block, and a control station. Parts and components of the reaction vessels were made of stainless steel using mechanical processing methods. The assembly of the bioreactor components was carried out

using a threaded connection using O-rings. This type of connection was preferred because a welded joint may exhibit an increased tendency to form corrosion spots under the aggressive conditions of a biotechno-logical process [55, 56]. O-rings were also used between the glass shell and container lids to ensure the tightness of the reaction zone of the bioreactor. All materials are thermally stable enough to sterilize the assembled bioreactor system with live steam.

When developing the bioreactor, the principle of interchangeability was used, in which structural elements manufactured with a certain accuracy of geometric parameters are capable of performing specified functions regardless of the time and place of their manufacture.

Determination of volume factor of mass transfer kLa for LB-1

The volumetric mass transfer coefficient kLa for the laboratory bioreactor LB-1 depends on the flow rate of the liquid phase between the reaction vessels, which in turn depends on the volumetric flow rate of mixing air. This indicator can be increased by supplying a system with a liquid phase forced aeration in the flow and solid-state nozzles (Fig. 2).

Fig. 2. Dependence of the volumetric mass transfer coefficient kLa on mixing conditions in the laboratory bioreactor LB -1

Without the use of additional tools to increase mass transfer, the kLa coefficient for LB-1 was 4.5 ±0.1 h-1, which corresponds to the indicators for a bubble column with a low volumetric flow rate of aerating air [57-59]. Adding 0.037 m2 of solid-saddle shaped nozzles into the reaction vessel contributed to an increase in the mass transfer coefficient to 7.1 ±0.7 h-1 (Fig. 2). In turn, forced aeration of the liquid phase in the duct using an ejector connector has a much smaller effect on kLa compared to nozzles and reaches 6.0 ±0.1 h-1. It should also be noted that in this operating mode, there is a direct dependence of the mass transfer coefficient on the volumetric flow rate of mixing air. The highest kLa, value, which amounted to 8.4 ±0.3 h-1, was achieved with the simultaneous use of solid nozzles and forced aeration in intensive mixing mode.

Thus, the laboratory bioreactor LB-1 in its basic configuration, being a column-type bioreactor, provides a rather low mass transfer coefficient. However, adding additional surfaces or membrane elements to the design, as well as increasing the mixing speed and forced aeration, contribute to an increase in kLa. values. It should be noted that the use of a mobile liquid

phase and stationary solid carriers is typical for film bioreactors, which are widely used for the cultivation of immobilized cultures [60-62].

Immersion heat exchanger with liquid heating

To ensure the specified cultivation conditions, the reaction vessels of the laboratory bioreactor LB-1 are equipped with heat exchangers of submersible type and liquid heating (Fig. 3).

Fig. 3. Model of a submersible type heat exchanger with liquid heating.

a — isometric projection of the model; 6 — cross-section of the model.

1 — glass, 2 — body, 3 — flow extension, 4 — inlet fitting, 5 — outlet fitting, 6 — drain hole, 7 — drain fitting. Arrows indicate the direction of heat carrier flow

As can be seen from Fig. 3, the submersible heat exchanger is an assembly unit with a detachable connection that makes it possible to wash parts separately.

The effective area of the heat exchange surface of the glass is 35 ±0.5 cm2, which can be expanded to 63 ±0.5 cm2 by adding inserts to the design. The preferred option for installing a submersible heat exchanger is a threaded connection to the base of the bioreactor vessel, which provides the largest contact area between the heat exchange surface and the liquid phase in the reaction zone.

To study the behavior of the system during ther-mostating, a numerical simulation of heat transfer in the LB-1 reaction vessel was carried out in static mode (Fig. 4).

Fig. 4. Model of the thermostating process using a submersible heat exchanger in the reaction vessel of the laboratory bioreactor LB -1 in static mode. a — temperature gradient profile; 6 — change in the temperature of the model liquid at the central point of the surface layer of the liquid and at the entrance to the extended level fitting.

The volume of the reaction vessel is 1.42 L; fill factor is 75%; water is a model heated liquid (18 °C). Temperature measurement areas are indicated by marks; ambient temperature 20 °C; heat carrier temperature 31 °C; required heating temperature 28 °C; effective surface area of the heat exchanger 62.3 cm2; heating time 6000 s.

The measurement was carried out using a resistance thermometer ,0TC 214-Pt100.A3.40/1 (OBEH®)

The Rayleigh number for the air layer above the liquid surface was 4.36 ±10-6, which corresponds to a laminar flow in which heat transfer occurs due to thermal conductivity rather than convection. Therefore, the heat transfer coefficient k (4), used in the modeling, was taken to be equal to 2.5 W/(m2 K), which corresponds to the thermal resistance in a thin layer of air at a temperature of 20 °C [63]. Due to the low heat transfer coefficients of the air film on the surface of the liquid phase, most of the heat enters through the effective surface of the submersible heat exchanger.

According to the results of numerical modeling, the required temperature of the liquid medium of 28 °C can be achieved in static mode in one hour. In addition, it should be noted that there is a pronounced thermal gradient, at which the temperature difference in the volume of the reaction vessel can reach 3 °C (Fig. 4, a). This non-uniformity of heat distribution is due to the presence of an extended fitting designed to maintain a given level of liquid in the reaction vessel during mixing (Fig. 1, MEP1, line K8).

To verify the resulting model, laboratory tests were carried out, during which the temperature change was determined in the center of the upper layer of the model liquid and in the least heated area at the entrance to the extended fitting (Fig. 4, 6). The data obtained are consistent with the results of numerical modeling.

The time to establish the required temperature of the heated liquid at 28 °C for the model and laboratory experiment at the central point of the surface layer was 2380 ±354 s. However, it should be noted that for the area at the inlet to the level fitting, upon reaching a temperature of 24 °C under the conditions of a laboratory experiment, a slowdown in the heating process is observed, which may be due to the influence of the environment. A film of condensation forms on the outside of the reaction vessel walls due to the temperature difference between the ambient air and the heated liquid, which was not taken into account in the model. The time to reach the required temperature in this area under the conditions of a laboratory experiment was 3655 s versus 2550 s in the model.

Thus, the data obtained indicate sufficient efficiency of the developed submersible heat exchanger. This working unit can be used as part of a laboratory bio-reactor LB-1 when carrying out biotechnological processes.

Steam sterilizable connector for aseptic sampling

Aseptic sampling is the key to the success of the experiment in the biotechnological usage of bioreac-tors of various volumes. The introduction of outside microflora into the bioreactor can lead not only to in-

correct results, but also to contamination of working surfaces.

In laboratory bioreactors with a volume of 3 up to 10 l, aseptic sampling is carried out using special ports located on the wall of the reaction vessel [64]. Several samplers can be connected to such ports, the sterilization of which takes place together with the sterilization of the entire bioreactor installation [65].

For small-volume laboratory bioreactors (up to 3 L), remote vacuum samplers [66] or lines of sealed containers [67] are used. The main disadvantage of all the above sampling methods is the impossibility of repeating the sterilization procedure.

In [68], it is proposed to solve this problem by using a sterilizable T-shaped connector to connect the sampler to the bioreactor system (Fig. 5). According to the proposed scheme (Fig. 5, a), a sampler 3 and a source of sterilizing medium 4 are connected to the bioreactor vessel 1, through a T-shaped connector 2.

Fig. 5. Sterilizable T-connector for aseptic sampling. a — schematic diagram of the aseptic sampling unit; 6 — model of the flow of the sterilizing medium through the T-shaped connector. 1 — bioreactor container; 2 — sterilizable T-shaped connector for aseptic sampling; 3 — sampler; 4 — source of sterilizing medium; steam (120 °C) was used as a model sterilizing medium, volumetric flow 60 L/h; bore diameter of the T-shaped sterilizable connector 0 6 mm.

The flow of sterilizing medium (liquid or steam) and liquid sample is controlled by valves K1-K3. The direction of liquid/vapor flows is indicated by black triangles; the movement of the liquid phase is carried out using peristaltic pumps H1 and H2; in case of sterilization with live steam, the H2 pump is not used; hydrodynamic modeling corresponds to the sterilization mode (valve K1 is closed)

During normal operation of the bioreactor, all lines of the sampler system are closed by valves K1-K3. Sampling is carried out in two stages, in the first of which the unit is pre-sterilized with the valves K2 and K3 open using pump H2. After this, valves K2 and K3 are closed, while valve K1 is opened for sampling using pump H1. The advantage of this system is the ability not only to take samples, but also to replenish the substrate. Among the disadvantages, it should be noted the low efficiency of sterilization of working surfaces due to the characteristics of the flow of the sterilizing medium in the channel of the T-shaped connector (Fig. 5, 6). In accordance with the results of hydrodynamic modeling, the imperfection of the T-shaped connector design is characterized by a decrease in the ability of the sterilizing medium to penetrate branches located at an angle to the sterilization flow line, which provokes the formation of dead

zones. At a volumetric flow rate of live steam (120°C) of 60 L/h, the minimum flow velocity of 1.3 -10-6 m/s is observed at the junction of the T-shaped connector and the bioreactor tank. In addition, there is a zone of reduced speed in the sampler branch, which may affect the effectiveness of sterilization.

The use of a cross-shaped fitting to connect the auxiliary flow line through which the sterilizing medium is supplied can significantly reduce the risk of contamination of the reaction medium (Fig. 6, a).

Fig. 6. Sterilizable cross connector for aseptic sampling.

a — schematic diagram of an aseptic sampling unit using a steam-sterilizable cross-shaped connector; 6 — model of the flow of the sterilizing medium through the cross-shaped connector. 1 — bioreactor container; 2 — sterilizable cross-shaped connector for aseptic sampling; 3 — sampler; 4 — source of sterilizing medium; steam is used as a model sterilizing medium (120 °C), volumetric flow 60 L/h; bore diameter of the cross-shaped connector 0 6 mm.

The flow of sterilizing medium (liquid or steam) and liquid sample is controlled by valves K1-K4. The direction of liquid/vapor flows is indicated by black triangles. The movement of the liquid phase is carried out using peristaltic pumps H1 and H2. In case of sterilization with live steam, the H2 pump is not used; hydrodynamic modeling corresponds to the sterilization mode (valves K1 and K2 are closed)

According to the proposed scheme (Fig. 6, a), a sampler 3 and a source of sterilizing medium 4 are connected through a cross-shaped connector 2 to the bioreactor vessel 1. In the normal operation mode of the bioreactor, all lines of the sampler system are blocked by valves K1-K4. Sampling is carried out in two stages, in the first of which preliminary sterilization of the unit is performed with valves K3 and K4 open using pump H2. After this, valves K3 and K4 are closed, while valves K1 and K2 are opened to take the sample using pump H1. It should be noted that, unlike a system with a T-shaped connector (Fig. 5, a), in this system the sampling container is connected before the start of the sterilization procedure, which significantly reduces the risk of contamination. However, as in the case of the T-shaped connector (Fig. 5, 6), the cross-shaped connector is ineffective because there are zones of zero velocity in the liquid phase (5.8-10-6 m/s).

To solve this problem, a sterilizable cross-shaped connector with a special cross-section was developed, which ensures an increase in the penetrating ability of the sterilizing medium (Fig. 7) [69].

Fig. 7. Cross connector with partition for aseptic sampling.

a — longitudinal section; б — model of the flow of the sterilizing medium.

1 — body; 2 — main line fitting (from the bioreactor to the sampler); 3 — channels of the main line; 4 — channels of the auxiliary sterilizing line; 5 — guide partition.

The model sterilizing medium is steam (120 °C), volumetric flow of 60 L/h.

Diameters: flow section of the sterilizing line 0 6 mm, working line 0 6 mm, guide lines separated by a partition 0 3.2 mm. Hydrodynamic modeling corresponds to the sterilization mode (Fig. 6, a, valves K1 and K2 are closed)

This approach implies the presence of a partition inside the cross, which redirects the flow towards the auxiliary sterilizing line (Fig. 7, a). According to the results of hydrodynamic modeling, the maximum speed of the sterilizing medium is observed in the area where the flow turns into the channels of the main line and is 4.9 m/s, which is two times more than for the T-shaped and cross-shaped connectors (Fig. 5, 6, and 6, 6). This feature is explained by a twofold decrease in the diameter of the flow section from 6 mm to 3.2 mm. It should be noted that the region of minimum speed (7.2-10-4 m/s) is located in the middle of the partition on the axis of the inlet flow. A similar cone-shaped area is observed on the opposite side of the partition. Since the movement of the sterilizing medium in them is reduced, these areas constitute a "parasitic" volume. Due to the fact that the cross-shaped connector with a partition is made of rolled stainless steel of round cross-section using mechanical processing methods, this volume was replaced by a structural element (Fig. 8).

Fig. 8. Modified cross connector with partition for aseptic sampling.

a — longitudinal section; б — model of the flow of the sterilizing medium.

1 — body; 2 — main line fitting (from the bioreactor to the sampler); 3 — channels of the main line; 4 — channels of the auxiliary sterilizing line; 5 — guide partition; 6 — trapezoidal flow divider. The model sterilizing medium is steam (120 °C), volumetric flow of 60 l/h.

Diameters: flow section of the sterilizing line 0 6 mm, working line 0 6 mm, guide lines separated by a partition 0 3.2 mm. Hydrodynamic modeling corresponds to the sterilization mode (Fig. 6, a, valves K1 and K2 are closed)

flow of the sterilizing medium and its uniform distribution into the channels of the main line. The minimum flow velocity is 0.001 m/s and is observed at the divider site (Fig. 8, б). It should also be noted that the addition of this structural element to the lumen of the main line channels does not affect the flow rate profile of the sterilizing medium.

As mentioned above, this connector can be used not only for sampling but also for adding culture media and titrants into the reaction vessel of the bioreac-tor. To determine the influence of the trapezoidal divider on the profile of the liquid phase flow rates in the substrate feeding mode, hydrodynamic modeling was carried out (Appendix, Fig. П).

According to the results of hydrodynamic modeling, the depth of penetration of the liquid phase into the branch of the auxiliary sterilizing line for a connector with a trapezoidal divider is greater than for a connector with a smooth partition (Appendix, Fig. П). The maximum flow rate of the liquid phase when passing through this structural element is 1.37-10-5 m/s, which is 1.4 times more than for a smooth channel (9.18-10-6 m/s). It can be concluded that the use of a cross-shaped connector with a trapezoidal divider helps to reduce the volume of the stagnant zone formed in the auxiliary sterilizing line when operating the main line.

CONCLUSION

This work presents a developed small-volume laboratory bioreactor LB-1 (1.5 L) with percolation mixing. This type of mixing ensures the nutrient medium saturation with gases, mainly in the liquid film on the inner surface of containers, and also partly due to bubbling. Each unit volume of mixed liquid passes through critical turbulence points in the connecting line, which ensures a high degree of homogeneity of the medium without the formation of shear stresses characteristic of turbine and blade mixers. Therefore, this approach is applicable for cultivating microorganisms that are sensitive to mechanical stress, as well as for immobilized washed cultures.

The presented bioreactor is assembled using a detachable threaded connection, which allows the use of a set of necessary parts and assemblies to perform a specific biotechnological task for scientific, practical and educational purposes and also makes it possible to mobilely replace or add structural elements while maintaining the current functional level.

The trapezoidal element is located in the middle of the guide partition and serves as a divider for the inlet

Appendix

Fig. П. Hydrodynamic modeling of liquid phase flow through a cross-shaped sterilizable connector with a partition in substratum feeding mode. a — connector with a smooth partition; б — connector with a partition and a trapezoidal flow divider.

Velocity profiles of the liquid phase correspond to the cross sections of the inlet flow at a distance of +4 mm from the axis of the main line fitting to the plane of the inlet of the auxiliary sterilizing line in increments of 1 mm.

The model liquid phase is water (20 °C), volume flow 10 mL/min. Hydrodynamic modeling corresponds to the sampling/substrate feeding mode (Fig. 6, a, valves K3 and K4 are closed)