CC BY
73
Лктуи.п.н i проблемы сучасно!" медицины
УДК: 616.831- 005.1: 612.017.1 Торяник И.И., Колесник В.В.
УНИФИЦИРОВАННЫЙ ПОДХОД К СОЗДАНИЮ МОДЕЛИ ИШЕМИЧЕСК0Г0 ИНСУЛЬТА ГОЛОВНОГО МОЗГА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ НА КРЫСАХ ЛИНИИ ВИСТАР
ГУ «1нститут микробиологии и иммунологии им. И.И. Мечникова НАМИ Украины», Харьков, ГУ «Институт нейрохирургии им. акад. А.П. Ромоданова НАМИ Украины»
В статье представлен унифицированный подход к созданию модели ишемического инсульта в эксперименте на крысах линии Вистар. Материалом исследования послужили имбредные самцы в возрасте 3-х месяцев, массой 160-175 г, количеством п=45. Цель опыта достигалась путем эм-болизации коллатеральных сосудов частицами взвеси сульфата бария (125 мг/кг), что давало гарантированное выключение магистрального и коллатерального кровоснабжения соответсвую-щего полушария головного мозга и стандартные повреждения головного мозга, сходные с таковыми у человека в случае развития традиционной клинической патологии. Результаты оценивали по характеру выяленных морфологических изменений (глиозы, ' инфаркты, деструктивно-дегенеративные изменения сосудов); нарушениям поведенческой сферы и неврологического статуса (тревожность, заторможенность, ярость, агрессивность, амнестические расстройства, торпидность в общении с сородичами). Резюмируя достигнутое, отметим эффективность проведенного эксперимента и оптимистические перспективы использования экстраполятивных данных в качестве фундамента для дальнейшего апробирования новаторских методов оперативной интервенции ишемического инсульта.
Ключовые слова: модель ишемического инсульта, крысы линии Вистар, общая сонная артерия, лигатура, эмболизация латерального кровотока, инфаркты головного мозга, расстройства поведения и неврологического статуса.
Введение
Проблема экстраполятивных исследований на животных в современных экспериментальной биологии и медицине приобретает в последнее время особую остроту [7; 11]. Существует целый ряд нозологических единиц, изучение этиопато-генетических особенностей которых немыслимо без экспериментального опробирования, опытного обоснования, многочисленных лабораторных проверок. Успешная клиническая динамика современных острых состояний, диагностика и прогноз развития ближайших и отдаленных последствий многих заболеваний базируются сегодня на скурпулезных опытных данных, экспериментальных новаторских прорывах, в отдельных случаях оправданном научно- исследовательском риске [4; 9; 16]. В данном случае не является исключением ишемический инсульт. История создания лицензионно способной экспериментальной модели ишемического инсульта в целом насчитывает немногим более двух десятилетий, когда в авторитетных научных изданиях стали появляться сообщения об успешном моделировании церебральных ишемий (до этого окклюзии отдельных мозговых артерий) [6; 12] на лабораторных животных. Основными прототипами послужили кысы линии Вистар, по праву считавшиеся наиболее толерантной по
отношению к человеку моделью. На сегодняшний день они с лабораторными мышами составляют 85 % от общего числа животных, используемых в экспериментальных целях [1]. Выбор именно этих животных оказался неслучайным и был определен целым рядом факторов: генетической однородностью (гомозиготностью) и, как следствие этого, обладающих постоянством реакции на воздействие физико-химических, физиологических, биопатогенных, стрессорных факторов; уровню чувствительности к раздражителям; скоростью элиминации мутаций, особой концервативностью фено- и генотипических признаков (масть, здоровье, плодовитость), спецификой биохимических, иммунологических, функциональных, морфологических показателей, их выраженнностью, и определенным уровнем сходства с таковыми у человека. Последнее привело к созданию Атласа стереотак-сических координат головного мозга крыс, академическое издание которого является настольной книгой для современной экспериментальной науки [13].
Вторым важным пунктом в моделировании ишемического инсульта стал выбор способа воздействия на структуры головного мозга животного таким образом, чтобы полученные экспериментальным путем изменения оказались максимально сходнями с теми, что возникают у
* Исследования, представленные в настоящей работе, являются фрагментами научно- исследовательских тематик: «Изучить влияние прогениторных клеток на течение воспалительно-дегенеративных повреждений ЦНС и разработать дифференцированные методы их лечения»; 2010-2012 р. р. № 011011002191; «Разработка технологии получения аутокпеток различных типов биологических тканей из стромальных клеток костного мозга и их применение для лечения заболеваний разного г'енеза с помощью аутотрансплантации», номер № 010611003995; «Использование аутологических мезенхимальных стволовых клеток при моделированном ишемическом инсульте».
человека вследствие патологии. В данном случае эффективность решения определяло моделирование окклюзии средней мозговой артерии, магистрального кровотока, что позволило получить стандартные повреждения неокортекса, хвостатого ядра и его капсулы [6; 11; 12; 15]. Однако это не давало исчерпывающего ответа на вопрос о генезе топографически сопутствующих повреждений коры головного мозга и его подкорковых центров, регистрируемых в клинике. Требовали своего дальнейшего разрешения проблемы реваскуляризации, формирование сетей коллатерального кровообращения и обратных эффектов ишемии. Остались не до конца изученными хронобиологические особенности инсульта в их взаимосвязи с защитной ролью эпифизарным мелатонином [2]. Особого звучания приобретала проблема поиска нейро-протекторов и их применения как в постинсультных ситуациях, так и в качестве эффективных средств для лиц, составляющих "инсультную" группу риска [3; 8].
Становилось понятным, что разрешение всех вышеизложенных вопросов невозможно без экспериментальной апробации, глубокого и всестороннего анализа клинических особенностей опытного прототипа, обоснованного прогноза последствий и применяемых средств профилактики. Важным моментом оставалось создание универсальной унифицированной модели ише-мического инсульта на животных, высокодемонстративной и доступной в используемых средствах. На фоне этого становилось необходимым дальнейшее усовершенствование экспериментальной атрибутики, вспомогательной техники, изучение условий среды для создания возможностей мобильности и адаптивности эксперимента.
Учитывая все вышеизложенное, актуальность дальнейшей разработки подходов к созданию унифицированной модели ишемического инсульта в эксперименте на животных не вызывает сомнений.
Цель исследования: создать модель ишемического инсульта в эксперименте на лабораторных животных, имбредных самцах крыс линии Вистар, 3-месячного возраста.
Материалы и методы исследования
Материалом настоящего исследования послужили имбредные самцы крыс линии Вистар, 3- месячного возраста, массой 160- 175 г, содержавшиеся в стандартных условиях вивария (температура воздуха составляла- 17- 22° С; относительная влажность не превышала уровень 50- 60%, норма искусственного освещения поддерживалась на цифре 60 л к). Для получения модели ишемического инсульта у подопытных животных прибегали к эмболии коллатеральных ветвей общей сонной артерии в одном из полушарий головного мозга. Крыс наркотизировали
кетамином интраперитониально из расчета 125 мг на кг веса животного. В продолжение всего хода оперативного вмешательства и до выхода из наркоза производили контроль температуры тела животного, поддерживая ее на уровне 37 С. Фиксацию головы прооперированных особей осуществляли с помощью ушных кернов и зубного зажима на стереотаксическом аппарате. С каждого из соответствующих передне-латеральных областей шеи животного (в зависимости от нужд эксперимента) до ушной раковины делали кожные разрезы. На предварительно эпиллированной поверхности расширяли поверхность раны, обнаруживая стволы общей сонной артерии (a. communis
carot.) у места ее биффуркацию на наружную и внутреннюю сонные. В случае необходимости площадь операционной раны увеличивали, выделяя сонную артерию. Проводили две лигатуры, пунктировали сонную артерию, вводя внут-риартериально сульфат бария в количестве 0,1-0,3 мл. Перевязывали дистальный и проксимальный отрезки. Операционную рану ушивали послойно. Заявленный способ путем эмболиза-ции коллатеральных сосудов частицами взвеси сульфата бария давал гарантированное выключение магистрального и коллатерального кровоснабжения соответсвующего полушария головного мозга и, как следствие, стандартные повреждения головного мозга, сходные с таковыми у человека в случае развития традиционной клинической патологии. Вышеизложенные мероприятия касались животных, вошедших в группу экспериментальной экстраполяции (п= 15). Вторую группу (п= 15) составили ложноопе-рированные особи. Третья (п= 15) была представлена интактными линейными крысами (контроль). Оперативное вмешательство на грызунах производили в утренние часы суток, что соответствовало их биоритмологической активности и хронобиологическим особенностям возникновения ишемического инсульта, исходя из ретроспективного анализа клинико- эпидемиологических данных последних лет [1; 2]. Кормление животных осуществляли по общепринятой схеме, путем применения сбалансированного рациона, специально разработанного для-грызунов (имбредные крысы линии Вистар, с учетом росто- весовых показателей особей, их половой принадлежности и возраста). Выводили животных из эксперимента, четко регламинти-руясь документативной базой правовой нормы, касающейся защиты лабораторных животных. Полушария извлекали из полости черепа путем удаления костей свода и тотального пересечения вещества продолговатого мозга на его границе со спинным и последующей морфометри-ей изучаемых структур. Нативные препараты подвергали в дальнейшем фиксации в растворе 12%-го формалина на фосфатном буффере (рН= 7,0- 7,2). Обезвоживание производили по
Актуальт проблемы сучасно!' медицины
традиционной схеме использования батареи спиртов возрастающей концентрации от 30° до абсолютного. Парафиновые/ целлоидиновые блоки резали, прибегая к помощи санного микротома в трех взаимно перпендикулярных плоскостях. Окрашивали срезы в зависимости от нужд исследования (гематоксилином- эозином, азуром-эозином, импрегнировали серебром). Анализ стрктурно- функциональных сдвигов производили в светооптическом микроскопе ЛОМО (хЗОО; хбОО). Идентичные показатели обобщали, статистическую обработку осуществляли, используя общепринятый пакет программ '^айБйса".
Результаты и их обсуждение. Результаты исследования оценивались по степени решения запланированных задач. Последние заключались в том, чтобы дать комплексную морфо-функциональную характеристику изменений, происходивших в зоне бассейна магистральных и коллатеральных сосудов, ветвей общей сонной артерии (в качестве одного из стандартных тестов для экспериментов подобного рода); уровня васкуляризаций зон повреждения, степени декомпенсации микроциркуляторных процессов и объема трофических расстройств; поведенческих реакций животных (с учетом первичных неврологических расстройств и способности к адаптации).
Было установлено, что животные каждой из опытных групп адекватным образом отреагировали на влияние экспериментальных факторов. В группе интактного контроля, как и прогнозировалось, животные вели себя активно, в четком соответствии с их суточными биоритмами. Крысы живо реагировали на привычные раздражители (постукивание по стенке клетки, звоночек), охотно принимали пищу и питье, участвовали в «играх», прятались в искусственно сооруженные экспериментатором норки. Случаи агрессии не наблюдались. Морфологически (биопсийный материал от части особей исследуемой группы): структура сосудов соответствовала возрастной норме линейных Вистаровских крыс, слои стенок четко дифференцировались, их дефекты отсутствовали, очаги кровоизлияний, стазирова-ние, тромбозы не наблюдались. Участки некрозов, ишемические инфаркты, глиоз, деструктив-но-дегенеративные изменения коры отмечены не были.
Линейные крысы, относившиеся к группе ложнооперированных животных, к финалу эксперимента практически достигали состояния ин-тактных особей. На 3-й сутки опыта проявляли интерес к пище, своим сородичам, начинали реагировать на привычные раздражители. Их активность прогрессивно нарастала с увеличением сроков послеоперационного периода. В связи с тем, что кроме оперативного вмешательства (вне формирования ишемического очага), эти крысы никаких иных воздействий не претерпевали, структурно- функциональные изме-
нения в исследуемых тканях отличались сходством с теми, что регистрировались в предыдущей группе. Поправка делалась лишь на репа-ративно- регенераторные процессы, естественные для такого рода вмешательств.
Особый интерес представляла группа животных претерпевших эксперимент по моделированию ишемического инсульта. Поведенчески в ближайшие сутки послеоперационного периода демонстрировались заторможенность, страх (неуклонное стремление спрятаться в норку, боязнь окружающей обстановки), торпидность в общении с сородичами, снижение ментальной функции (очевидность забывания места расположения, окружающих предметов, неспособность к функциональному поведению, длительный поиск поилки, кормушки и т.д.). Отмечалось нарушение симметричности реакций на раздражение (левая/ правая стороны туловища). В ряде случаев животные проявляли исключительную агрессивность, выраженную ярость по отношению к себе и озлобленность к соседям по клетке. Теряя чувствительность (передние, задние конечности), крысы отгрызали себе лапы от голено- стопного сустава до коленного. Отдельные особи очень активно, с азартом нападали на более слабых сородичей, с увлечением калечили последних, препятствуя их восстановлению.
Морфологически отмечались деструктивно-дегенеративные изменения коры (пириформная, медиальные участки височной области) и подкорковых центров (хвостатое ядро, его капсула, миндалина, гиппокамп). В неокортексе регистрировались многочисленные очаги инфарктов мозга (красных, серых, белых) [15]. Некроз нейронов носил распространенный характер и касался наружной капсулы мозга, медиальных зон (в виде островков височной области), гиппокам-па и парагиппокампальных участков. Некрози-рованные нейроциты отмечались вплоть до вентрикулярных зон (наружные, верхнее- латеральные передние стенки). В указанных местах развивался глиоз. Ядра поврежденных клеток отличались гиперхромностью, перераспределением хроматина, кариопикнозом. Нередкими становились нарушения структуры мембран, повреждения цитоплазматических структур (эндо-плазматической сети, комплекса Гольджи). Площадь поврежденного дефекта мозга после моделирования ишемического инсульта на 1-3 сутки эксперимента была наибольшей, количество поврежденных сосудов максимальным. С увеличением сроков эксперимента эти показатели снижались.
Отмеченные нарушения в структуре сосудов приводили к диапедезу эритроцитов за пределы сосудистой стенки и формированию многочисленных паравазальных кровоизлияний. Изменение топографических и функциональных свойств эндотелиоцитов вызывали цепь закономерных реакций, способствовавших развитию
стазов, вторичных тромбозов и, в конечном итоге, нарушений микроциркуляции (ишемия) и трофики в зонах повреждений, что соответствующим образом характеризовало морфологическую картину ишемического инсульта [5].
Анализируя эмпирически полученные результаты, можно отметить связь нарушений поведенческого и неврологического статуса с выявленными морфологическими сдвигами. Структурные изменения в пириформной зоне коры полушарий большого мозга, отвечающей за формирование эмоциональных реакций (агрессивность поведения, озлобленность, нетерпимость к другим особям, ярость, страх, тревожность), становились морфологическим фундаментом для расстройства функций последних и этим объяснялись резко выраженная конфликтность особей в популяции с моделированным ишемическим инсультом [3; 14]. Так называемая забывчивость, ситуационная амнезия с приступами очевидного снижения ментальных функций, безусловно, определялись органическими изменениями в коре височной области. Именно с этими фактами, а также с деструктивно-дегенеративными изменениями в строении гип-покампа, парагиппокампальной области, минда-лены можно связать варианты нарушений кратковременной и долгосрочной памяти, эмоциональную лабильность у животных экспериментальной группы с моделированным ишемическим инсультом. Предположительно существует несколько причин, препятствующих сохранению тканей мозга в условиях ишемического инсульта [3; 10; 15]. Прежде всего, апоптоз и связанное с ним снижение выживаемости нейроцитов, независимо от исходного возрастного ценза подопытного животного (вспомним результаты секций: кариопикноз, гиперхромность ядер-прогностически неблагоприятный показатель). Сохранению и поддержанию функционального состояния тканей также могла способствовать активация ангиогенеза, что исключалось в нашем случае по причине возникновения «вторичных тромбозов», вызванных нарушениями структуры стенок микрокапиллярного русла (в дальнейшем это приводило к ишемии и выраженным нарушениям трофики головного мозга, его гипоксии). Нейро- и ангиопротекции могли бы также способствовать методы современной трансплантации эндогенных стволовых клеток, которые по праву считаются одим из наиболее новаторских методов ускорения репаративных процессов, в том числе, опосредованного порядка. Один из способов решения данной проблемы планируется представить в нашей очередной публикации.
Выводы:
1. Способ эмболизации коллатеральных сосудов частицами взвеси сульфата бария (125мг/кг) приводил к гарантированному выклю-
чению магистрального и коллатерального кровоснабжения соответсвующего полушария головного мозга и, как следствие, к стандартным повреждениям головного мозга, сходным с таковыми у человека в случае развития традиционной клинической патологии (ишемический инсульт мозга).
2. Морфологическими критериями развившегося ишемического инсульта были инфаркты коры головного мозга, очаги глиозов, нарушения микроциркуляции с развитием параваскулярных отеков, стазированием микрососудов, тромбозами, ишемией.
3. К числу признаков расстройств поведенческого и неврологического статуса относили: страх, тревожность, заторможенность, ярость, агрессивность, амнестические нарушения, ко-ординативные сдвиги, торпидность в общении с сородичами.
4. Полученная модель ишемического инсульта оригинальна, унифицирована, доступна для повторения в эксперименте; гарантирует стандартность структурно- функциональных изменений; степень сходства с таковыми у человека может быть использована в качестве фундамента для изучения клеточной терапии инсульта.
Перспективы дальнейших разработок в данном направлении состоят в усовершенствовании существующих подходов к созданию адаптивных моделей ишемического инсульта на животных в эксперименте, их применении в опытах по изучению влияния мезенхимальных клеток на репаративные процессы в корковых, глиальных структурах, сосудах головного мозга в условиях развития деструктивно- дегенеративных изменений.
Литература
1. Анатомия крысы (лабораторные животные). - Лань, 2001. - 464 с.
2. Арушанян Э.Б. Хронобиологические особенности инсульта и защитная роль эпифизарного мелатонина/ Э.Б. Арушанян, С.С. Наумов // Буковинський медичний вюник.- 2009,- Т. 13, №4,- С. 10-16.
3. Зинькова Н.Н. Терапия ишемического инсульта головного мозга у крыс с помощью мезенхимных стволовых клеток /Н. Н. Зинькова, Е. Г. Гилерович, И. Б. Соколова [и др.] // Цитология.-2007,- № 7 (49).- Р. 566-575.
4. Скворцова В.И. Механизмы повреждающего действия церебральной ишемии и новые терапевтические стратегии / В.И. Скворцова //Журнал неврологии и психиатрии,- 2003,- Т. 100,-С.37- 39.
5. Торяник И.И. Микроскопические признаки как доказательный инструмент в фактах формирования и развития моделированного ишемического инсульта в эксперименте /И.И. Торяник, В.В. Колесник // Вюник проблем бюлоги та медицини,- 2010,-№2,-С. 174- 178.
6. Bolander Н. Regional cerebral blood flow and histopathologic changes after middle cerebral artery occlusion in rats / H. Bolander, L. Persson, L. Hillered fetal.] // Stroke.- 1989.-№ 20.-P. 930- 937.
7. Durukan A. Ischemic Stroke in Mace and Rats / A.Durukan, T. Tatlisumak //Springer protocols.- 2009,- V. 573,- P. 95-114.
8. Kang S. Improvement of neurological deficits by intracerebral transplantation of human adipose tissue - derived stromal cells after cerebral ischemia in rats/ S. Kang, D. Lee, Y. Bae [et.al.] //Experemantal Neurology.- 2003,- V. 183,- P. 355 -366.
9. Kennedy R. Lees. Stroke: success for acute treatment / Lees R. Kennedy//The Lancet Neurology. - 2009. - №. 8(1).- P. 2-4.
10. Lenzser G. Diazoxide preconditioning attenuates global cerebral ischemia -induced blood - brain barrier permeability / [G.Lenzser,
Лктуи.п.н i проблемы сучасно!" медицины
14. Taguchi Y. Morphological changes in capillaries in the ischemic brain in Wistar rats / Y. Taguchi, S. Takashima, E. Sasahara [et.al.] // Archives of Histology and Cytology.- 2004,- V. 67, № 3,- P. 253-261.
15. Tyson G. Focal cerebral ischemia in the rat: topography of hemodynamic and histopathological change / [G.Tyson, G. Teasdale, D. Graham, J. McCulloch] //Annalls of Neurology.- 1984,-№ 15.-P. 559-567.
16. Wahtgren N. Thrombolisis with alteplase for acute ischemic stroke in the Safe implementation of Thrombolisis in Stroke- Monitoring Study (SITS-MOST): an observational study // N. Wahtgren, N. Ahmed, A. Davalos // The Lancet Neurology. - 2007. - № 369,- P. 275.
Реферат
УН1Ф1КОВАНИЙ П1ДХ1Д ДО СТВОРЕННЯ МОДЕЛ1 1ШЕМ1ЧНОГО ИНСУЛЬТУ ГОЛОВНОГО МОЗКУ в ЕКСПЕРИМЕНТ1 НА ЩУРАХ Л1НИ ВIСТАР Торяник I.I., Колесник В.В.
Ключов1 слова: модель ¡шем1чного ¡нсульту, щури лши Вютар, загальна сонна артер1я, л1гатура, ембол1зац1я колатерального кровотоку, ¡нфаркти головного мозку, розлади поведшки та невролопчного статусу.
У статп представлений ушфкований шдхщ до створення модел1 ¡шем1чного ¡нсульту в експеримент1 на щурах лши Вютар. Матер1алом дослщження стали ¡мбреды самц1 у в!ц! 3-х мюяц1в, вагою 160- 175 г, у ктькосп 45 особин (п= 45). Мета дослщу досягалася шляхом ембол1заци колатеральних судин ча-стками сульфату бар1я (125 мг/кг), що надавало гарантоване вимкнення мапстрального та коллатерального кровооб1гу вщповщноТ гемюфери головного мозку та стандарты ураження головного мозку, схож1 ¡з тими, що виникали у людини у pa3i розвитку традицшноТ юмшчноТ патологи. Результати оцшю-вали за характером виявлених морфолопчних змш (гпюзи, ¡нфаркти, деструктивно- дегенеративш змши судин); порушень поведшковоТ сфери та невролопчного статусу (тривожнють, розлютованнють, агресивн1сть, амнестичы розлади, загальмованють, торшднють у спткуванш ¡з ствродинниками). Ре-зюмуючи досягнуте, вщм1тимо ефективнють проведеного експерименту та оптим1стичн1 перпективи застосування екстраполятивних даних у якосп фундаменту для подальшоТ апробацП' новаторських метод1в оперативно'!' ¡нтервенцП' ¡шем1чного ¡нсульту.
Summary
UNIFIED APPROACH IN CREATION OF CEREBRAL ISCHEMIC STROKE MODEL IN WISTAR RATS Torianik I. I., Kolesnik V. V.
Key words: ischemic stroke model, Wistar rats, male, common carotid artery, ligature, embolization of collateral blood microcirculation, cerebral infarcts, behavioral and neurological status disorders.
The unified approach to the creation of the ischemic stroke model in Wistar rats is presented in the article. The experimental material is Wistar male rats aged 3 months (n= 45), weight 160-175 g. The purpose is to achieve by embolization of collateral blood vessels with sulfate barium suspension (125 mg/kg), which provided assured defunctionalizing of basic and collateral blood circulation of the corresponding cerebral hemisphere and standard cerebral damages similar to those developing in humans in a case of the development of conventional clinic pathology. The results are evaluated to character of the morphological changes (gliosis, infarcts, blood vessels destructive and degenerative alterations); behavioral and neurological disorders (anxiety, furiosity, aggression, amnestic disorders, torpidity in contact). It should be stresses that the effectiveness of the experiment and promising perspective of the findings may be a basis the further development of new methods of the ischemic insult (stroke) surgical intervention.
B.Kis, F. Bari, D. Busija] //Brain Resaerches.- 2005,- V. 1051,- P. 72 - 80.
11. Memezawa H. Penumbral tissues salvaged by reperfusion following middle cerebral artery occlusion in rats /H. Memezawa, M. Smith, B. Siesjo // Stroke-1992.-№23.-P. 552- 559.
12. Nagasawa H. Correlation between cerebral blood flow and histologic changes in a new rat model of middle cerebral artery occlusion /H. Nagasawa, K. Kogure // Stroke.- 1989.-№ 20,-P.1037- 1043.
13. Paxinos G. The rat brain in stereotaxic coordinates /G. Paxinos, Ch. Watson //N.Y. Academic Press.- 1998,- 474 p.
