CC BY
93
УДК: 611.36-018.1+1616.36-018.1-06:616.379-008.64-039.361-019-08
УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ПЕЧЕНИ КРЫС В НОРМЕ И ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ НА ПОЗДНИХ ЭТАПАХ ПРОТЕКАНИЯ
Введение. Известно, что характерной чертой сахарного диабета (СД) 2 типа является повышенная продукция глюкозы печенью в результате угнетения гликолиза и усиление глюконео-генеза. Именно эти процессы ответственны за гипергликемию у больных СД 2 типа натощак. В то же время рост концентрации глюкозы в крови после приема пищи (постпрандиальной гликемии) связан с торможением утилизации глюкозы периферическими тканями, в первую очередь мышцами [і]. Это обусловлено нарушением синтеза гликогена в результате снижения активности гли-когенсинтетазы и ослабление процессов окисления глюкозы вследствие дефекта в пируватдегид-рогеназном комплексе. Кроме того, нарушения секреторной функции панкреатических бета-клеток, что проявляется в торможении первой фазы инсулинового ответа, также вносит свой вклад в развитие гипергликемии как натощак, так и после приема пищи [2, з].
Целью исследования было изучение сравнительной характеристики ультраструктуры печени в норме и при экспериментальном сахарном диабете на поздних этапах его протекания.
Методы. Забор и подготовка материала для электронной микроскопии проводили на половозрелых крысах - самцах массой юо - 130г линии "Вистар". Перед забором материала подопытное животное усыпляли внутрибрюшинным наркозом с использованием тиопентала (из расчета 25мг/кг). С помощью лезвия отрезали небольшую часть ткани печени крыс, которую помещали сразу в большую каплю 2% раствора четырехокиси осмия на 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,36) с сахарозой. После этого, обезжиренным в ацетоне лезвием вырезали полоски ткани печени размером 0,8 х од х од см и быстро переносили их в другую каплю фиксирующего раствора, размещенного на кусочке зубоврачебного воска ледяной плиты. Из полосок вырезали блоки ткани печени кубической формы размером 1 ммз. Тканевые блоки фиксировали 2% раствором четырехокиси осмия на од М фосфатном буфере (pH 7,36) с добавлением сахарозы в течение 2 ч на ледяной бане. После этого их отмывали буферным раствором данного состава (4 свежие порции по 15 минут в каждой) [4]. Для дегидратации и подготовки к пропитке, водонерастворимые смолами и отмытые от остатков фиксаторов тканевые блоки, проводили через спирты восходящей концентрации и абсолютный ацетон. Схема проведения в растворах этилового спирта: 40% - три свежие порции по ю минут, 70% - три свежие порции по ю минут, 96% - две свежие порции по 20 минут. Схема проведения в ацетоне: ацетон марки "особо чистый" -шесть свежих порций по 15 минут. Затем материал помещали в смесь эпоксидных смол эпон-аралдит. Состав водонерастворимых заливных смол содержал эпон 812- 5мл, аралдит М- змл, БОБА-пмл, дибутилфталат-о, 4мл, ДМП - зо-15крапель [5]. Тканевые блоки помещали в эпон-аралдит путем проведения через растворы возрастающей концентрации (схема проведения: смесь ацетона и смолы в соотношении 3:1 - одна свежая порция на два часа; смесь ацетона и смолы в соотношении 1:1 - одна свежая порция на два часа; смесь ацетона и смолы в соотношении 3:1 - одна свежая порция на два часа; чистая смола - одна свежая порция на двенадцать часов при комнатной температуре). Для лучшей пропитки материал вместе со смесью смола -ацетон ставили в гнезда електровертушки [6]. Затем блоки помещали в эпон-аралдит, находившийся в глицериновых капсулах. Полимеризацию материала проводили поэтапно при разных
1} Львовский национальный государственный университет имени Данила Галицкого, г. Львов, Украина
ж> Белгородский государственный национальный исследовательский университет
Ю.Р.СОГУЙКО1 Ю.Я КРИВКО1 Е.Н. КРИКУН2
В работе изучена ультраструктурная характеристика печени крысы в норме и при экспериментальном сахарном диабете на поздних этапах протекания. Проведен забор материала с целью исследования и описание печени на ультрамикроскопическом уровне. Определено расположение структурных элементов печени, их форма и размер в норме и при диабете. Констатировано, что при сахарном диабете в печени крыс происходят изменения во всех структурных компонентах по сравнению с нормой. Полученные результаты в дальнейшем станут базой для сравнения с данными изменений печени при сахарном диабете в практической медицине.
e-mail: krikun@bsu.edu.ru
Ключевые слова: сахарный диабет, ультрамикроско-пня, печень, стрептозотоцин, крыса.
температурах - 36, 45 и 6о С° в течение 24 часов. Ультратонкие срезы готовили на ультрамикротоме УМТП - 3М с помощью стеклянных ножей, изготовленных на приборе ССН - 1. Для исследования отбирали срезы серебристого или нежно-лимонного цвета. Срезы контрастировали сначала в 2 % - растворе уранилацетата [7], а затем - цитрата свинца [8]. Изучение и фотографирование материала проводили с помощью микроскопа УЕМВ - юоК (Украина) при ускоряющем напряжении 75 кВ и увеличении на экране микроскопа 2000х - 124000Х.
Результаты. У интактных крыс печеночные пластинки построены из гепатоцитов, которые объединены с помощью плотных контактов и образуют желчные канальцы. При ультра-структурном исследовании в цитоплазме гепатоцитов оказываются хорошо выражены канальцы эндоплазматической сети как гранулярной, так и агранулярной, многочисленные лизосомы и пероксисомы, цистерны комплекса Гольджи, расположенные в различных отделах клеток. Митохондрии имеют сферическую или овальную форму от 0,8 до 2 мкм в диаметре, небольшую численность крист и электронноплотный матрикс в котором расположены митохондриальные гранулы. В цитоплазме гепатоцитов находятся включения гликогена и липидов. Гранулы гликогена местами образуют агрегаты в виде розеток, тогда как липидные гранулы имеют вариа-бельнную электронную плотность и не окружены мембранами. Ядра, как правило, расположены в центре гепатоцитов и имеют овальную или сферическую форму, хроматин в них просветленный. В ядрах оказываются 1-2 ядрышка, имеющих широкопетлистую ретикулярную структуру (рис.1). Эндотелиоциты отделяли пространства синусоидов от пиресинусоидальних пространств и имели продолговатую форму, их ядра расположены в центре. Вокруг полюсов ядра находится компактная зона органелл с цистернами комплекса Гольджи, канальцами агранулярной и гранулярной эндоплазматической сети и многочисленными митохондриями. Наибольшую протяженность имеет периферийная зона, в которой расположены немногочисленные ор-ганеллы, она изящна и имеет многочисленные плазмолемные везикулы, среди которых различают связанные с базальной и адлюменальной поверхностьями плазмолемы. В периферийной части эндотелиоцитов расположены фенестры, не затянутые диафрагмами. В месте контактов эндотелиоциты имеют многочисленные отростки, благодаря которым образуются ситообраз-ные зоны в стенке синусоидов. Базальная мембрана вокруг эндотелиальных клеток не образует сплошного слоя. Как правило, ее фрагменты выявляются вокруг периферической зоны эндотелиоцитов. В просветах синусоидов и между эндотелиоцитами расположены звездчатые макро-фагоцити. Они имеют многочисленные псевдоподии и складки мембраны. Их ядра бобообраз-ной формы. Вблизи вогнутой поверхности ядра, находятся цистерны комплекса Гольджи и многочисленные лизосомы. В просветах синусоидов обнаруживаются печеночные клетки-убийцы. Они имеют сферическую форму, электронноплотные ядра и своими отростками фиксировались к плазмолемме эндотелиоцитов. Их цитоплазма содержала гранулы с электронноплотным центром, а также пено-и фагоцитарные пузырьки. При ультраструктурном исследовании портальных триад обнаруживаются междольковые артерии, вены, желчные протоки, а также лимфатические сосуды. Стенка междольковых артерий состоит из трех оболочек. Во внутренней оболочке находится сплошной пласт эндотелиальных клеток, расположенных на базальной мембране. В подендотелиальном слое расположены малодифференцированные клетки, эластичные и коллагеновые волокна. В междольковых артериях хорошо выражена внутренняя эластическая мембрана. Средняя оболочка включает 1-2 слоя гладких миоцитов. Внешняя оболочка состоит из адвентициальних клеток. Вокруг артерий расположены фибробласты, коллагеновые и эластичные волокна. В просветах междольковых вен иногда оказываются моноциты и лимфоциты. В средней оболочке гладкие миоциты не образуют сплошного слоя. Внешняя оболочка состоит из рыхлой соединительной ткани. В их периваскулярном пространстве расположены фибробласты, коллагеновые и эластичные волокна, а также одиночные лимфоциты. Стенка междольковых желчных протоков состоит из кубических клеток с электронно светлой цитоплазмой и ядрами , расположенными в центре. Вокруг желчных протоков находятся фибробласты, коллагеновые и эластичные волокна, а также единичные лимфоциты (рис. 2).
Через 8 недель развития экспериментального СД нами отмечено увеличение численности и размеров жировых включений в цитоплазме гепатоцитов и уменьшение включений гликогена. Возрастает число митохондрий со сплошной внешней мембраной и увеличивается гетерогенность в структуре ядер. При этом встречаются сферические ядра со структурой хроматина и ядрышек подобных интактным животным, но с увеличенной численностью гиперхромных ядер и конденсированным по краям хроматином. Перинуклеарные пространства вокруг таких ядер значительно расширены. Обнаруживались гепатоциты с пикнотическими ядрами, которые имели причудливую форму. Межклеточные пространства гепатоцитов видоизменены и расширены, в них выявляются коллагеновые фибриллы и фибробласты. Пересинусоидальные пространства расширены, заполнены коллагеновыми волокнами, среди которых обнаруживали многочисленные фибробласты, звездчатые макрофагоцити и редко пересинусоидальные жиро-
накопительные клетки, в цитоплазме которых находились гигантские удлиненные митохондрии червеобразной формы с многочисленными плотноупакованними кристами (рис. 3).
Диаметри синусоидов сужены, часто встречается сладж эритроцитов, а также многочисленные звездчатые макрофагоциты и тромбоциты, которые контактируют с плазмолемой эндо-телиоцитов. Эндотелиоциты в периферийной зоне утолщены. Их цитоплазма имела неоднородную электронную плотность, где содержались темные и светлые клетки, вакуоли, канальцы ЭПС, а также расширенные комплексы Гольджи и полиморфные митохондрии. Часто обнаруживались просветленные митохондрии с деструктурированными кристами. Плазмолемальных везикул в таких клетках было мало по сравнению с интактной группой животных. Ядра в эндо-телиоцитах часто отечны, осмиофильные. Вокруг эндотелиоцитов обнаруживается базальная мембрана (рис. 4). В портальных трактах - выраженный склероз. Стенки артериол утолщены, эндотелиальная выстилка в них не сплошная. В средней оболочке наблюдаются процессы гипертрофии и гиперплазии гладких миоцитов. Стенка вен склерозирована и утолщена с наличием деструктивных фибробластов. Пространство желчных протоков расширено и заполнено остатками эпителиоцитов. Вокруг желчных протоков наблюдается гистиолимфоцитарная инфильтрация, расширение диаметров лимфатических сосудов и отечными эндотелиоцитами.
Через 10 недель эксперимента, наряду с вышеуказанными изменениями, отмечается увеличение числа деструкторизированых митохондрий и крупных жировых включений в гепа-тоцитах с уменьшением в них содержания гликогена (рис.5). При этом возрастает количество пикнотичных и формализованных ядер в гепатоцитах, расширяются их межклеточные и пере-синусоидальные пространства и просветы в желчных капиллярах. Обнаруживаются разрастания коллагеновых волокон с гипертрофией и гиперплазией фибробластов. Возрастает численность снежных макрофагоцитов, суживаются синусоидальные капилляры и уменьшается численность пересинусоидальних жиронакопительных клеток. В них часто обнаруживается сладж эритроцитов и лейкоцитов. Эндотелиальные клетки в стенке синусоидных капилляров полиморфны. Их цитоплазма неоднородна с малым количеством органелл и деструкторизироваными митохондриями. Ядра часто выступают в просвет синусоидов, в них наблюдается маргинальная агрегация хроматина, ядрышки не определяются.. Вокруг зоны органелл часто образуется базальная мембрана в отличие от интактной группы животных (рис.6). В портальных трактах наблюдается склероз и гиперплазия фибробластов. При этом стенки междольковых артерий утолщены и склерозированы, в их просветах часто появляются пристеночные тромбы. Диаметри междольковых желчных протоков расширены, их стенки утолщены, лимфатические сосуды расширены.
Выводы. Таким образом на поздних этапах развития экспериментального СД происходят изменения в артериолах, характеризующиеся деструкцией эндотелиоцитов, гипертрофией и гиперплазией гладких миоцитов, сужением просвета и гиперплазией фибробластов в наружной оболочке артериол, а также гиперемией центральных и междольковых вен. В синусоидах, наряду с деструктивными изменениями в эндотелиоцитах, происходят процессы активации и увеличение численности макрофагоцитов и их миграция в пересинусоидальные пространства, что приводит к трансформации жиронакопительных клеток в фибробласты и разрастанию коллагеновых волокон. Расширение пересуносоидальних пространств приводит к утолщению барьера между кровью и гепатоцитами с нарушением обмена веществ.
Литература
1. Joslin’s diabetes mellitus. - 14 ed. / EditedЪу C. R. Kahn, G.C. Weir, G.L. King et al. - Lippincott, Wil-liains&Wilkins, 2006.-328p.
2. Zierath J. R. Insulin action and insulin resistance in human skeletal muscle / J.R. Zierath, A. Krook, H. Wallberg-Henriksson // Diabetologia. - 2000. - Vol. 43, № 7. - P. 821-835.
4. Kahn S.E. The relative contributions of insulin resistance and be La-ce 11 dysfunction to the pathophysiology of Type 2 diabetes / S.E. Kahn // Diabetologia. - 2003. - Vol. 46, № 1. - P. 3-20.
5. Кривко Ю.Я. Ультраструктурні зміни ендотеліоцитів і міозитів в стінці артеріол сідничного нерва щурів з стрептозотоциніндукованою діабетичною нейропатією і їх корекція нікотинамідом / Ю.Я. Кривко // Вісник морфології. - 2003. - Е.9, №9. - С. 255-257.
6. Glauert A. Fixation, dehydration and embedding of biological specimens //A. Glauert / / Practical methods in electron microscopy. - Nort-Hollond:American Elsevier, 1975. - 207 p.
7. Соїуйко Ю.Р. Ультраструктурні особливості печінки щура в нормі та експериментальному цукровому діабеті на ранніх етапах перебігу в динаміці / Ю.Р. Согуйко, Ю.Я. Кривко // Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія. - 2010, №4. - С. 12-19.
8. Stempac J.G. An improved staining method for electron microscopy / J.G. Stempac, R.T. Ward // J. Cell Biol. - 1964. - Vol.22. - P.697-701.
9. Reynolds E.S. The of lead at high pH as an electmopague stain in electron microscopy / E.S. Reynolds // J. Cell. Biol. - 1963. - Vol. 17. - P.208-212.
UITRASTRUCTURAI CHARACTERISTICS OF RAT'S LIVER IN NORM AND IN EXPERIMENTAL DIARETES MELLITOS ON LATE TERMS OF RON
Yu.R. SOGUJKO1 Yll.Ya. KRIVKO1 E.N. KRIKIIN2
1 Danylo H alyl sky Lviv National Medical University, Lviv, Ukraine
-Belgorod National Research University
We studied the ultrastructural characteristics of rat’s liver in norm and in experimental diabetes mellitus on late terms of run. We described the investigation of livers electronomicroscopy. We determined the place of liver’s structural elements, their form and size in norm and in diabetes. We found out the changes of all structural components in rat’s liver in diabetes mellitus comparing with the norm liver. The results of this investigation will become the base for comparison of change dynamics in diabetes mellitus liver in practical medi-
e-mail: krikun@bsu.edu.ru
Keywords: diabetes mellitus, ultramicroscopy, liver, streptozotocin, rat.
