CC BY
29
DOI: 10.24411/2226-0757-2019-12125
Ультраструктурные корреляты деструктивных и репаративных процессов в культуре клеток-зерен мозжечка при глутаматной нейротоксичности
Л.Е. Фрумкина, А.А. Лыжин, Л.Г. Хаспеков
Одной из актуальных задач современной неврологии является исследование механизмов повреждения и восстановления нейронов мозга при острых и хронических формах церебральной патологии. Целью работы было исследование ультраструктурных коррелятов компенсаторно-восстановительных процессов в культуре клеток мозжечка, подвергнутых цитотоксическому действию глутамата. Культуры зернистых нейронов мозжечка 7-дневных крыс на 7-й день in vitro инкубировали в течение 15 мин в присутствии 50 мкМ глутамата, после чего одну группу культур фиксировали сразу после воздействия глутамата, а другую - в постглутаматный период (через 3 ч после инкубации в питательной среде в отсутствие глутамата). Затем все культуры обрабатывали для электронно-микроскопического исследования. В нейронах, фиксированных сразу после глутаматного воздействия, наблюдались как гидропические изменения (по "светлому" типу), так и гиперхроматоз (по "темному" типу). Через 3 ч постглутаматного периода в нейронах обоих типов обнаруживались признаки компенсаторно-восстановительных процессов: активация белоксинтезирующей системы, формирование розеток полисом, появление почкующихся и гигантских митохондрий, тесные контакты цитоплазмати-ческих органелл с ядром, скопления гетерохроматина вдоль внутренней ядерной мембраны и др. В постглутаматный период в культивированных нейронах происходят выраженные компенсаторно-восстановительные перестройки ультраструктуры, направленные на поддержание жизнедеятельности после эксайтотоксического воздействия.
Ключевые слова: культивированные нейроны, глутамат, эксайтотоксичность, ультраструктура, компенсаторно-восстановительные процессы.
Введение
Одной из актуальных задач современной неврологии является исследование механизмов повреждения и восстановления нейронов мозга при острых и хронических формах церебральной патологии. Известно, что одним из важных патогенетических факторов при ишемическом инсульте, травме мозга, эпилепсии, паркинсонизме и ряде других нейродегенеративных заболеваний служит гиперактивация постсинаптических рецепторов возбуждающего нейромедиатора глутамата. Возникающее при этом избыточное возрастание внутриклеточной концентрации ионов кальция запускает каскад цитотоксических реакций, приводящих к глубоким морфофункциональным нарушениям митохондрий, эндоплазматического ретикулума и других органелл (в том числе ядра) и, наконец, к гибели нейронов [1-3]. Экспериментальное исследование ультраструктурных коррелятов нейродеструктивных и компенсаторно-восстановительных процессов расширяет перспективу поиска способов их фармакологической коррекции с использованием нейропротекторных соединений, которые могут
Отдел исследований мозга ФГБНУ "Научный центр неврологии", Москва.
Лидия Ефимовна Фрумкина - канд. биол. наук, вед. науч. сотр.
Анатолий Александрович Лыжин - канд. биол. наук, ст. науч. сотр.
Леонид Георгиевич Хаспеков - докт. биол. наук, зав. лабораторией экспериментальной нейроцитологии. Контактная информация: Хаспеков Леонид Георгиевич, khaspekleon@mail.ru
препятствовать морфофункциональному повреждению нейронов и способствовать его обратимости [4, 5]. Одним из методических подходов к этому исследованию является использование культуры нервных клеток в моделировании цитотоксического действия глутамата как одного из основных патогенетических факторов деструкции нейронов при указанных формах церебральной патологии.
Материал и методы
Культуры клеток-зерен мозжечка получали по опубликованной ранее методике [6]. На 7-й день культуры in vitro на 15 мин переносили из питательной среды в сбалансированный солевой раствор (ССР), содержащий 50 мкМ глутамата. Затем 1-ю группу культур фиксировали в 2,5% растворе глутаральдегида, а 2-ю группу возвращали на 3 ч в исходную питательную среду, после чего также фиксировали. Контролем для 1-й группы служили культуры, фиксированные сразу после инкубации в течение 15 мин в ССР без глутамата, для 2-й - фиксированные после 15-минутной инкубации в ССР без глутамата и 3-часовой инкубации в исходной питательной среде. Для ультраструктурного исследования все культуры, фиксированные в растворе глутаральдегида, постфиксировали в 1% растворе тетра-оксида осмия и заключали в эпон. Ультратонкие срезы контрастировали в уранилацетате и цитрате свинца и исследовали в электронном микроскопе Hitachi.
Результаты и обсуждение
В контрольных культурах обеих групп выраженных изменений ультраструктуры нейронов не наблюдалось (дан-
Рис. 1. Ультраструктура клеток-зерен мозжечка в диссоциированной культуре (7 дней in vitro) сразу после 15-минутного действия глутамата: а - наряду с нормохромными интактными нейронами с неизменной ультраструктурой (1) в тесном контакте с ними виден нейрон в стадии набухания (2) с тотальным хроматолизом и отсутствием цитоплазма-тических органелл; б - погибший нейрон ("клетка-тень") в окружении глиальных клеток (Гл) как признак нейронофа-гии; в - нейрон светлого типа в стадии отека-набухания. Видны локальные расширения между мембранами, окружающими ядро (Я), набухание цистерн гранулярного эн-доплазматического ретикулума (ГЭР), митохондрий (МХ) и элементов комплекса Гольджи (КГ); г - умеренно гипер-хромные нейроны с гомогенизацией и появлением клам-пированного хроматина в ядре, дезагрегацией полисом. Масштаб: а, б - 5 мкм; в - 2 мкм; г - 10 мкм.
(а) q
q
ГЭР - ^^
м
(в)
Рис. 2. Ультраструктура клеток-зерен мозжечка в диссоциированной культуре (7 дней in vitro) через 3 ч после 15-минутного действия глутамата: а, б - репаративные процессы в светлых нейронах с признаками отека-набухания: формирование цистерн ГЭР из наружной ядерной мембраны, гиперплазия митохондрий (МХ) (а) и локальное скопление цитоплазматических органелл и их контакт друг с другом и с ядром (Я) (б); в, г - пластическая реорганизация ультраструктуры гиперхромных нейронов: двуядерный нейрон с гиперплазией элементов КГ (в) и гипертрофия митохондрий (МХ) и их тесный контакт с ядром (Я) (г). Масштаб 2 мкм.
ные не представлены). Сразу после глутаматного воздействия для небольшой части нейронов характерными являлись тотальный хроматолиз и набухание цитоплазмы, пикноз ядра и отсутствие других цитоплазматических органелл (рис. 1а). Подобные изменения несовместимы с жизнедеятельностью клеток и поэтому могут приводить к их трансформации в погибшие "клетки-тени", окруженные глиальными элементами (рис. 1б), что является признаком нейронофагии [7].
Для большинства нейронов наиболее характерными были либо гидропические изменения по "светлому" типу, либо гиперхроматоз (изменения по "темному" типу). Характерным признаком ультраструктуры "светлых" нейронов, находящихся в стадии набухания, является просветление ядра и цитоплазмы (рис. 1в). Эти клетки содержат отдельные скопления хроматина в кариоплазме и вблизи внутренней ядерной оболочки, а пространства между мембранами, окружающими просветленное ядро, локально расширены. В цитоплазме таких нейронов резко уменьшено число полисом, компоненты комплекса Гольджи (КГ) и цистерны гранулярного эндоплазматического ретикулума (ГЭР) расширены, митохондрии конденсированы и содержат баллоновид-ные выбухания. Следует отметить, что ранее другой группой авторов также были выявлены характерные патоморфоло-гические изменения ультраструктуры митохондрий, сопровождавшиеся снижением митохондриального потенциала, при глюкозной депривации и эксайтотоксическом действии глутамата в культуре зернистых нейронов мозжечка [8-11].
Характерной особенностью ультраструктуры гипер-хромных нейронов было наличие ядра удлиненной формы, извитой ядерной оболочки, гомогенного ядерного гете-рохроматина и плотного, небольшого размера ядрышка (рис. 1г). На фоне потемнения и дезагрегации полисом их розетки неразличимы. В цитоплазме содержатся многочисленные мелкие конденсированные митохондрии, набухшие везикулярные компоненты КГ и очень узкие цистерны ГЭР, а в отдельных клетках видны мелкоточечные электронно-плотные кальциевые депозиты.
Через 3 ч после окончания действия глутамата в нейронах, измененных как по "светлому", так и по "темному" типу, обнаруживаются ультраструктурные признаки компенса-торно-репаративных процессов (рис. 2).
В светлых нейронах, выходящих из стадии отека-набухания, происходит восстановление белоксинтезирую-щей системы, о чем свидетельствует образование ге-терохроматина в ядре и его локализация на внутренней ядерной мембране в зоне тесного контакта с цистернами ГЭР, которые образуются из наружной ядерной мембраны (см. рис. 2а). В цитоплазме формируются розетки полисом и содержатся разветвленные и/или почкующиеся митохондрии, а цитоплазматические органеллы проявляют тенденцию к скапливанию и контактированию между собой и с ядром (см. рис. 2б), что также является признаком репа-ративной реорганизации [12-14].
Среди гиперхромных нейронов обнаруживаются дву-ядерные клетки (см. рис. 2в), а также нейроны с многолопастными ядрами, складчатостью ядерной оболочки, инвагинациями с захватом цитоплазматических органелл, скоплениями гетерохроматина вдоль внутренней ядерной мембраны. В цитоплазме появляются гигантские митохондрии, локализованные вдоль ядра и контактирующие с ним и с другими органеллами, а также происходит гиперплазия элементов КГ (см. рис. 2г). Эти изменения указывают на активацию компенсаторных гиперпластических и метаболических процессов и усиление ядерно-цитоплазматических взаимоотношений. Контакты митохондрий с ядром, между собой и с другими органеллами могут обеспечивать их синхронное функционирование, направленное на активацию синтеза и транспорта энергии [15-17].
Заключение
Полученные данные свидетельствуют о том, что в пост-глутаматный период в нейронах происходят выраженные ультраструктурные перестройки, в результате которых сохранившиеся клетки для поддержания жизнедеятельности дают "компенсаторно-пластический" ответ [18, 19]. В то же время часть нейронов с гидропическими изменениями ультраструктуры уже сразу после действия глутамата переходят в стадию необратимой дистрофии (тотальный хроматолиз, "клетки-тени"). Таким образом, экспериментальное моделирование нейродеструктивных и репаративных процессов in vitro способствует раскрытию механизмов и поиску способов фармакологической коррекции этих процессов при острых и хронических формах церебральной патологии, связанных с цитотоксическим действием глутамата.
Список литературы
1. Amantea D, Bagetta G. Excitatory and inhibitory amino acid neurotransmitters in stroke: from neurotoxicity to ischemic tolerance. Current Opinion in Pharmacology 2017 Aug;35:111-9.
2. Velasco M, Rojas-Quintero J, Chavez-Castillo M, Rojas M, Bautista J, Martinez MS, Salazar J, Mendoza R, Bermudez V. Excitotox-icity: an organized crime at the cellular level. Journal of Neurology and Neuroscience 2017 Jun;8(3):193.
3. Puig B, Brenna S, Magnus T. Molecular communication of a dying neuron in stroke. International Journal of Molecular Sciences 2018 Sep;19(9). pii: E2834. doi: 10.3390/ijms19092834.
4. Lai TW, Zhang S, Wang YT. Excitotoxicity and stroke: identifying novel targets for neuroprotection. Progress in Neurobiology 2014 Apr;115:157-88.
5. Cramer SC. Treatments to promote neural repair after stroke. Journal of Stroke 2018 Jan;20(1):57-70.
6. Andreeva N, Khodorov B, Stelmashook E, Cragoe E Jr, Victorov I. Inhibition of Na+/Ca2+ exchange enhances delayed neuronal death elicited by glutamate in cerebellar granule cell cultures. Brain Research 1991 May;548(1-2):322-5.
7. Ito U, Nagasao J, Kawakami E, Oyanagi K. Fate of disseminated dead neurons in the cortical ischemic penumbra: ultrastructure indicating a novel scavenger mechanism of microglia and astrocytes. Stroke 2007 Sep;38(9):2577-83.
8. Исаев Н.К., Узбеков Р.Э., Зоров Д.Б., Стельмашук Е.В., Викторов И.В. Токсическое воздействие глутамата вызывает повреждение митохондрий в клетках-зернах диссоциированных культур мозжечка крыс. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 1995;119:378-80.
9. Isaev NK, Zorov DB, Stelmashook EV, Uzbekov RE, Kozhemyak-in MB, Victorov IV. Neurotoxic glutamate treatment of cultured cerebellar granule cells induces Ca2+-dependent collapse of mitochondrial membrane potential and ultrastructural alterations of mitochondria. FEBS Letters 1996 Aug;392(2):143-7.
10. Исаев Н.К., Андреева Н.А., Стельмашук Е.В., Зоров Д.Б. Роль митохондрий в механизмах токсического действия глутамата. Биохимия 2005;70(6):741-50.
11. Stelmashook EV, Isaev NK, Plotnikov EY Uzbekov RE, Alieva IB, Arbeille B, Zorov DB. Effect of transitory glucose deprivation on mi-tochondrial structure and functions in cultured cerebellar granule neurons. Neuroscience Letters 2009 Sep;461(2):140-4.
12. Hajos F, Garthwaite G, Garthwaite J. Reversible and irreversible neuronal damage caused by excitatory amino acid analogues in rat cerebellar slices. Neuroscience 1986 Jun;18(2):417-36.
13. Markus TM, Tsai SY, Bollnow MR, Farrer RG, O'Brien TE, Kindler-Baumann DR, Rausch M, Rudin M, Wiessner C, Mir AK, Schwab ME, Kartje GL. Recovery and brain reorganization after stroke in adult and aged rats. Annals of Neurology 2005 Dec;58(6):950-3.
14. le Feber J, Tzafi Pavlidou S, Erkamp N, van Putten MJ, Hofmeijer J. Progression of neuronal damage in an in vitro model of the ischemic penumbra. PLoS One 2016 Feb;11(2):e0147231.
15. Galganska H, Karachitos A, Wojtkowska M, Stobienia O, Budzin-ska M, Kmita H. Communication between mitochondria and nucleus: putative role for VDAC in reduction/oxidation mechanism. Biochimica et Biophysica Acta 2010 Jun-Jul;1797(6-7):1276-80.
16. Kotiadis VN, Duchen MR, Osellame LD. Mitochondrial quality control and communications with the nucleus are important in maintaining mitochondrial function and cell health. Biochimica et Bio-physica Acta 2014 Apr;1840(4):1254-65.
17. Cardamone MD, Tanasa B, Cederquist CT, Huang J, Mahdaviani K, Li W, Rosenfeld MG, Liesa M, Perissi V. Mitochondrial retrograde signaling in mammals is mediated by the transcriptional cofactor GPS2 via direct mitochondria-to-nucleus translocation. Molecular Cell 2018 Mar;69(5):757-72.e7.
18. Depner M, Tziridis K, Hess A, Schulze H. Sensory cortex lesion triggers compensatory neuronal plasticity. BMC Neuroscience 2014 May;15:57.
19. Lazzouni L, Lepore F. Compensatory plasticity: time matters. Frontiers in Human Neuroscience 2014 Jun;8:340.
Ultrastructural Correlates of Destructive and Reparative Processes in Cerebellar Granule Cell Cultures Subjected to Glutamate Neurotoxicity
L.E. Frumkina, A.A. Lyzhin, and L.G. Khaspekov Studying mechanisms of neuronal damage and repair in acute and chronic cerebral pathology is one of the pressing issues in modern neurology. The aim of the work was to study the ultrastructural correlates of compensatory restoration processes in the culture of cerebellar cells subjected to glutamate cytotoxic effect. Cultures of cerebellar granule neurons of 7-day-old rats on day 7 in vitro were incubated with 50 |M glutamate for 15 min. Then one group of cultures was fixed immediately after glutamate exposure and the other during the post-glutamate period (3 h after incubation in nutrient medium without glutamate). All cultures were processed for electron microscopy. In neurons fixed immediately after glutamate exposure, both hydropic changes ("light" type) and hyperchromatosis ("dark" type) were observed. After a postglutamate period of 3 h, signs of compensatory recovery were detected in neurons of both types: protein-synthesizing system activation, formation of polysome rosettes, appearance of budding and giant mitochondria, close contact of cytoplasmic organelles with the nucleus, heterochromatin clustering along the inner nuclear membrane, etc. In the postglutamate period cultured neurons show compensatory recovery rearrangements in their ultrastructure, aimed at maintaining viability after the excitotoxic exposure.
Key words: cultured neurons, glutamate, excitotoxicity, ultrastructure, compensatory recovery processes.
