CC BY
91
ШИШ 111Н111!П[И!1111!11!]П1Н1И1И1ИИ11Ш!11ШШ!11Ш111Ш1!11]П
2004
МОРФОЛОГИЯ, ФИЗИОЛОГИЯ,
ПАТОЛОГИЯ
УДК 616-018.822-097:599.3:616.45-001.1/.3-091
УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЕ И ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ
ИЗМЕНЕНИЯ МИЕЛИНОВЫХ ВОЛОКОН И ОЛИГОДЕНДРОЦИТОВ ГИГАНТОКЛЕТОЧНОГО ЯДРА РАСТУЩИХ КРЫСЯТ ПОД ВЛИЯНИЕМ ОСТРОГО СТРЕССА
П.А. Хлопонин, В.Б. Писарев, А.В. Смирнов, А.Я. Почепцов
Отдел общей и экспериментальной патологии ВНЦ РАМН и Администрации Волгоградской области, кафедра гистологии, эмбриологии и цитологии Ростовского государственного медицинского университета
Острый эмоционально-болевой стресс является мощным нейро-гормональным стимулом, активизирующим работу целого ряда структур ствола головного мозга, в число которых входят гигантоклеточные ретикулярные ядра [6, 8, 12]. Считается, что структурной особенностью организации ретикулярной формации является отсутствие строго ограниченного, компактного расположения нейронов, среди которых встречаются клетки, обладающие различной функциональной и нейромедиаторной активностью [1, 9]. В то же время высокая степень интеграции между стволовыми ретикулярными ядрами достигается во многом за счет наличия большого количества миелиновых нервных волокон, остро реагирующих на воздействие антропогенных факторов окружающей среды [4].
Процессы глиогенеза, формирования мие-линовых оболочек аксонов продолжаются в по-стнатальном онтогенезе и после дифференци-ровки нейронов. Показано, что олигодендроциты, обеспечивающие образование миелина в ЦНС, обладают специфической чувствительностью к окислительному стрессу, в ответ на который наступает запрограммированная гибель клетки [11].
Однако ультраструктурные и иммуногисто-химические изменения, возникающие в нейропи-ле гигантоклеточных ретикулярных ядер (ГРЯ) растущего организма в условиях острого стресса, остаются малоизученными.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Экспериментальное изучение изменений в гигантоклеточном ядре ретикулярной формации при повторяющемся стрессорном воздействии на растущий и развивающийся организм.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Моделирование воздействия эмоционально-болевого стресса (ЭБС) путем групповой фик-
сации за холки [5] осуществляли на беспородных белых крысах (14 животных) в исходном возрасте 30 суток. 7 экспериментальных животных подвергали воздействию ЭБС в течение 3 ч в сутки. Эвтаназию проводили под эфирным наркозом в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных». Контролем служили крысы того же возраста, находившиеся в стандартных условиях вивария.
Фиксацию кусочков продолговатого мозга производили в 10 %-м забуференном растворе нейтрального формалина. С блоков готовили парафиновые срезы толщиной 4 мкм. Иммуноги-стохимическое исследование проводили перок-сидазо-антипероксидазным методом [3] с использованием стрептавидин-биотинового комплекса производства NovoCastra и первичных мо-ноклональных антител: к белку нейрофиламен-тов NF-200 (клон RT-97), к белку Р-53 (клон DO-7) и к белку Bcl-2 (клон BCL-2/100/D5).
Для электронно-микроскопического исследования фиксацию кусочков продолговатого мозга размером 1 мм производили в течение 12 ч в 4 %-м растворе параформа на 0,1 М какодилат-ном буфере с последующей постфиксацией в течение 2 ч в 1%-м растворе тетраоксида осмия на 0,1 М какодилатном буфере ^=7,4) при +4 оС. После промывки в нескольких порциях раствора какодилатного буфера материал подвергали дегидратации в спиртах возрастающей концентрации и заливали в смесь эпона и аралдита [9].
Ультратонкие срезы толщиной 50-90 нм получали на ультрамикротоме LKB-8800. Полутонкие эпон-аралдитовые срезы толщиной 1 мкм окрашивали метиленовой синью. Ультратонкие срезы монтировали на медные сетки. После контрастирования в 2,5 %-м растворе уранилацета-та на 50о этаноле в течение 40 минут и 0,3 %-м растворе цитрата свинца в течение 20 минут
Taiiiiiii ошанш
2004
срезы изучались в электронных микроскопах JEM-100S и Tesla BS-540 при ускоряющем напряжении 60 кВ. Фотодокументирование производили с использованием фотопластинок «Для ядерных исследований». Электронные микрофотограммы изготавливали на фотографической черно-белой бумаге «Унибром 160 БП» и «Kodak».
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ОБСУЖДЕНИЕ
У контрольных крыс в возрасте 33 суток в проекции ГРЯ обнаруживалось хорошо выраженное иммунопозитивное окрашивание нервных волокон в нейропиле при проведении реакции с моноклональными антителами к белку нейрофи-ламентов NF-200. Иммунопозитивный материал обнаруживался как в аксонах, расположенных перпендикулярно (преоблающая локализация), так и в плоскости фронтального среза. Большинство поперечно срезанных аксонов имели мие-линовую оболочку, выявляемую на полутонких эпон-аралдитовых срезах, обработанных тетра-оксидом осмия. Нейроны лежали небольшими группами, были окружены глиальными элементами и безмиелиновыми нервными волокнами, часто пересекающимися и ветвящимися в плоскости среза (рис. 1А).
При электронно-микроскопическом изучении аксонов в проекции ГРЯ контрольных животных в их ультраструктуре определялись микротрубочки, нейрофиламенты, ориентированные продольно, ограниченные мембраной пузырьки, мультивезикулярные тельца, а также единичные митохондрии. Миелиновая оболочка большинства нервных волокон была образована тремя-пятью витками мезаксона олигодендроцита (рис 2 А).
Встречались волокна, имевшие меньшее число ламелл миелиновой оболочки, что свидетельствовало о незавершенности миелинизации в данном возрастном периоде. При изучении строения ГРЯ на парафиновых срезах, обработанных моноклональными антителами к Р-53 и Bcl-2, мы не обнаружили в олигодендроцитах иммунопозивного материала. Ультраструктурно цитоплазма олигодендроцита отличалась меньшей электронной плотностью цитозоля по сравнению с астроцитами. Ядро олигодендроцита было, как правило, округлым. Отмечалось характерное для данного возраста преобладание эу-рохроматина в ультраструктуре ядра. Ядрышко в некоторых случаях было достаточно хорошо выражено. Ядерная оболочка не образовывала значительных складок.
У растущих неполовозрелых крыс, подвергнутых ЭБС в течение 3 суток, обнаруживалось более выраженное иммунопозитивное окрашивание в нейропиле на NF-200. Отмечалось увеличение оптической плотности иммунопозитив-
111!1111111111!1111!1Ш
ных нервных волокон в исследуемом ядре. Как и у контрольных животных, выявлялось преобладание иммунопозитивного материала в аксонах, расположенных перпендикулярно плоскости фронтального среза (рис. 1 Б).
При изучении полутонких эпон-аралдитовых срезов, обработанных тетрадокидом осмия, обнаруживалось незначительное увеличение диаметра поперечно срезанных миелиновых волокон. При проведении электронно-микроскопического исследования была выявлена в целом сохранность ультраструктуры аксонов, которые имели различный диаметр и толщину миелиновой оболочки. В некоторых случаях со стороны осевого цилиндра отмечались явления отёка без признаков деструкции. Кроме того, наблюдалось образование довольно значительных вакуолей, имевших неправильную форму и располагавшихся чаще между аксолеммой и внутренними витками мезаксона. Единичные митохондрии демонстрировали сохранность мембран. Обнаруживались сохранные микротрубочки и промежуточные филаменты. Более выраженные изменения наблюдались со стороны миелиновой оболочки. Чаще всего обнаруживалось очаговое разрыхление миелина, увеличивалось расстояние между пластинами, особенно в волокнах малого диаметра с тонкой миелиновой оболочкой (рис. 2Б, 2В).
Деформировались профили поперечного и реже продольного сечения. Некоторые участки миелиновых волокон приобретали секторальную или тотальную гиперосмиофилию. Происходило образование глубоких инвагинаций в направлении аксоплазмы. Ультраструктурные изменения оли-годендроцитов имели различную выраженность и гетероморфизм, в некоторых случаях сводившиеся к увеличению количества свободных рибосом в цитоплазме. В других клетках цитоплазмы пери-кариона и отходящих отростков приобретали большую электронную прозрачность цитозоля. Митохондрии в большинстве олигодендроцитов были немногочисленны, сохраняли ультраструктуру мембран, иногда были несколько набухшими.
При постановке иммуногистохимических реакций с моноклональными антителами к белкам Р-53 и Вс1-2 нами не было обнаружено повышения экспрессии обоих белков в олигодендроцитах, что свидетельствовало, с учетом данных электронно-микроскопического исследования, о сохранности жизнеспособности клетки в целом.
На основании комплексного иммуногистохи-мического и ультраструктурного анализа можно заключить, что большинство олигодендроцитов ГРЯ растущих крыс не вступает на путь апоптоза под влиянием острого эмоционально-болевого стресса. В то же время блокада апоптоза в олигодендроцитах неполовозрелых животных может быть связана с включением ВСЬ2-независимых механизмов.
Рис. 1. Строение гигантоклеточного ретикулярного ядра продолговатого мозга крысы: А - контроль возраст 33 суток; Б - животное в исходном возрасте 30 суток, помещенное в условия эмоционально-болевого стресса на 3 суток. Иммуногисто-химическое окрашивание моноклональными антителами к ЫГ-200 - гематоксилин. Ув. Х 400.
Например, благодаря фосфорилированию апоптогенного белка Bad, который таким образом ингибируется за счет действия митогенактиви-руемых протеинкиназ [2], не происходит выхода из митохондрий в цитоплазму клетки цитохрома с и протеазы AIF. Не исключаются и другие пути с вовлечением ERK 1, 2-киназного пути в инициализацию ответа выжившей клетки после действия стрессового стимула [11]. Кроме того, существует предположение, что запрограммированная гибель олигодендроцитов реже, чем дегенерация аксонов, приводит к повреждению миелина и уменьшению его количества in vivo, наблюдаемому под воздействием некоторых повреждающих агентов, в частности триетилина [14]. По нашему мнению, подобная точка зрения справедлива и для трактовки обнаруженных морфологических изменений растущих миелиновых волокон в условиях эмоционально-болевого стресса, не противоречит современным представлениям о тесном метаболическом и трофическом взаимодействии нейронов и глиальных клеток в
Рис. 2. Ультраструктура олигодендроцита и миелинового нервного волокна гигантоклеточного ретикулярного ядра продолговатого мозга крысы: А - контроль возраст 33 суток; Б, В - животное в исходном возрасте 30 суток, помещенное в условия эмоционально-болевого стресса 3 суток. Электронная микрофограмма.
процессе дифференцировки в постнатальном онтогенезе [13].
Обнаруживаемое на светооптическом уровне увеличение диаметра миелиновых нервных волокон, а также повышение содержания белка нейрофиламентов аксонов NF-200 при иммуно-гистохимическом исследовании рассматривается нами как свидетельство активной структурной перестройки элементов цитоскелета аксонов нейронов ретикулярной формации ствола головного мозга при остром стрессе. Данные электронной микроскопии о сохранности ультраструктур аксонов могут служит подтверждением высказанной мысли. Увеличение активности нейронов ретикулярной формации в условиях стрессового воздействия рассматривается как важный механизм реализации стрессовых реакций организма различными отделами вегетативной нервной системы [12].
В то же время обнаруженное нами очаговое разрыхление, секторальная гомогенизация пластин миелиновой оболочки с образованием ва-
4823484853485348232348534823232353484823234853532323
куолей, признаками отёка на фоне относительной сохранности ультраструктуры и иммуноги-стохимических характеристик олигодендроцитов заставляет предположить, что в ранние сроки стресса усиление функциональной активности нейронов требует определенного соответствия со стороны микроокружения.
Учитывая, что под влиянием сублетальных доз гипоксии в головном мозге новорожденных мышей была обнаружена потеря координации экспрессии генов, которая необходима для формирования зрелых синаптических структур, детерминации процессов миелинизации и организации цитоскелета [7], можно предположить, что стрессовые стимулы также способны оказывать влияние на гены, обеспечивающие регуляцию образования нейрофиламентов и миелина.
Вовлечение растущих олигодендроцитов и аксонов в системные механизмы ответа на внешнее воздействие может трансформироваться в нарушения созревания, формирования и миелинизации нервных волокон ГРЯ и ретикулярной формации в целом.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Иммуногистохимические изменения в ней-ропиле гигантоклеточных ретикулярных ядер ствола головного мозга растущих крыс под влиянием острого эмоционально-болевого стресса свидетельствуют о сохранности большинства олигодендроцитов и об активной структурной перестройке аксонов.
Ультраструктурные изменения части олигодендроцитов медуллярных гигантоклеточных ретикулярных ядер у растущего организма в условиях воздействия острого стресса свидетельствуют об их повреждении. Некоторая активация аппарата белкового синтеза в других олигоденд-роцитах на фоне сохранных митохондрий рассматривается как механизм, способствующий выживанию клетки и сохранению её функций.
Под влиянием острого стрессового воздействия происходит изменение ультраструктуры миели-новых оболочек аксонов, что может свидетельствовать о нарушении передачи нервных импульсов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Боголепов Н.Н., Чучков В.М., Курникова И.А. Карпова А.В. // Морфология. - 2002. - №1 -2. - С. 165-189.
2. Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л. Молекулярная биология. - М.: МИ А, 2003. - 544 с.
3. Петров С.В., Райхлин Н.Т. Руководство по им-муногистохимической диагностике опухолей человека. -Казань, 2000. - 288 с.
4. Солнышкова Т.Г., Шахламов В.А. // Арх. патологии. - 2003. - Т. 65, № 2. - С. 17-20.
5. Юматов Е.А. // Эмоциональный стресс: теоретические и клинические аспекты / Под ред. Судакова К.В., Петрова В.И. - Волгоград, 1997. - C.23-28.
6. Bodineau L, Larnicol N. // Neuroscience. - 2001, V.108, N.4. - P.643-653.
7. Curristin S.M, Cao A, Stewart W.B., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2002. Vol. 99, N24. - P.15729-15734.
8. Gauriau C, Bernard J.F. // Exp. Physiol. - 2002. -Vol. 87, N2. - P. 251-258.
9. Electron microscopy methods and protocols / Ed. Nasser Hajibagheru M.A. - New Jersey: Humana Press, 1999 - 283 p.
10. Michl T, Jocic M., Heinemann A., et al. // Pain. -2001. - Vol. 92, N.1-2. - P. 19-27.
11. Mronga T, Stahnke T, Goldbaum O, RichterLandsberg C. // Glia. - 2004. - Vol. 46, N4. - P. 446-455.
12. Nosaka S, Murata K, Kobayashi M, et al. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. - 2000. - Vol. 279, N3. - P.1239-1247.
13. Okere C.O, Waterhouse B.D. // Neuroreport. -2004. - Vol. 9, N15(2). - P. 255-258.
14. Stahnke Т., Richter-Landsberg C. // Glia. - 2004, Vol. 46, N3. - P. 334-344.
Khloponin P.A., Pisarev V.B., Smirnov A.V., Pocheptzov A.Y. Ultrastructural and immunohistochemical changes of myelin fibers and oligodendrocytes in medullary nucleus gigantocellularis of growing rats during acute stress // Vestnik of Volgograd State Medical University. - 2004. - N 2(11). - P. 3-6.
Oligodendrocytes and myelinated axons of medullar reticular nucleus gigantocellularis of growing rats under influence of the emotional-pain stress were investigated using electron microscopy and immunohistochemical staining. These results indicate the safety structure of most oligodendrocytes and active axonal transformation. The changes in the myelin sheath ultrastructure may be concerned with the infringement of nerve impulse transmission.
2348532353534848232348534823235323534823482348482353
