CC BY
9DOI:10.24412/1999-6780-2020-2-40-44 УДК 582.281.21:57.012.4
ультраструктурная организация клеток ввшорт ляшшт в условиях культуры
Васильева Н.В. (директор НИИ, зав. кафед-
рой), ¡Степанова А.А. |(зав. лаб.), Богомолова
Т.С. (зав. лаб.), Чилина Г.А. (зав. лаб.), Авде-енко Ю.Л. (с.н.с.), Босак И.А. (с.н.с.), Выбор-нова И.В. (н.с.), Аак О.В. (в.н.с.), Соловьева Г.И. (в.н.с.), Павлова И.Э. (н.с.)
НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина СевероЗападного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия
На продольных полутонких эпоксидных срезах средней части зрелой колонии Rhizopus arrhizus A. Fisch. видно, что толщина воздушного и субстратного мицелия идентична; плотность расположения вегетативных гиф в субстратном мицелии выше, чем в воздушном. Колонии характеризуются обильным спороношением. Морфогенез клеток вегетативного мицелия R. arrhizus в условиях культуры сопровождается синтезом запасных веществ, пролиферацией митохондрий, а также формированием толстой клеточной стенки. Клетки субстратного мицелия синтезировали намного больше запасных липидов и, помимо них, включения гранул полисахаридов в вакуолях; также они формировали митохондриальный ретикулум, чье присутствие свидетельствует о высоком уровне их метаболизма.
Longitudinal semi-thin epoxy sections of the middle part of the mature colony Rhizopus arrhizus A. Fisch. appear that
the thickness of the aerial and substrate mycelium was identical; the density of vegetative hyphal cells of substrate mycelium was higher than in aerial. Colonies were characterized by abundant sporulation. Morphogenesis of R. arrhizus the vegetative mycelium cells in culture condition was accompanied by the synthesis of storage substances, proliferation of mitochondria, and the formation the thick cell wall. The cells of substrate mycelium cells synthesized much more storage lipids and in addition polysaccharide granules in the vacuoles; they also developed the mitochondrial reticulum, which presence indicate the high level of their metabolism.
Key words: cells components, in vitro, Rhizopus arrhizus, light- and transmission electron microscopy
ВВЕДЕНИЕ
Ранее нами была изучена в условиях культуры ультраструктура разных типов клеток широко распространенного вида патогенного мукоромицета Rhizopus arrhizus A. Fisch. в сканирующем электронном микроскопе [1]. В литературе данные по тонкому строению клеток вегетативного мицелия данного вида гриба отсутствуют, имеются лишь сведения по тонкому строению зрелых и прорастающих споран-гиоспор [2, 3].
Цель работы - изучение микроморфологии R. arrhizus с помощью методов световой и трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ). Полученные данные будут служить в качестве контроля для последующего исследования тканевых форм гриба в ТЭМ при моделировании экспериментального му-кормикоза, что важно для понимания закономерностей его преобразований при переходе в тканевую форму, выяснения одного из основных фундаментальных вопросов морфогенеза - каким образом преобразуется внутреннее строение клеток гриба и какие компоненты клетки активизируются.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Изучали штамм (PKnrF-1537) R. arrhizus A. Fisch. (Российская коллекция патогенных грибов, НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина), выделенный из бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) пациента с диагнозом «острый миелоидный лейкоз». Идентификацию гриба проводили путем таргетного ДНК-секвенирования с интерпретацией согласно протоколу CLSI MM14-A по локусам внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS) и D1/D2-домена рибосомальной РНК большой субъединицы [4, 5].
Для ТЭМ кусочки питательной среды с частью 3 и 5 суточных колоний гриба фиксировали по методике, приведенной нами ранее [6]. С эпоксидных блоков на приборе Pyramitome 11800 (LKB, Швеция) готовили полутонкие эпоксидные срезы толщиной 35 мкм, которые окрашивали толуидиновым синим. Съемку эпоксидных срезов осуществляли в световом микроскопе Leica DM LB2 со встроенной камерой DFC320 (Leica, Германия), тогда как ультратонких -
Ключевые слова: in vitro, Rhizopus arrhizus, компоненты клеток, световая и трансмиссионная электронная микроскопия
ultrastructural organization of RHIZOPUS ARRHIZUS cells in culture conditions
Vasilyeva N.V. (director of the institute, head of
the department), |Stepanova А.А.| (head of the
laboratory), Chilina G.A. (head of the laboratory), Bogomolova T.S. (head of the laboratory), Avdeenko Y.L. (senior scientific collaborator), Bosak I.A. (senior scientific collaborator), Vy-bornova I.V. (scientific collaborator), Aak O.V. (leading scientific collaborator), Solovyeva G.I. (leading scientific collaborator), Pavlova I.E. (scientific collaborator)
Kashkin Research Institute of Medical Mycology, Northwestern State Medical University named after I.I. Mechnikov, St. Petersburg, Russia
в трансмиссионном электронном микроскопе 1еш 100 8Х (1ео1, Япония).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Строение клеток культур на полутонких
эпоксидных срезах. При изучении продольных по-^ •.ЯГ,
Г^Г V ' ' • 'в**/ • • Г
«>тиги£- > 4А*
лутонких эпоксидных срезов средней части зрелой 5 дневной колонии Я. аггк12Ш выявили, что толщина воздушного и субстратного мицелия была идентичной (Рис. 1 а).
Рис. 1. Строение клеток культур И. аггН/тэ (РКПГР-1537) на полутонких эпоксидных (а, б) и ультратонких срезах (в-з). Ув.: а - х 400; б - х 1000; б, е, д, ж - х 10 000; г, з - х 20 000.
В воздушном и субстратном мицелии вегетативные гифы рыхло и хаотично ориентированы; плотность их расположения в субстратном мицелии несколько выше, чем в воздушном. В воздушном мицелии довольно часто наблюдали спорангии на разных стадиях развития, однако зрелые доминировали (Рис. 1 а). Гифы вегетативного мицелия, располагающиеся непосредственно на поверхности твердой питательной среды, формируют небольшой по толщине слой, четко выявляющийся ввиду их высокой плотности локализации (Рис. 1 а, стрелка). Спо-рангиоспоры после лизиса наружной стенки спорангия долго остаются собранными в плотную группу и локализуются в апикальной части спорангия, что было нами ранее показано при изучении колоний данного вида гриба в сканирующем электронном микроскопе [1].
Строение клеток культур в ТЭМ. Молодые гифы воздушного и субстратного мицелия изученных культур богаты цитозолем высокой электронной плотности (Рис. 1 в). Ядра, как правило, приурочены к клеточной стенке. Они одиночные или в группах по 2-3 (Рис. 1 в, г), округлой (2,3 мкм) или эллипсоидной (2,3-2,5 мкм) формы, содержат диффузный хроматин. Оболочка ядра агранулярная. Ядрышко -одно (0,2 мкм), сдвинуто к оболочке ядра, содержит фибриллярный и гранулярный компоненты, представленные в равной мере.
Вакуоли мелкие, светлые, одиночные или в небольших группах (Рис. 1 в, е), расположены в толще цитозоля и равномерно распределены по площади среза клетки. Митохондрии локализуются в толще цитозоля, многочисленные, имеют вид довольно протяженных профилей (Рис. 1 в- д). Они с плотным матриксом и большим числом хаотично ориентированных светлых крист. В клетках субстратного мицелия профили этих органелл достигают значительных размеров (Рис. 1 д). При изучении серийных срезов клеток субстратного мицелия обнаружено наличие в них одной гигантской органеллы (так называемого «митохондриального ретикулума») -довольно редкого компонента грибной клетки. Среди мицелиальных видов патогенных грибов, выращенных in vitro, он был выявлен в клетках субстратного мицелия Scedosporium apiospermum [7], S. au-rantiacum [8], Pseudallescheria boydii, P. ellipsoidea и P. angusta [9]. Только у S. aurantiacum [8] был описан редкий случай формирования «митохондриаль-ного ретикулума» клетками воздушного мицелия, что свидетельствует о высоком уровне метаболической активности данного вида гриба. Для вегетативных гиф Aspergillus spp. [6], инфицирующих ткани легких пациентки, также характерным было наличие «митохондриального ретикулума».
Из компонентов эндомембранной системы встречаются мелкие светлые секреторные пузырьки,
обычно расположенные вблизи клеточной стенки. Короткие, слегка извилистые, слабоконтрастные цистерны агранулярного эндоплазматического ретику-лума наблюдали редко. Одиночные цистерны Голь-джи и микротельца отсутствовали.
Плазматическая мембрана трехслойная, отличается высоким контрастом, обычно плотно прилегает к клеточной стенке. В молодых гифах клеточные стенки равномерно тонкие (0,02 мкм), высокой электронной плотности, без видимой структурированности (Рис. 1 г-з). Отличительной чертой строения клеточной стенки гиф субстратного мицелия было наличие невысоких (0,02- 0,03 мкм), дискретных, рыхло расположенных выростов (Рис. 1 з, стрелка) умеренной электронной плотности.
По мере созревания гиф вегетативного мицелия в них происходит синтез запасных веществ, в цито-золе - синтез запасных липидных включений. Выявлены различия в степени насыщенности этим типом запасного вещества. В гифах воздушного мицелия запасные липиды мелкие, светлые, одиночные или в немногочисленных группах, приурочены к клеточной стенке (Рис. 1 е). В гифах субстратного мицелия запасные липиды равномерно распределены по площади среза, крупные (0,2-0,3 мкм), умеренной электронной плотности, плотно контактирующие друг с другом (Рис. 1 ж). В вакуолях некоторых гиф субстратного мицелия присутствует умеренное количество мелких, темных полифосфатных гранул (Рис. 2 б). В остальном строение содержимого гиф воздушного и субстратного мицелия было сходным.
Крайне редко в гифах, подстилающих споран-гиофоры, можно было наблюдать прямые, тонкие (0,02 мкм), трехслойные (с темными наружными и светлым центральным слоем) септы. Аналогичного строения септы были ранее описаны в гифах вегетативного мицелия L. corymbifera [10], выращенных in vitro.
С возрастом гиф вегетативного мицелия толщина латеральной клеточной стенки увеличивается в 23 раза (Рис. 2 в, д). Внутреннее содержимое наружных выростов, характерных для клеточных стенок гиф погруженного мицелия, просветлялось, частота их распределения уменьшалась (Рис. 1 в, стрелка). Переход клеток вегетативного мицелия к старению сопровождается усилением уровня их вакуолизации (Рис. 2 а, г), сокращением числа органелл и запасных веществ. Ядра теряют групповое расположение, хроматин из их содержимого исчезает, просвет оболочки ядра сильно расширяется и становится неравномерным по толщине, ядрышко исчезает. В митохондриях просветляется матрикс (Рис. 2 в) и сокращается число крист. В гифах без цитозоля (Рис. 2 в) долго сохраняются запасные липиды, а также разрушающиеся ядра и митохондрии.
Рис. 2. Ультраструктура клеток вегетативного мицелия культур R. агг/няиз (РКПГР-1537) (а-г) и зрелых спорангиоспор (е, ж) в трансмиссионном электронном микроскопе. Ув.: а, в - х 10000; б - х 1000; б, е, д, ж - х 10 000; о, г - х 15 000; д -ж - 20000.
Зрелые спорангиоспоры округлой (5,0-6,0 мкм) или эллипсоидальной формы (4-5,2 х 7-8 мкм), часто располагаются в многочисленных группах, с плотным содержимым, без видимых отложений запасных веществ (Рис. 2 е). Оболочка (спородерма) спорангиоспор двухслойная, с широким светлым внутренним слоем (Рис. 2 ж, 1) и с тонким темным гомогенным наружным слоем (Рис. 2 ж). Спородерма аналогичного строения была характерна для зрелых спо-рангиоспор L. corymbifera [10].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Установлено, что морфогенез гиф вегетативного мицелия R. arrhizus в условиях культуры сопровож-
дается синтезом запасных веществ, пролиферацией митохондрий, а также формированием толстой ме-ланифицированной клеточной стенки. Клетки субстратного мицелия, в отличие от клеток воздушного, синтезировали намного больше запасных липидов и, помимо них, включения гранул полисахаридов в вакуолях; они формировали митохондриальный рети-кулум. Выявленные особенности строения гиф субстратного мицелия являются показателями высокого уровня их метаболизма.
Данная работа выполнена в рамках Госзадания «Изучение морфо-биологических особенностей му-коромицетов-возбудителей микозов у пациентов с иммунодефицитом» (2019-2021).
ЛИТЕРАТУРА
1. Васильева Н.В., Степанова А.А., Чилина Г.А. и др. Сканирующая электронная микроскопия клеток культур Lichtheimia corymbifera и Rhizopus arrhizus. Проблемы медицинской микологии. 2020; 22 (1): 58-63 [Vasilyeva N.V., Stepanova А.А., Chilina G.A., et al. Scanning electron microscopy of the cultural cells of Lichtheimia corymbifera and Rhizopus arrhizus. Problems in Medical Mycology. 2020; 22 (1): 58-63 (In Russ)]. D0I:10.24412/1999-6780-2020-1-58-63
2. Ekundayo J.A., Carlile M.J. The germination of sporangiospores of Rhizopus arrhizus; spore swelling and germ-tube emergence. J. Gen. Microbiol. 1964; 35: 261-269. doi.org/10.1099/00221287-35-2-261
3. Ekundayo J.A. Further studies on germination of sporangiospores of Rhizopus arrhizus. J. Gen. Microbiol. 1966; 42:
283-291. doi.org/10.1099/00221287-42-2-283
4. CLSI. Interpretive criteria for identification of bacteria and fungi by DNA target sequencing; approved guideline. CLSI document MM14-A. Wayne, PA: Clin. Lab. Stands Inst. 2008; 76 p.
5. Михайлова Ю.В., Лавникевич Д.М., Чилина Г.А. и др. Молекулярная идентификация клинических изолятов Aspergillus и Zygomycetes из Санкт-Петербурга. Успехи медицинской микологии. 2013; 11: 37-39. [Mikhaylova Y.V., Lavnikevich D.M., Chilina G.A., et al. Molecular identification of clinical isolates of Aspergillus and Zygomycetes from Saint Petersburg. Advances in Medical Mycology. 2013; 11: 37-39 (in Russ)].
6. Степанова A.A., Васильева Н.В., Чжан Ф. и др. Ультраструктурная организация Aspergillus spp. в тканях легких пациентки. Проблемы медицинской микологии. 2018; 20 (2): 29-39. [Stepanova A.A., Vasilyeva N.V., Zhang F., et al. Ultrastructural organization of Aspergillus spp. in the patient with lung tissues. Problems in Medical Mycology. 2018; 20 (2): 29-39 (In Russ).
7. Stepanova A.A., Vasilyeva N.V., Bogomolova T.S., Chilina G.A. Cytological study of the in vitro growing cells of vegetative mycelium of Scedosporium apiospermum. Problems in Medical Mycology. 2017; 19 (1); 24-30.
8. Stepanova A.A., Yamaguchi M.M., Chibana H., et al. Comparative ultrastructural analysis of the in vitro growing hy-phal cells of Scedosporium aurantiacum. Problems in Medical Mycology. 2017; 19 (3); 18-25.
9. Степанова A.A., Васильева Н.В. Электронно-микроскопическое изучение выращенных in vitro клеток гиф Pseudallesheria boydii, P. ellipsoidea и P. angusta. Проблемы медицинской микологии. 2019; 21 (1); 34-40. [Stepanova A.A., Vasilyeva N.V. Electron microscopic study of hyphae cells grown in vitro Pseudallesheria boydii, P. ellipsoidea and P. angusta. Problems in Medical Mycology. 2019; 21 (1); 34-40 (In Russ)].
10. Васильева Н.А., Степанова А.А., Богомолова Т.С. и др. Цитологическое изучение Lichtheimia corymbifera in vitro. Проблемы медицинской микологии. 2019; 21 (3): 3-8. [Vasilyeva N.A., Stepanova A.A., Bogomolova T.S., et al. Cytological study of Lichtheimia corymbifera in vitro. Problems in Medical Mycology. 2019; 21 (3): 3-8 (In Russ)].
Поступила в редакцию журнала: 15.05.2020 Рецензент: О.Д. Васильев
