CC BY
34
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© Петрук Н.С., Твердохлеб И.В., 2014 УДК 611.127:611.013:611.018
УЛЬТРАСТРУКТУРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЕМОДЕЛИРОВАНИЯ ПУТЕЙ ЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ КООПЕРАЦИИ КАРДИОМИОЦИТОВ ЖЕЛУДОЧКОВ В РЕЗУЛЬТАТЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ПРЕНАТАЛЬНОЙ ГИПОКСИИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
Н.С. Петрук, И.В. Твердохлеб
ГУ «Днепропетровская медицинская академия МЗ Украины», г. Днепропетровск, Украина
Цель работы - определение влияния хронической пренатальной гипоксии на ремоделирование щелевых контактов кардиомиоцитов в миокарде желудочков крысы на этапах постнатального онтогенеза. Установлено, что после действия гипоксии происходит сокращение удельной и средней длины нексусов в сравнении с нормой, что к 30-м суткам проявляется снижением численной плотности нексусов вставочного диска относительно уровня контроля и преимущественно обусловлено нарушением формирования длинных нексусов.
Ключевые слова: крысы, миокард желудочков, постнатальный онтогенез, прена-тальная гипоксия, нексус, вставочный диск.
Нарушение функционального состояния плода, которое развивается в ответ на снижение парциального давления кислорода в крови, в современной акушерской терминологии обозначается как «дистресс плода». Среди основных причин возникновения хронической внутриутробной гипоксии можно выделить экс-трагенитальную патологию матери (наличие заболеваний бронхо-легочной и сердечно-сосудистой систем, анемии, вредные привычки), нарушение структуры плаценты и процессов микроциркуляции в ней, а также постплацентарные факторы (патология пуповины, многоплодная беременность, гемолитическая болезнь плода и др). Воздействие гипоксии во время беременности влечет за собой значительные нарушения в развитии плода и отражается на состоянии сердечно-сосудистой системы. Известно, что в результате гипо-ксического повреждения миокарда могут возникать изменения электрического и механического сочленения кардиомиоци-
тов, что способствует развитию летальных аритмий [1,2,3,5]. Собственно арит-могенез зависит от множества активных и пассивных факторов. Активные свойства включают в себя трансмембранные ионные потоки и кинетику каналов, а пассивные - внутри- и межклеточное сопротивление, распределение нексусов, степень фиброза и геометрию клетки [6].
Понимание механизмов, которые лежат в основе нарушения нормального распределения коммуникативных контактов в ответ на воздействие хронической пренатальной гипоксии, может стать основой для разработки новых терапевтических методов лечения и антенатальной профилактики состояний, связанных с нарушением электрической кооперации кардиомиоцитов желудочков сердца.
Цель работы - определение влияния хронической пренатальной гипоксии на ремоделирование щелевых контактов кар-диомиоцитов в миокарде желудочков крысы на этапах постнатального онтогенеза.
Материалы и методы
Во время экспериментально -морфологического анализа в качестве объекта исследования использовали сердца зрелых белых беспородных крыс-самок и их потомства. Моделирование хронической пренатальной гипоксии по смешанному типу у крыс экспериментальной группы (92 животных) проводили путем в/б введения 1%-ного водного раствора NaNO2 в расчете 50 мг/кг массы тела с 10-го по 21 -й день беременности. В качестве контроля использовали интакт-ных здоровых крыс на соответствующих сроках постнатального онтогенеза (84 животных). Содержание животных в условиях вивария и проведение эксперимента соответствовало «Общим этическим принципам экспериментов на животных» (Киев, 2001) и Закону Украины «О защите животных от жестокого обращения» (от 15.12 2009 года № 1759-У1). Для морфологического исследования использовали интрамуральную зону миокарда правого и левого желудочков (ПЖ, ЛЖ). Анализ контактных структур типичных кардиомиоцитов (КМЦ) проводили дифференцированно в продольной и поперечной ориентациях клеток. Обработку полученного материала проводили согласно общепринятым правилам методов световой и электронной микроскопии [4]. Анализ ультраструктурных изменений кардиомиоцитов в норме и после воздействия пренатальной гипоксии осуществляли в лаборатории электронной и световой микроскопии кафедры гистологии (ГУ «ДМА МЗ Украины») с помощью трансмиссионного электронного микроскопа ПЭМ-100-01 («SELMI», Украина) при ускоряющем напряжении 75-85 кВ и первичных увеличениях от 1500 до 80000.
Для количественной оценки проводили анализ динамики изменений удельной (%) и средней длины нексусов (мкм), их численной плотности (*10-2 мкм-1), удельного количества длинных (>3 мкм) нексусов (%), численной плотности кольцевых нексусов (х10-2 мкм-1). Последний показатель рассчитывали как количество кольцевых профилей нексусов, не контак-
тирующих с сарколеммой, на 100 мкм суб-сарколеммального пространства. Определение достоверности различий между выборками осуществляли с учетом парного t-критерия Стьюдента. В случае отсутствия нормального статистического распределения величин использовали непараметрический критерий Уилкоксона.
Результаты и их обсуждение
Во вставочных дисках интактного желудочкового миокарда определялись два вида щелевых контактов: малые дисковид-ные нексусы внутри складчатого сегмента вставочного диска наряду с пальцевидными отростками клеточной адгезии (fascia adhaerens), соединяющие клетки конец-в-конец, и длинные лентообразные нексусы (>3 мкм) - в межскладчатом участке вставочного диска, расположенные на латеральной границе складчатого сегмента и своим длинником ориентированные перпендикулярно оси волокна. Это соответствовало современным представлениям [7, 8] о том, что в интактном миокарде наблюдается анизотропное распределение длин профилей нексусов в поперечной и продольной ориентациях (рис. 1, 2).
В результате воздействия хронической пренатальной гипоксии данная разнородность распределения нексусов подвергалась значительным изменениям.
Морфометрический анализ динамики изменений удельной длины нексусов в поперечной и продольной ориентациях сократительных КМЦ ЛЖ крыс в ответ на воздействие хронической пре-натальной гипоксии позволил установить наличие ряда статистически значимых отличий показателя (рис. 3). Начиная с 7-х суток постнатального онтогенеза значение параметра в поперечной ориентации КМЦ было достоверно ниже нормы (на 38,5%), а на 30-е сутки жизни уступало контрольным значениям на 31,2% (p<0,05). По мере усложнения геометрии вставочного диска статистически значимое отставание параметра от уровня нормы также отмечалось при анализе продольной ориентации КМЦ. Пик этой достоверной разницы наблюдался в начале третьей недели постна-
Рис. 1. Участок вставочного диска в миокарде желудочков крысы на 30-е сутки постнатального развития. Продольная ориентация КМЦ. А. ЛЖ, норма. Малые дисковидные нексусы в складчатом сегменте вставочного диска (черная стрелка) и длинные лентообразные
нексусы в межскладчатом участке (белые стрелки). х 15000. Б. ПЖ, гипоксия. Стрелкой обозначен профиль нексуса в межскладчатом сегменте вставочного диска. х22000
Рис. 2. Поперечная ориентация КМЦ ЛЖ крысы на 14-е сутки постнатального развития. А. Норма. Стрелкой обозначен длинный лентообразный нексус. х32000. Б. Гипоксия. Стрелкой обозначен короткий профиль нексуса. х25000
тального развития и составлял -48,9%, что объяснялось более активными процессами торцевания нексусов в норме в сравнении с экспериментом. В зрелом возрасте уровень показателя в группе контроля преобладал в поперечной ориентации (на 32,8%; р<0,05) и достоверно
не отличался от значений экспериментальной группы. Среди крыс, подвергавшихся воздействию хронической гипоксии, уровень показателя при сравнении обеих взаимно перпендикулярных ориентаций был на 29,4% (р<0,05) выше в поперечной плоскости.
18 16 14 12 10 8 6 4 2 0
1 сутки 3 сутки 7 сутки 14 сутки 30 сутки
□ Норма (продольная) ^ Норма (поперечная) О Гипоксия (продольная) □ Гипоксия (поперечная)
Зрелые
Рис. 3. Динамика изменений удельной длины нексусов (%) в поперечной и продольной плоскостях среза КМЦ ЛЖ крысы на этапах постнатального онтогенеза в норме и после действия хронической пренатальной гипоксии. * - достоверная разница (р<0,05) в сравнении продольной плоскостью среза КМЦ; ** - достоверная разница (р<0,05) в сравнении с показателями нормы
Динамика изменений удельной длины нексусов в миокарде ПЖ была сходной, а уровень показателя не имел достоверных отличий при сопоставлении с ЛЖ (рис. 4).
Динамика нарастания средней длины нексусов в постнатальном онтогенезе также характеризовалась наличием достоверных отличий величины показателя при анализе ортогональных ориентаций КМЦ ЛЖ в обеих исследуемых группах (рис. 5). В норме статистически значимое преобладание средней длины нексуса в поперечной плоскости в сравнении с продольной ориен-
тацией отмечалось с 7-х суток жизни и составляло 55,8% (р<0,05), а величина показателя в поперечной плоскости в эксперименте была ниже, чем в контроле на 31,3% (р<0,05). На последующих этапах исследования наблюдалось нарастание значения параметра с сохранением указанной тенденции. В зрелом возрасте уровень показателя в поперечной ориентации КМЦ был достоверно выше значений в продольной плоскости в обеих группах исследования.
Изменения и уровень показателя в ПЖ был аналогичен таковым в ЛЖ (рис. 6).
18 16 14 12 10 8 6 4 2
1 сутки 3 сутки 7 сутки 14 сутки 30 сутки
□ Норма (продольная) ^ Норма (поперечная) 0 Гипоксия (продольная) □ Гипоксия (поперечная)
Зрелые
Рис. 4. Динамика изменений удельной длины нексусов (%) в поперечной и продольной плоскостях среза КМЦ ПЖ крысы на этапах постнатального онтогенеза в норме и после действия хронической пренатальной гипоксии. * - достоверная разница (р<0,05) в сравнении продольной плоскостью среза КМЦ; ** - достоверная разница (р<0,05) в сравнении с показателями нормы
1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
1 сутки 3 сутки 7 сутки 14 сутки 30 сутки
□ Норма (продольная) 0 Норма (поперечная)
□ Гипоксия (продольная) □ Гипоксия (поперечная)
Зрелые
Рис. 5. Динамика изменений средней длины нексусов (мкм) в поперечной и продольной плоскостях КМЦ ЛЖ крысы на этапах постнатального онтогенеза в норме и после действия хронической пренатальной гипоксии. * - достоверная разница (р<0,05) в сравнении с продольной плоскостью среза КМЦ; ** - достоверная разница (р<0,05) в сравнении с показателями нормы
0
Рис. 6. Динамика изменений средней длины нексусов (мкм) в поперечной и продольной плоскостях КМЦ ПЖ крысы на этапах постнатального онтогенеза в норме и после действия хронической пренатальной гипоксии. * - достоверная разница (р<0,05) в сравнении с продольной плоскостью среза КМЦ; ** - достоверная разница (р<0,05) в сравнении с показателями нормы
1 сутки 3 сутки 7 сутки 14 сутки 30 сутки Зрелые
^ Норма (продольная) ®Норма (поперечная) Н Гипоксия (продольная) ЕЭГипоксия (поперечная)
Изучение динамики изменений численной плотности нексусов в миокарде ЛЖ и ПЖ выявило существенное снижение уровня показателя в экспериментальной группе крыс в сравнении с нормой, начиная с 14-х суток постнатального развития (рис. 7, 8). При этом достоверной разницы величин параметра при сопоставлении двух ортогональных плоскостей не выявлялось в обеих группах исследования. На 30-е сутки онтогенеза значение исследуемого показателя в продольной плоскости КМЦ ЛЖ уступало норме на 30,1% (р<0,05), а в поперечной - на 27,6% (р<0,05). В ПЖ величина параметра на указанном сроке была на 28,3% и 23,1% (р<0,05) ниже контроля в продольной и поперечной плоскостях соответственно. В зрелом желудочковом миокарде отставание уровня показателя в эксперименте не имело статистически значимого уровня в обеих анализируемых ориентациях.
Морфометрический анализ численной плотности кольцевых нексусов в миокарде ЛЖ выявил статистически значимую интенсификацию (активацию) процессов интернализации соединительной мембраны щелевых контактов и образование эндоцитозных транспортных форм
со второй недели постнатальной жизни (рис. 9). На 7-е сутки значение показателя превышало уровень нормы на 42,3% (р<0,05) и составляло 10,12±1,52 на 100 мкм субсарколеммальной зоны и являлось пиковым для данной экспериментальной группы. На 30-е сутки величина параметра преобладала над значениями контрольной группы на 69,7% (р<0,05).
В ПЖ увеличение численной плотности кольцевых нексусов опережало ЛЖ и отмечалось с 3-х суток постнатальной жизни, что было связано, на наш взгляд, с выраженными изменениями гемодинами-ческих условий, обусловленных включением внешнего дыхания. При этом значение показателя на данном сроке было достоверно выше, чем в ЛЖ (на 54,5% в контрольной и на 81,6% в экспериментальной группе). Преобладание уровня параметра в группе животных, перенесших воздействие пренатальной гипоксии, над значениями нормы наблюдалось с 7-х по 30-е сутки постнатальной жизни и варьировало от 59,6% до 80,8% (р<0,05). В зрелом возрасте статистически значимой разницы значений показателя в обеих исследуемых группах выявлено не было.
16 14 12 10 8 6 4 2
1 сутки 3 сутки 7 сутки 14 сутки 30 сутки
□ Норма (продольная) ^ Норма (поперечная) 0 Гипоксия (продольная) □ Гипоксия (поперечная)
Зрелые
Рис. 7. Динамика изменений численной плотности нексусов (х10-2 мкм-1) в поперечной и продольной плоскостях среза КМЦ ЛЖ крысы на этапах постнатального онтогенеза в норме и после действия хронической пренатальной гипоксии. * - достоверная разница (р<0,05) в сравнении с показателями нормы
14 12 10 8 6 4 2
1 сутки 3 сутки 7 сутки 14 сутки 30 сутки
□ Норма (продольная) ^ Норма (поперечная)
□ Гипоксия (продольная) □ Гипоксия (поперечная)
Зрелые
Рис. 8. Динамика изменений численной плотности нексусов (х10-2 мкм-1) в поперечной и продольной плоскостях среза КМЦ ПЖ крысы на этапах постнатального онтогенеза в норме и после действия хронической пренатальной гипоксии. * - достоверная разница (р<0,05) в сравнении с показателями нормы
0
0
Рис. 9. Динамика изменений численной плотности кольцевых нексусов (*10-2 мкм-1) в миокарде ЛЖ и ПЖ крысы на этапах постнатального онтогенеза в норме и после действия хронической пренатальной гипоксии. * - достоверная разница (р<0,05) в сравнении с показателями нормы; ** - достоверная разница (р<0,05) в сравнении с ЛЖ
14 12 10 8 6 4 2
1 сутки 3 сутки 7 сутки 14 сутки 30 сутки Зрелые
□ ЛЖ (норма) ^ПЖ (норма) 0ЛЖ (гипоксия) □ ПЖ (гипоксия)
0
В результате воздействия хронической пренатальной гипоксии отмечалось сокращение функционально активной порции нексусов, что, начиная с 7-х суток постнатального онтогенеза, проявлялось достоверным снижением показателей удельной и средней профильной длины нексусов на 31,2% и 23,6% (р<0,05) соответственно в ЛЖ и на 34,4% и 26,2% (р<0,05) в ПЖ. Подобная тенденция сохранялась вплоть до 30-х суток жизни.
При анализе изучаемых показателей дифференцированно в двух ортогональных плоскостях миокарда выявлялась различная динамика изменений параметров в ответ на воздействие экспериментального фактора. Так, в норме наибольшая удельная и средняя длина нексусов обнаруживалась в поперечной плоскости среза в сравнении с продольной за счет подгруппы длинных нексусов. В экспериментальной группе с 7-х по 30-е сутки жизни значения параметров были статистически неотличимыми в поперечной и продольной плоскостях в результате выраженного сокращения их величины в поперечной ориентации. Подобная потеря
анизотропности распределения щелевых контактов была связана с нарушением и уязвимостью длинных нексусов, которые практически отсутствовали.
При сопоставлении продольных плоскостей в обеих группах исследования значительной разницы обнаружено не было: средняя длина нексусов статистически значимо не изменялась в результате воздействия пренатальной гипоксии. Это объясняется тем, что короткие оси лентообразных щелевых контактов имели длину менее 1 мкм и избирательное их разрушение в условиях эксперимента не приводило к уменьшению средней длины нексуса, но отражалось на удельной длине и численной плотности нексусов.
Также к 30-м суткам постнатального онтогенеза отмечалось снижение численной плотности нексусов относительно уровня нормы на 27,8% (р<0,05) в ЛЖ и на 25,6% (р<0,05) в ПЖ, что было обусловлено нарушением формирования преимущественно длинных нексусов. Так, удельное их количество на 30-е сутки нормального постнатального онтогенеза составляло 9,32±0,67% в ЛЖ и
8,17±1,02% в ПЖ. В свою очередь, в экспериментальной группе значение показателя достигало значительно меньшего уровня - 1,86±0,22% и 1,47±0,19% в левом и правом отделах желудочкового миокарда соответственно.
В зрелом возрасте отставание от нормы исследуемых показателей не имело статистически значимой степени в обеих анализируемых ориентациях среди животных экспериментальной группы.
Подобное избирательное разрушение длинных нексусов, зачастую локализованных на периферии вставочного диска и с одной стороны контактирующих с интактной несоединительной сарколеммой, объясняется большей, чем короткие нексусы, подверженностью механическим силам, ассоциированным с аккумуляцией интерстициальной ткани.
Таким образом, уменьшение удельной и средней длины, численной плотности нексусов в желудочковом миокарде крысы, а также их пространственное перераспределение (латерализация), о котором мы упоминали в нашей прошлой работе [3], может приводить к формированию выраженной гетерогенности (неоднородности) потенциала покоя и потенциала действия, скорости и продолжительности проведения импульса, изменению рефрактерного периода, а также к асинхронному сокращению кардиомиоцитов и слабой силе желудочков, что в своей совокупности является основой для возникновения очагов с аритмогенной активностью. Механизмы, лежащие в основе редукции плотности распределения нексусов и, как следствие, нарушения проводимости, в результате внутриутробной гипоксии, вероятно, связаны со снижением уровня экспрессии Сх43 и повышением деградации и/или миграции его в области, которые не участвуют в межклеточной коммуникации («внеконтактные зоны»).
Выводы
Начиная с 7-х суток постнатального онтогенеза в экспериментальной группе животных отмечается сокращение удельной и средней длины нексусов в миокарде обоих желудочков в сравнении с нормой,
что к 30-м суткам также проявляется снижением численной плотности нексусов вставочного диска относительно уровня контроля на 27,8% (p<0,05) в ЛЖ и на 25,6% (p<0,05) в ПЖ. Подобное сокращение функционально активной порции нексусов в ответ на воздействие хронической пренатальной гипоксии обусловлено преимущественным нарушением формирования длинных нексусов, удельное количество которых на 30-е сутки онтогенеза составляет 9,32±0,67% в ЛЖ и 8,17±1,02% в ПЖ в норме, а в экспериментальной группе - 1,86±0,22% и 1,47±0,19% в левом и правом отделах желудочкового миокарда соответственно. Это приводит к нарушению анизотропности распределения нексусов в желудочковом миокарде крыс.
Литература
1. Заднипряный И.В. Структурная перестройка миокарда при перинатальной гипоксии в условиях эксперимента / И.В. Заднипряный, О.С. Третьякова // Крымс. журн. эксп. и клин. мед. -2011. - Т. 1, № 1. - С. 40-45.
2. Петрук Н.С. Ультраструктурний аналiз будови та розподшу адгерент-них м1жклггинних контактш у шлу-ночковому мюкард1 щур1в на етапах постнатального онтогенезу тсля до хротчно! пренатально! гшоксп / Н.С. Петрук // Патолопя. - 2013. - №3 (29). - С. 78-82.
3. Петрук Н.С. Ультраструктурний аналiз нексусш шлуночкових кардюмюципв щур1в на етапах постнатального онтогенезу тсля до хротчно! пренатально! гшоксп / Н.С.Петрук // Свгг мед. та бюл. - 2014. - Т. 10, № 1 (43). - С. 146-149.
4. Уикли Б. Электронная микроскопия для начинающих: пер. с англ. / Б. Уикли. - М.: Мир, 1975. - 178 с.
5. Reversible connexin 43 dephosphoryla-tion during hypoxia and reoxygenation is linked to cellular ATP Levels / M.S. Turner [et al.] // Circ. Res. - 2004. - Vol. 95. - P. 726-733.
6. Seidel T. A simulation study of cellular hypertrophy and connexin lateralization
in cardiac tissue / T. Seidel, A. Salameh, S. Dhein // Biophys J. - 2010. - Vol. 99, № 9. - P. 2821-2830.
7. Severs N.J. Gap junction shape and orientation at the cardiac intercalated disk / N. J. Severs // Circ. Res. - 1989. - Vol.
65. - P. 1458-1462. 8. Spach M. S. Changes in the topology of gap junctions as an adaptive structural response of the myocardium / M. S. Spach // Circulation. - 1994. - Vol. 90. - P. 1103-1106.
ULTRASTRUCTURAL CHARACTERISTICS OF THE REMODELING VENTRICULAR ELECTRIC PATHWAYS BETWEEN CARDIOMYOCYTES AFTER THE INFLUENCE OF CHRONIC PRENATAL HYPOXIA IN EXPERIENCE
N.S. Petruk, I. V. Tverdokhleb
The aim of this work was to determine the influence of chronic prenatal hypoxia on remodeling of gap junctions in cardiomyocytes in rat ventricular myocardium at different stages of postnatal ontogeny. Chronic prenatal hypoxia to decline total and mean individual profile length of the gap junction per 100 ^m intercalated disk in comparison with the norm, at 30th day was decrease the amount of gap junctions per 100 ^m intercalated disc in comparison of control level and caused predominantly violation build large gap junctions.
Keywords: ventricular myocardium, rats, postnatal ontogeny, chronic prenatal hypoxia, gap junctions, intercalated disc.
Петрук Н.С. - очный аспирант кафедры гистологии ГУ «Днепропетровская медицинская академия МЗ Украины», г. Днепропетровск, Украина. E-mail: [email protected].
Твердохлеб И.В. - д-р мед. наук, проф., зав. кафедрой гистологии ГУ «Днепропетровская медицинская академия МЗ Украины», г. Днепропетровск, Украина. E-mail: [email protected].
