CC BY
72
УЛЬТРАСТРУКТУРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АППАРАТА ГОЛЬДЖИ ПРИ СИНДРОМЕ ААРСКОГА - СКОТТА
Егоров М. В., кандидат медицинских наук,
Полищук Р. С.*, кандидат биологических наук
Кафедра патологической анатомии с секционным курсом ГБОУ ВПО «Ивановская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, 153012, Иваново, ул. Ф. Энгельса, д. 8 TIGEM (Telethon Institute of Genetics and Medicine), 80131, Italy, Naples, via Pietro Castellino, 111.
РЕЗЮМЕ Проанализирована ультраструктурная организация аппарата Гольджи модельной клеточной системы при синдроме Аарскога - Скотта. Установлено, что дефицит активности FGD1 в патогенезе фациоге-нитальной дисплазии приводит к структурным изменениям аппарата Гольджи в виде увеличения количества цистерн транс Гольджи компартмента, накоплению тубулярных мембранных профилей и локальных расширений цистерн. Полученные данные подтверждают значение FGD1 в регуляции пост-Гольджи транспорта.
Ключевые слова: синдром Аарскога - Скотта, FGD1, аппарат Гольджи, электронная микроскопия.
* Ответственный за переписку (corresponding author): тел.: (4932) 30-02-28
Мутации гена FGD1 (faciogenital dyspasia 1) вызывают множественные аномалии скелета в виде непропорционально короткого роста, син-, полидактилии, а также дефекты урогенитальной системы и задержку умственного развития [2, 3, 5]. Описанная патология известна в специализированной литературе как синдром Аарскога - Скотта, или фациогенитальная дисплазия. FGD1 кодирует GEF (guanine exchange factor, фактор обмена гуаниновых нуклеотидов), который специфически активирует ГТФазу CDC42. В свою очередь активная форма CDC42 регулирует множество внутриклеточных процессов, включая организацию цитоскелета, поляризованный транспорт протеинов и т. д. [4]. Наличие в структуре протеина FGD1 PH домейнов, отвечающих за связывание с фосфатидилинозитолами, обеспечивает его концентрацию на мембранах комплекса Гольджи, элементах эндосомальной системы и плазматической мембране. Поскольку дефицит FGD1 вызывает задержку транспорта протеинов на уровне комплекса Гольджи, то представляется весьма интересным оценить организацию этой органеллы на ультраструктурном уровне при отсутствии функционального FGD1.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Клеточная культура. Клетки линии HeLa (раковые эпителиальные клетки) и МС3Т3-Е1 (остеобласты) выращивались в питательной среде DMEM с содержанием 10%-ной эмбриональной сыворотки.
РНК интерференция (RNA interference, RNAi). Последовательности siRNA (Small interfering RNA, 20 мкм) были произведены компанией Dharmacon (CO, USA) и использовались для подавления трансляции гена FGD1. Трансфекция siRNA проводилась с использованием 4-х дуплексов siRNA против человеческого гена FGD1 для линии HeLa и 4-х дуплексов siRNA против мышиного гена FGD1 для линии МС3Т3-Е1. Через 2 дня после начала эксперимента клетки трансфектировались рекомбинантной ДНК, кодирующей TGN38-HRP.
Электронная микроскопия. После фиксации в 1%-ном глютаральдегиде TGN38-HRP проявлялся с использованием диаминобензидиновой реакции. Образцы постфиксировались OsO4 и заключались в эпоксидную смолу Epon 812. Ультратонкие срезы были получены с помощью ультрамикротома UCT («Leica») и анализировались в электронном микроскопе Tecnai 12 («Philips FEI»).
ULTRASTRUCTURAL CHARACTERISTICS OF CANALICULAR APPARATUS IN AARSKOG - SCOTT SYNDROME Egorov M. V., Polishchuk R. S.
ABSTRACT Authors analyzed the ultrastructural organization of canalicular appararus in model cellular system in Aarskog - Scott syndrome. It was determined that FGD1 activity deficiency in the pathogenesis of faciogenital dysplasia resulted in structural alterations of canalicular apparatus namely to the increasing number of cisterns in transcanalicular apparatus compartment, to the accumulation of tubular membrane profiles and cistern local dilation. The data obtained confirmed FGD1 significance in the regulation of postcanalicular apparatus transport.
Key words: Aarskog-Scott syndrome, FGD1, canalicular apparatus, electronic microscopy.
Т. 16, № 4, 2011
Вестник Ивановской медицинской академии
27
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Упаковка и транспорт протеинов от комплекса Гольджи к плазматической мембране включает в себя несколько этапов: 1) формирование тубулярного экспортного домейна в наиболее дистальном компартменте Гольджи, называемом транс-Гольджи-ретикуломом (ТГР); 2) заякори-вание и вытягивание этого тубулярного мембранного домейна вдоль микротрубочки; 3) отрыв и движение сформированной тубулярной транспортной органеллы (содержащей секреторные протеины) до плазматической мембраны [7]. Как было показано, дефицит РСР1 вызывает задержку выхода из комплекса Гольджи таких протеинов, как трансмембранный УЗУС и проколлаген I типа [1]. Чтобы понять, какой этап формирования пост-Гольджи-транспортных органелл контролируется РСР1, клетки трансфектировались ТСЫЗБ-ИРР, который специфично маркирует мембраны ТГР. Ультраструктура комплекса Гольджи оценивались в контрольных и РСР1-интерферированных клетках. В клетках линии ИеЬа ТСЫЗ8 как маркер ТГР определялся в виде преципитата в цистернах стопок Гольджи, в округлых и тубулярных мембранных профилях (рис. 1 а). Дефицит РСР1
(рис. 1 в), вызывает увеличение количества ТСЫЗ8-позитивных цистерн, тубулярных структур и мембранных пузырьков (рис. 1 б). Обнаруженные нами короткие тубулярные профили наглядно демонстрируют, что формирование тубулярного экспортного домейна в ТГР не нарушается. К примеру, нарушение активности протеинов, регулирующих отщепление тубул от мембран Гольджи, таких как ВАРБ1 или йупатт, приводит к появлению длинных тубулярных структур [7]. По-видимому, РСР1 регулирует взаимодействие между микротрубочками и формирующимися тубулярными транспортными органеллами, что и определяет накопление и задержку карго на уровне ТЫС, морфологическим выражением которого является увеличение этого компартмента.
В контрольных остеобластах (клетки линии МСЗТЗ-Е1) мы отмечали единичные расширения (дис-тенжены) в цистернах стаков (рис. 2 а). Выключение РСР1 дуплексами э1РМА (рис. 2 в) приводило к появлению множественных расширений даже в пределах одной цистерны. Следует подчеркнуть, что дистенжены в ТЫС имели большие размеры в сравнении с контрольной группой (рис. 2 а). Задержка транспорта в остеобластах протеинов,
Рис. 1. Клетки HeLa, трансфектированные рекомбинантной ДНК TGN38-HRP:
а - в контрольных клетках TGN (указано чёрными стрелками) представлен в виде округлых профилей и единичных цистерн. ТЭМ ув. 1 х 32000;
б - в клетках, где FGD1 нокаутирован, TGN38 (преципитат чёрного цвета) определяется в просвете нескольких цистерн и округлых профилей (указано чёрными стрелками). ТЭМ ув. 1 х 26000; в - уровень FGD1 показан с использованием Western blotting в контрольных и клетках трансфектированых с siRNA FGD1.
Control
siRNA
FGD1
FGD1
Actin
28
Аппарат гольджи при с синдроме Аарскога - Скотта
Рис. 2. Клетки МСЗТЗ, трансфектированные рекомбинантной ДНК TGN38-HRP:
а - в контрольных клетках отмечались единичные расширения (дистенжены) в TGN (указано чёрными стрелками). ТЭМ ув. х 32000;
б - в клетках, где FGD1 нокаутирован, в TGN определялись множественные расширения (указано чёрными стрелками). ТЭМ ув. 1 х 32000;
в - уровень FGD1 показан с использованием Western blotting в контрольных и клетках, трансфектированных с siRNA FGD1.
Control
siRNA
FGD1
FGD1
Actin
предназначенных для выполнения специализированных функций, таких как проколлаген I типа, остеокальцин и остеонектин, может приводить к нарушению роста и формирования костей.
ВЫВОДЫ
Таким образом, проведенный нами анализ структурной организации комплекса Гольджи при синдроме Аарскога выявил существенные изменения его транс-компартмента в виде увеличения количества цистерн и появления коротких тубулярных профайлов. В остеобластах мы отмечали увеличение размера и количества дистенженов
в цистернах, что указывает на задержку выхода проколлагена I типа. Следует подчеркнуть, что дефицит активности РСР1 на Гольджи приводит к нарушению формирования транспортных переносчиков на этапе их взаимодействия с элементами цитоскелета. Точный механизм координации между формирующимися тубулярными структурами и цитоскелетом, который, возможно, регулируется РСР1, является предметом будущих исследований. Выявление ключевых регуляторных протеинов в цепи РСР1-зависимого сигнального пути может определить применение «точечной» медикаментозной терапии и улучшить качество жизни больных с синдромом Аарскога - Скотта.
ЛИТЕРАТУРА
1. Воронцова О. А., Егоров М. В., Полищук Р. С. Мутации гена FGD1, выявленные при синдроме Аарскога, вызывают замедление транспорта белков через секреторный аппарат фибробластов // Материалы научно-практической конференции студентов и молодых ученых ИвГМА «Неделя науки - 2006». - Иваново, 2006. - С. 52-54.
2. Aarskog D. A familial syndrome of short stature associated with facial dysplasia and genital anomalies // J. Pediat. - 1970. - Vol. 77. - P. 864-861.
3. A mutation in the pleckstrin homology (PH) domain of the FGD1 gene in an Italian family with faciogenital dysplasia (Aarskog - Scott syndrome) / A. Orrico [et al.] // FEBS Lett. - 2000. - Vol. 478. - P. 216-220.
4. Egea G., Lazaro-Dieguez F., Vilella M. Actin dynamics at the Golgi complex in mammalian cells // Curr. Opin. Cell. Biol. - 2006. - Vol. 18, № 2. - P. 168-179.
5. Skeletal-specific expression of FGD1 during bone formation and skeletal defects in faciogenital dysplasia (FGDY; Aarskog syndrome) / J. L. Gorski [et al.] // Dev. Dyn. - 2000. - Vol. 218. - P. 573-586.
6. Isolation and characterization of the faciogenital dysplasia (Aarskog - Scott syndrome) gene: a putative Rho/ Rac guanine nucleotide exchange factor / N. G. Pasteris [et al.] // Cell. - 1994. - Vol. 79. - P. 669-678.
7. Polishchuk R. S., Capestrano M., Polishchuk E. V. Shaping tubular carriers for intracellular membrane transport. // FEBS Lett. - 2009. - Vol. 583. -P. 3847-3856.
