CC BY
83
ОТРАСЛЕВЫЕ ПРОБЛЕМЫ ОСВОЕНИЯ ЗАСУШЛИВЫХ ЗЕМЕЛЬ——
УДК 556.315:579.82(470.67)
УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИЕ МИКРООРГАНИЗМЫ ГЕОТЕРМАЛЬНОГО ИСТОЧНИКА И ИХ ЗНАЧЕНИЕ В ОЦЕНКЕ БИОРАЗНООБРАЗИЯ МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВ
© 2014 г. Э.А. Халилова*, Р.А. Нуратинов,**С.Ц. Котенко*, Э.А. Исламмагомедова*
*Прикаспийский институт биологических ресурсов Дагестанского научного центра РАН Россия, 367025, Махачкала, ул. Гаджиева, 45. E-mail: eslanda61@mail.ru **ГНУ «Прикаспийский зональный НИВИ». Россия, 367020, Махачкала, ул. Дахадаева, 88. Тел (8722) 68-14-09, Е-mail: vagabovich@mail.ru
Поступила 27.07.2013г
Впервые проведено микробиологическое исследование поверхностных термопроявлений щелочного геотермального источника Кизлярского месторождения. Выделены нокардиоморфные актиномицеты - бактерии, содержащие миколовые кислоты (Nocardia asteroidas, Nocardia transvalensis, Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus maris, Rhodococcus luteus, Rhodococcus terme, Rhodococcus brouchialis), грамположительные неспорообразующие палочки неправильной формы (Corynebacterium bovis, Corynebacterium diphtheria, Propionibacterium freudenreichis) и микобактерии (Mycobacterium marinum). Обсуждаются их морфологические и физиологобиохимические экологические особенности.
Ключевые слова: бактерии Nocardia, Rhodococcus, Corynebacterium, Propionibacterium, Mycobacterium, геотермальная вода, морфология, физиология, биохимия
Введение
В последние годы изучения микробных сообществ термальных и щелочных местообитаний находилось в центре внимания исследователей, выявлялось филогенетическое, метаболическое, биохимическое разнообразие термофильных микроорганизмов. Микробные сообщества термальных местообитаний уникальны во многих отношениях и, благодаря своим характерным особенностям, могут служить идеальной моделью для изучения экологии микроорганизмов (Заварзин Г.А., 2004; Намсараев З.Б. и др., 2006; Плешакова Е.В., 2010). Именно они составляют основной генофонд, противостоящий изменениям окружающей среды и различным катаклизмам. Различные геологические и гидрологические условия формирования обуславливают гидрохимическое разнообразие термальных вод, которые находятся под значительным влиянием современной биосферы. (Бонч-Осмоловская Е.А. и др, 2004).
Республика Дагестан является уникальной геотермальной провинцией России. Однако, изучение микрофлоры термальных источников Северного Кавказа является малоисследованной областью (Черноусова Е.Ю. и др., 2008; Гриднева Е.В., и др., 2009; и др.). В геологическом отношении он располагается на стыке двух крупнейших геолого -тектонических структур (Кавказской геосинклинали и Русской платформы) и занимает юго-восточную часть Восточного Предкавказья (Залибеков З.Г., 2004, 2009; Идрисов И.А., 2013). Нефтегазоносные пласты являются природными пулами уникальных микроорганизмов, как углеводородокисляющие бактерии. Они широко распространены в аридных условиях, поскольку способны усваивать многие труднодоступные для большинства других микроорганизмов субстраты: углеводороды нефти, озокериты, смолы, фенольные соединения, гумусовые вещества, лигнин и его производные, воска и др. Доминирование этих микроорганизмов, обусловлено наличием не только углеводородокисляющих
ферментных комплексов, но и систем поглощения гидрофобных субстратов. Исследование структуры микробных сообществ, ассоциированных с высокотемпературными экологическими нишами и их разнообразия, представляет интерес для фундаментальной микробиологии, в том числе эволюционной, поскольку многие обитающие в этих условиях микроорганизмы относятся к эволюционно древним ветвям бактерий и архей.
Целью настоящей работы явилось изучение морфологических и физиологобиохимических свойств чистых культур углеводородоокисляющих бактерий -деструкторов органического вещества в геотермальном источнике Кизлярского месторождения и их функциональной роли в микробном сообществе.
Методика исследования
Объектом исследования являлась микрофлора геотермальной воды фенольного класса 7Т Кизлярского месторождения расположенного в южной части Терско-Кумской низменности.. По геологическим условиям Кизлярское месторождение относится к типу пластовых с относительно простыми гидрогеотермическими условиями. Водоносный горизонт приурочен к чокракскому месторождению (на глубине от 2900м), представленному чередованием мощных пачек высокопроницаемых равномерно зернистых слабосцементированных песчаников и глин. Вода высокотермальная (980С), слабосолоноватая (2.1г/л), очень жесткая (27.748), нейтральная (рН7.15), по газовому составу
- углекислая, по газонасыщенности - слабая (14.38), сульфатно - хлоридно -гидрокарбонатно - натриевая. Химический состав представлен, в основном, ионами: Na, Ca, Mg, K, HCO3, Cl, SO4, Br с преимущественным содержанием ионов Na и HCO3. Состав растворенного газа углекисло - аммиачно - азотный (50.76:27.40:21.84 % соответственно). Углекислота и сероводород отсутствуют. Содержание органических веществ Сорг. - 1.42мг С/л. В числе органических соединений в воде обнаружены: битумы нейтральные - 2.0, битумы кислые -1.4, гумусовые вещества -4.6, фенолы - 0.54 и ароматические углеводороды
- 1.6 (Халилова Э.А. и др., 2013/
Для индентификации изучаемых микроорганизмов использовали среды: Мюнца, нитритный агар по Виноградскому, Сотона, Финна II, Финна II с геотермальной водой, Левенштейна - Йенсена, сусло - агар, агар Эндо, МПА, Кит - Тароцци.
Фенотипические свойства микроорганизмов (морфология клеток, подвижность, наличие спорообразования, физиолого-биохимические признаки, окраска по Граму) изучали с использованием стандартных методов (Нетрусов А.И. и др., 2005). Морфологический анализ бактериальных клеток и их фотографирование осуществляли с помощью светового лабораторного микроскопа Œ21FS1 OLYMPUS и сканирующего электронного микроскопа LEO - 1450 с микрозондовым анализатором ISYS с системой EDX (Leica Micro - systems Wetzlar Gmbh, Германия).
Для идентификации выделенных культур использовали: принятые ГОСТом 27318-87 методы определения: атипичных микобактерий - качественного моносахаридного состава гидролизатов целых клеток, ДАПК в клетках бактерий - липида LCN-а свободные миколовые кислоты гидролиз органических компонентов по Goodfeilow (1971); фосфатазной активности по Gaune D. et al. (1966); кислотоустойчивости по Gordon R., Mihm Z (1959); солеустойчивость, усвоение органических кислот и образование кислоты из углеводов, восстановление нитратов в нитриты по Gordon R., Smith M. (1953). Для окончательной идентификации использован определитель Берджи (Дж. Хоулт и др., 1997).
Результаты и обсуждение
Фактором, определяющим распространение разнообразных групп гетеротрофных микроорганизмов, является лабильное органическое вещество. В данном случае количественное содержание органических веществ (органических нелетучих соединений) составляет 1.42мг/л. Наиболее обогащены разнообразной микрофлорой поверхностные водопроявления, что подтверждается интенсивным воздействием климатического фактора.
Количественное содержание микроорганизмов в водах достаточно хорошо коррелирует с макрокомпонентным составом воды, а главным физико-химическим фактором среды, оказывающим влияние на состав и распространение микробных сообществ в гидротермах, является - температура. В гидротермах микробные сообщества, кроме высокой температуры, подвергаются комбинированному воздействию и других экстремальных факторов: высокого рН и, в ряде случаев, высокого содержания сульфида и минерализации. (Намсараев З.Б. и др., 2006).
На основе изучения широкого спектра биохимических свойств выделенных штаммов микроорганизмов и сравнением полученных результатов со свойствами, описанными в определителе бактерий Берджи удалось идентифицировать виды, относящиеся к 3-м группам: нокардиоморфные актиномицеты - бактерии, содержащие миколовые кислоты (гр.22), грамположительные неспорообразующие палочки неправильной формы (гр.20) и микобактерии (гр.21) (табл.). При дополнительном изучении морфологии выделенных культур электронной микроскопией и комплекса культурально - биохимических исследований проведена дифференциация видов: Nocardia asteroidas, Nocardia transvalensis, Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus maris, Rhodococcus luteus, Rhodococcus terrae, Rhodococcus brouchialis, Corynebacterium bovis, Corynebacterium diphtheria, Propionibacterium freudenreichis, Mycobacterium marinum.
Таблица. Дифференцирующие признаки микроорганизмов родов Rhodococcus, Nocardia Mycobacterium. Table. Differentiating characteristics of microorganisms genera Nocardia, Rhodococcus Mycobacterium.
Признаки Наличие (+), отсутствие (-)
Mycobacterium Nocardia Rhodococcus
1 2 3 4
Отношение к кислороду воздуха аэробы аэробы аэробы
Окраска по Граму + + +
Кислотоустойчивость +п. +ч.сл +ч.сл.
Подвижность - - -
Образование спор - + -
Полиморфизм + + +
Образование мицелия: воздушного + + +
субстратного + + +
Пигментация + + +
Анаэробное окисление глюкозы - - +
Арилсульфатазная активность + + -
Рост на индивидуальных алканах ± + +
Сенсибилизация макроорганизма + + +
Наличие п-нитрофенолоксидазы - + +
в-галактозидазы БРМ+ + +
Разложение этиленгликоля БРМ- + +
Кислотоустойчивость после 4-х часовой экстракции пиридином + - -
Фосфотазная активность + + -
Наличие липида LCN-A + + +
Гидролиз твин - 40 - + +
Усвоение :^-солей уксусной кис-ты - + -
пировиноградной кис-ты - - +
янтарной кис-ты - + +
Усвоение :^-солей лимонной кис-ты - ± +
молочной - + +
щавелевой - - -
Восстановление нитратов в нитриты ± - ±
Продолжение таблицы
1 2 3 4
Образование кислот из углеводов: глюкозы - +
галактозы - ± +
раффинозы - - ±
сахарозы - +
мальтозы - - -
арабиозы - - +
маннозы - ± +
Устойчивость к ^^ + + +
Условные обозначения: (+) - 80-100% штаммов положительно по данному признаку; (±) - 50-79%; (+) - 15-49%; (-) - 0-14%; п - полная, ч - частичная и сл. - слабая кислотоустойчивость; БРМ -быстрорастущие микобактерии.
Сorynebacterium — род грамположительных палочкообразных бактерий (рис. в). Палочки образуют скопления, неподвижны, не образуют спор. На селективных средах, содержащих теллурит, колонии Corynebacterium имеют серый или черный цвет; на плотных средах - гладкие, блестящие колонии S-формы; на жидких средах - диффузное помутнение. По современной классификации род коринебактерии входит в семейство Corynebacteriaceae. Физиологические свойства их определяются термином «неферментирующие бактерии», так как они разлагают углеводы, не используя их в качестве источника энергии, а окисляют их, что легко установить при помощи теста Хью-Лейфсона. Коринебактерии установленных видов C. bovis, C. diphtheria являются ферментирующими, нелиполитическими.
Представители рода Mycobacterium - кислотоустойчивые микроорганизмы, их высокая резистентность во внешней среде и ряд других свойств связаны с особым составом клеточной стенки, большим содержанием липидов и воска. В порядок Mycobacterium входят организмы с палочковидными грамположительными клетками. Если нитчатое строение и ветвление клеток актиномицетов имеет у проактиномицетов нестойкий и непостоянный характер, то у микобактерий определяются некоторые элементы такого строения, мицелий не образуется. Палочковидные клетки имеют неправильные очертания: контуры их искривлены, неодинаковой толщины, одиночные или соединены в пары (рис. а). Все микобактерии неподвижны, окрашиваются по Граму положительно, кислотоупорны, хорошо усваивают белки, углеводы, жиры, воск, парафин. Колонии растут медленно, в темноте, при комнатной температуре в течение 15-30 дней; в основном, гладкие (S-форма), редко - шероховатые (R-форма); бесцветны. При освещении дневным или искусственным источником становятся желтыми или желто-оранжевыми. У микобактерий обнаружены миколовые кислоты, которые благодаря наличию длинных ароматических цепей, выполняют роль связующего субстрата для таких углеводородов, как нефть и нефтепродукты. В среде, не загрязненной нефтепродуктами, указанные кислоты способны связывать жиры, воска, углеводы и белки, но при смене источника углеводорода в окружающей среде происходит стимулирование синтеза миколовых кислот (Кобзев E.H. и др., 2001). Поэтому одной из наиболее интересных особенностей микобактерий в регионах аридных земель является их способность разлагать инертные соединения, как углеводороды, когда химическая и адсорбционные методы очистки нецелесообразны при загрязнении нефтепродуктами рек, морей, океанов, почвы и атмосферы.
Из геотермальной воды выделены изоляты нокардиоморфных актиномицетов родов Nocardia и Rhodococcus. Штаммы Nocardia asteroidas, Nocardia transvalensis (группа 22) представляют слабо-окрашивающиеся грамположительные палочковидные бактерии; фототрофные, анаэробные, аноксигенные; представлены вегетативными гифами от рудиментальных до обильно разветвленных, распадающими in situ на бактероидные элементы от палочковидных до кокковидных (рис. б). Клетки Nocardia имеют сложную
клеточную стенку и внутриклеточную перегородку, характерную для представителей семейства Noca.rdia.ceae. Они не требовательны к содержанию органического углерода в среде, многие из них способны расти на «голодном» агар-агаре, образуя кремовые колонии, а на среде Сотона с жидким парафином и Финн 2- оранжево-красные. Представители рода Nocardia способны осуществлять хемосинтез, окисляя водород, метан и метанол. Среди актиномицетов широко распространена гетеротрофная фиксация С02. Мицелиальный (в виде ветвящихся нитей) рост этих грамположительных бактерий придает им внешнее сходство с грибами. В отличие от грибов, они имеют прокариотическое строение клетки, не содержат в клеточной стенке хитин и целлюлозу, размножаются только бесполым путем. У представителей Nocardia мицелий выражен в значительно большей степени, чем у микобактерий, однако в старых культурах они также проявляют тенденцию фрагментироваться на отдельные клетки неправильной формы. Nocardia — аэробы, многие из которых проявляют кислотоустойчивость, жароустойчивость.
д)
Рис. Морфология клеток штаммов бактерий, выделенных из проб воды геотермального источника скв. №7-Т. Сканирующая микроскопия (а-д): а)Mycobacterium, б) Nocardiaceae, в) Corynebacterium, г) Rhodococcus, д) Propionibacterium. Масштабная ветка - 5мкм.
Fig. 'rhe morphology of the cells of the strains of bacteria isolated from water samples of the geothermal source of hard currency. No. 7-T. Scanning microscopy (a-d): а) Mycobacterium, b) Nocardiaceae, в) Sorynebacterium, g) Rhodococcus, d) Propionibacterium. A large-scale branch - 5 цкм.
Rhodococcus является родом нокардиоформных актиномицетов, аэробы, неспорообразующие, частично кислотоустойчивые, неподвижные грамположительные
бактерии тесно связананные с микобактериями и коринебактериями. Штаммы - Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus maris, Rhodococcus luteus, Rhodococcus terrae, Rhodococcus brouchialis могут образовывать различные формы от палочек до обильно-развлетленного мицелия (рис. г) и желто-оранжевые колонии на твердой среде и сусло-агаре; способны обитать в широком диапазоне сред и условий, включая почву и воду. Для биодеструкции нефтешламов для биоремедиации земель в настоящее время в качестве микроорганизмов-деструкторов активно используют Rhodococcus, Microbacterium. Установлена возможность интенсификации процессов деструкции нефти накопительной культурой нефтеокисляющих микроорганизмов в присутствии бактерий рода Rhodococcus и экзогенных ПАВ, синтезируемых штаммом Pseudomonas sp., выделенных из геотермального источника (Карпенко и др., 2006.). Отдельные виды родококков, благодаря их экологически важной способности метаболизировать в качестве единственных источников углеродного питания газообразные н-алканы характеризуются локальным распределением в природе и занимают доминирующее положение в естественном биоценозе районов углеводородных скоплений, представляющего собой своеобразный природный катаболический экранзащиты атмосферы от газообразных углеводородов. Известно, что доминантный вид R. rhodochrous рекомендуется как биоиндикатор газовых углеводородных аномалий, почв засушливых территорий.
В группу пропионовокислых бактерий, объедененных в род Propionibacterium, входят грамположительные, неподвижные, не образующие спор палочковидные бактерии, размножающиеся бинарным делением. В зависимости от условий культивирования и цикла развития форма клетки может меняться до кокковидной, изогнутой или булавовидной (рис. д). Обнаруженный нами типовой вид - Propionibacterium freudenreichis (группа 20). Большинство пропионовокислых бактерий - аэротолерантные анаэробы, получающие энергию в процессе брожения, основным продуктом которого является пропионовая кислота. Аэротолерантность их обусловлена наличием сформированной ферментной системы защиты от токсических форм кислорода (супероксидный анион, перекись водорода). У пропионовокислых бактерий обнаружены супероксиддисмутазная, каталазная и пероксидазная активности, являющихся основой прогноза возможных загрязнений атмосферы.
Заключение
Из щелочного геотермального источника Кизлярского месторождения выделены нокардиоморфные актиномицеты - бактерии, содержащие миколовые кислоты грамположительные неспорообразующие палочки неправильной формы и микобактерии, участвующие в продукции органического вещества подземной воды. Рассматриваемые актиномицеты способны обитать в широком диапозоне сред в засушливых регионах мира. Отмечена их метаболизирующая роль в качестве источника углеродного питания.
Результаты изучения биоразнообразия бактерий и их сообществ подземной воде Кизлярского месторождения, вносят определенную лепту в изучение микробных сообществ геотермальных источников Республики Дагестан. Созданы чистые лабораторные культуры, сформирована реферативная коллекция, где каждый штамм несет в себе определенную часть генетического пула природного микробного сообщества.
Выделенные культуры обладают свойствами промышленных микроорганизмов и могут использоваться в технологических схемах очистки воды и почвы, получении биологически активных веществ. Изучение фенотипической дифференциации микробных сообществ, в особенности термальных источников Дагестана, представляет интерес для фундаментальных исследований в области микробиологии и разнообразия микроорганизмов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Гриднева Е.В., Грабович М.Ю., Дубинина Г.А. и др. 2009. Экофизиология литотрофных сероокисляющих представителей рода Shaerotilus - обитателей сульфидных источников Северного Кавказа // Микробиология. Т.78. №1. С.89-97.
Бонч-Осмоловская Е.А., Мирошниченко М.Л., Соколова Т.Г. и др. Термофильные микробные сообщества: новые физиологические группы, новые местообитания. Труды Института микробиологии им. С.Н. Виноградского, Выпуск 12. Москва. Наука. 2004.
Заварзин Г.А. 2004. Изучение микробного разнообразия в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского // Микробиология. Т.73. №5. С.598-612.
Залибеков З.Г. 2004. Об основных направлениях исследований почв охраняемых территорий юга России // Аридные экосистемы. Т.10. №22. С.7-9.
Залибеков З.Г., Биарсланов А.Б., Аскерова Д.Б. 2009. О действующей системе мониторинга почв аридных территорий // Аридные экосистемы. Т.15. №4 (40). С.13-15.
Карпенко Е.В., Вильданова-Марцишин Р.И., Щеглова Н.С. и др. 2006. Перспективы использования бактерий рода Rhodococcus и микробных поверхностно-активных веществ для деградации нефтяных загрязнений // Прикладная биохимия и микробиология. Т.42.№2.С.175-179.
Кобзев E.H., Петрикевич С.Б., Шкидченко А.Н. 2001. Исследование устойчивости ассоциации микроорганизмов-нефтедеструкторов в открытой системе // Прикладная биохимия и микробиология. Т.37. №4. С.413-417.
Намсараев З.Б.,. Горленко В.М,. Намсараев Б.Б. и др. Микробные сообщества щелочных гидротерм. Новосибирск: Изд-во СО РАН, 2006. 111с.
Нетрусов А.И., Егорова М.А., Захарчук Л.М. 2005. Практикум по микробиологии. Москва. Изд-во:«Академия».608с.
Идрисов И.А. 2013. О структуре рельефа юго-запада Прикаспийской низменности // Аридные экосистемы. Т.19. №1(54). С.36-43.
Плешакова Е.В. 2010. Экологические аспекты кислотоустойчивости нефтеокисляющих микроорганизмов в ходе биоремедиации загрязненных почв // Поволжский экологический журнал. № 4. С. 374-382.
Халилова Э.А., Котенко С.Ц., Исламмагомедова Э.А., Аливердиева Д.А. 2013. Патент на изобретение № 2012117001/10 (025776).
Хоулт Дж., Криг Н., Снит П. и др. 1997. Определитель бактерий Берджи. 9 издание. (под ред. акад. Заварзина Г.А.). М.:Мир. Том 1-2. 800с.
Черноусова Е.Ю., Акимов В.Н., Гриднева Е.В. и др. 2008. Филогенетический in situ / ex situ анализ микробного сообщества серного мата из термального сульфидного источника Северного Кавказа // Микробиология. Т.77. №2. С.255-260.
Becker B., Lechevalier M.P., Gordon R.E^t al.. 1964. Rapid differentiation between Nocardia and Streptomyces by paper chromatography of whole cell hydrolysates // Appl.Microbiol.12.P.421-423.
Gaune D.J., Williams S.N., Skerman T.M. 1966. // J. Appl. Bacteriol. 29(1). P.72-92.
Gordon R.E., Mihm Z.A. 1959. // А comparison of Nocardia asteroides and Nocardia brasiliensis // J.Gen.Microbiol. Vol.20. P.129-135.
Gordon R.E., Smith M M. // J. Bacteriol. 1953. Vol. 66, N. 1. P. 41-48.
Goodfeilow M. 1971. Numerical taxonomy of some nocardioform bacteria / M.Goodfeilow // Gen. Microbiol. 69. №1 P.151-154.
UGLEVODORODOKISLÄÜSIE MICROORGANISMS GEOTHERMAL SOURCE AND THEIR VALUE IN ASSESSING THE BIODIVERSITY OF MICROBIAL COMMUNITIES
© 2014. E.A. Khalilova*, R.A. Nuratinov, **S.C. Kotenko*, E.A. Islammagomedova*
** Caspian Institute of biological resources of the Dagestan Centre of science of Russian Academy of Sciences, Daghestanian scientific Center RAS, Russia Republic of Dagestan, Makhachkala, 367025, str.
Hajiyeva, 45. E-mail: eslanda61@mail.ru ** The Wildebeest "Nivi" Russia-Caspian area, Republic of Dagestan, Makhachkala, 367020, str.
Dahadaeva, 88. E-mail: vagabovich@mail.ru
For the microbiological examination of surface termoproävlenij geothermal field Kizlärskogo source of alkali. Highlighted nokardiomorfnye Actinomycetes-containing mikolovye acid bacteria (Nocardia, Nocardia transvalensis asteroidas, Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus maris, Rhodococcus luteus, Rhodococcus terre, Rhodococcus brouchialis), Gram non-sporogenous sticks irregularly shaped (Corynebacterium bovis, Corynebacterium diphtheria, Propionibacterium freudenreichis) and Mycobacteria (Mycobacterium marinum). Discusses their morphological and fiziologobiohimiceskie features.
Keywords: bacteria Nocardia, Rhodococcus and Corynebacterium, Propionibacterium, Mycobacterium, geothermal water, morphology, physiology, biochemistry.
