Участие системы глутатион - глутаредоксин в регуляции пролиферации опухолевых клеток линии MCF-7 при индуцированном росковитином окислительном стрессе Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

XXI РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ КОНГРЕСС

ПОСТЕРЫ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ

Наличие рака молочной железы, хороший функциональный статус, ограниченные (<4 очага) МГМ, возраст <50 лет и отсутствие экстракраниальных метастазов являются предикторами лучшей выживаемости.

Участие системы глутатион - глутаредоксин в регуляции пролиферации опухолевых клеток линии MCF-7 при индуцированном росковитином окислительном стрессе

Е. В. Шахристова', Е. А. Степовая', О. Л. Носарева', Е. В. Ру-диков'

Место работы: ФГБОУ ВО Сибирский государственный медицинский университет Минздрава России, г. Томск e-mail: [email protected]

В настоящее время фундаментальные исследования, проводимые в области молекулярно-клеточных взаимодействий, позволяют выявить молекулярные механизмы развития различных социально-значимых заболеваний, в том числе злокачественных новообразований. Изучение молекулярных механизмов опухолевого роста, сопровождающейся активной пролиферацией трансформированных клеток, дизрегу-ляцией апоптоза на фоне развития окислительного стресса, является одним из приоритетных направлений трансляционной медицины.

Цель. Установление роли глутатиона и глутаредоксина в регуляции пролиферации опухолевых клеток линии MCF-7 при индуцированном росковитином окислительном стрессе. Материалы и методы. В исследованиях была использована культура клеток линии MCF-7 (эпителиоподобная аденокар-цинома молочной железы человека), полученная из Российской коллекции клеточных культур Института цитологии РАН. Опухолевые клетки культивировали адгезионным методом в полной питательной среде, содержащей 90% EMEM, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1 % заменимых аминокислот, 10 мкг/мл бычьего инсулина, 0,3 мг/мл L-глутамина и 100 мкг/мл гентамицина. Клетки аденокарциномы молочной железы культивировали в течение 18 ч при 37°C и 5% CO2 в присутствии и отсутствии росковитина (ROSC («Sigma-Aldrich», США), ингибитор циклинзависимых протеинкиназ) в конечной концентрации 20 мкМ. Оценку распределения опухолевых клеток по фазам клеточного цикла проводили методом проточной цитофлуориметрии по протоколу Cycle Test Plus («Becton Dickinson», США). Продукцию активных форм кислорода (АФК), представленных перекисными группировками гидро- и липопероксидов, в культуре клеток линии MCF-7 оценивали с использованием флуоресцентного зонда 2,7-дихлорфлуоресцеиндиацетата на проточном лазерном цитометре «BD FaCSCanto II» («Becton Dickinson», США). Концентрацию восстановленной (GSH) и окисленной (GSSG) форм глутатиона в клетках линии MCF-7 оценивали методом, основаным на способности GSH взаимодействовать с 5,5-дитиобис-2-нитробензойной кислотой с образованием тионитрофенольного аниона, имеющего характерный максимум поглощения при длине волны 412 нм. Для определения GSSG пробы предварительно инкубировали с блокатором SH-групп — 2-винилпиридином. Методом вестерн-блоттинга с использованием моноклональных антител («Abcam», США) определяли внутриклеточное содержание глутаредоксина по протоколу фирмы-производителя. Расчет содержания исследуемого белка проводили относительно концентрации референсного протеина р-актина. Результаты выражали

в виде медианы (Ме) и квартилей (Q1-Q3). Достоверность различий выборок оценивали непараметрическим критерием Манна-Уитни при уровне значимости р<0,01. Результаты. Культивирование клеток линии MCF-7 в присутствии ROSC способствовало снижению прогрессии фаз клеточного цикла, что выражалось в уменьшении количества опухолевых клеток в 1,4 раза (р<0,01) в G0/G1 фазах и в 2,5 раза (р<0,01) в G2/M фазах по сравнению с соответствующими показателями в интактной культуре, составившими 56,37 (55,89-56,57) % и 7,92 (5,82-10,11) % соответственно. Остановка клеточного цикла в G2/M фазах при действии ROSC сопровождалась активацией окислительного стресса в клетках линии MCF-7 с увеличением генерации АФК в 1,6 раза (р<0,01) по сравнению со значениями показателя в интактной культуре (0,81 (0,80-0,83) у. е.). Ведущую роль в защите клеток от окислительного стресса и поддержании редокс-гомеостаза играет система глутатиона, включающая глутатион и глутатионзависимые ферменты, в частности глутаредоксин. Поскольку АФК способны повреждать макромолекулы клеток, в том числе белки-регуляторы пролиферации, в опухолевых клетках при действии ROSC нами зарегистрировано снижение концентрации GSH в 1,8 (р<0,05) раз по сравнению с интакт-ной культурой, который может использоваться в качестве кофермента в ферментативных реакциях взаимодействия с гидро- и липопероксидами. Отсутствие ожидаемого увеличения содержания GSSG в клетках линии MCF-7 при роско-витин-индуцированном окислительном стрессе, может быть следствием глутатионилирования свободных SH - групп аминокислотных остатков в составе редокс-регулируемых белков. Также нами установлено увеличение содержания глутаредоксина в 1,3 раза (р<0,01) в клетках линии MCF-7 при действии ROSC в ответ на индукцию окислительного стресса. Глутаредоксин, катализируя процесс деглутатиони-лирования, модулирует активность транскрипционных факторов NF-kB, Nrf2 и AP-1, под контролем которых находятся участки генов, кодирующих ключевые белки антиокси-дантной системы, в том числе ферменты синтеза и метаболизма глутатиона. Поскольку глутатионилирование/ деглутатионилирование белков при действии ROSC способно приводить к конформационным изменениям структуры белковых молекул, в том числе циклинзависимых протеинкиназ, что может привести к нарушению выполняемых ими функций и остановке пролиферации опухолевых клеток линии MCF-7.

Заключение. Таким образом, остановка пролиферации клеток линии MCF-7 в G2/M фазах клеточного цикла при действии росковитина обусловлена не только механизмом конкурентного ингибирования циклинзависимых проте-инкиназ, но и индукцией окислительного стресса. Нами установлено, что индукция росковитином окислительного стресса в опухолевых клетках линии MCF-7 способствовала глутатионилированию/деглутатионилированию белков, изменению их структуры и функций, что ведет к нарушению прогрессии фаз клеточного цикла, указывая на возможность регуляции пролиферации через модуляцию функциональных свойств редокс-зависимых протеинов клетки с помощью системы глутатион — глутаредоксин. Полученные результаты в дальнейшем могут быть использованы для разработки подходов таргетной терапии опухолей молочной железы. Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гуманитарные и общественные науки) в рамках научного проекта № 17-36-01029.

Злокачественные опухоли

www.malignanttumours.org

Том / Vol. 7 № 3 S 1 /2017

Malignant Tumours

www.malignanttumours.org